文摘
呼出的气息凝结(EBC)提供了一个非侵入性的方法抽样下呼吸道。收集EBC可能有用的气道评估氧化应激在吸烟者。本研究的目的是确定8 EBC, isoprostane和过氧化氢含量,此外,调查这些测量的重现性。
EBC收集的样本12名身体健康的男性吸烟者在三个时间点在1周之内。8 isoprostane和H2O2测量在nonconcentrated EBC使用免疫化学和比色测定,分别。
8 isoprostane和H2O2发现只有36和47%的所有EBC样本,分别。不可能计算受试以可靠的方式变化,因为只有三个12吸烟者表现出可检测8 isoprostane浓度在所有三次(平均4.6 pg·毫升−1;范围3.9 - -7.7 pg·毫升−1),而H2O2不能检测到所有三次的吸烟者。强化实验显示复苏8 isoprostane应承担的83.5 - -109.5%和69.9 -129.0%,H2O2在新鲜EBC样本。
得出8 isoprostane和过氧化氢水平不能反复评估从健康吸烟者呼出的气息凝结,因为他们的低浓度和/或缺乏敏感性的分析。
l·j·杜邦公司支持的博士后研究奖学金昏聩voor Wetenschappelijk Onderzoek——Vlaanderen(科学研究基金——弗兰德斯,布鲁塞尔,比利时)。
吸烟者的航空公司是暴露于高水平的氧化应激,氧化剂和自由基引起吸入香烟烟雾和激活炎症细胞产生的活性氧1,2。氧化负担吸烟者的航空公司可以使用传统的方法调查抽样肺泡液体或支气管分泌物,如痰诱导支气管镜检查和支气管肺泡灌洗。抽样这些肺分泌物,然而,入侵,这可能会影响氧化状态标记。最近,组呼出的气息凝结(EBC)已经被认为是一个简单和容易重复的过程监测气道炎症和氧化应激3。该方法需要冷却呼出的空气,从而导致凝结。这EBC包含aerosolised气道上皮衬里流体粒子和挥发性化合物。有越来越多的证据表明,呼出标记可能反映了气道粘膜液生化变化3。EBC可能的集合,因此,在确定吸烟者是有用的一个更大的患肺部疾病与吸烟有关的风险和潜在影响的调查额外的抗氧化剂。许多研究都集中在标记EBC的吸烟者的氧化过程,包括过氧化氢4- - - - - -6,8 isoprostane7、氮氧化物8- - - - - -10和nitrosothiols11。然而,它应该强调EBC结果的分析和解释并不简单。几个方法论问题采样和分析技术用于EBC需要考虑,如相关问题收集过程和氧化的标记EBC的分析。
本研究的目的是确定8 isoprostane和H2O2检测在nonconcentrated EBC从健康男性吸烟者,当测量使用免疫化学和比色测定,分别。此外,这些测量的重现性调查。
对象和方法
主题
研究人群包括12个男性吸烟者(24 - 61岁年龄段;平均数±标准差44±14岁)。所有的吸烟者被医学健康评估问卷。在研究开始之前,志愿者们完成了一个简短的问卷关于他们的吸烟习惯和测量ofweight和高度。身体质量指数为23.5±2.9公斤·m−2和累积29.8±30.9 pack-yrs香烟消费。鲁汶大学医院的伦理委员会Gasthuisberg,比利时,批准了这项协议,所有受试者参与之前给了知情同意。
呼出的气冷凝物的集合
对于每一个主题,EBC收集的样本在三个时间点1星期内(0天,3或4天,第七天)使用商用冷凝器(EcoScreen®;Erich Jaeger GmbH, Hoechberg,德国)。受试者呼吸通过喉舌和双向nonrebreathing阀、吸气和呼气空气分离,唾液被困。他们被要求在一个正常的呼吸频率,穿着noseclip,一段15分钟获得∼≥1毫升冷凝。受试者没有吸烟前2 h EBC收集和要求不改变他们的吸烟习惯在周中收集。EBC样本都是在相同的位置,对于每一个主题,在同一时间。EBC样本立即分成整除,储存在−80°C和在室温下解冻之前立即分析。
实验室分析
EBC 8 isoprostane应承担的浓度是量化使用特定的酶免疫测定(EIA)工具包(美国开曼化工、安阿伯、MI)基于竞争一个8 isoprostane /乙酰胆碱酯酶共轭有限数量的8 isoprostane-specific兔抗血清结合位点。观察到的吸光度,spectrophotometrically决定,呈负相关的免费8必经isoprostane EBC。
EBC H2O2测量colorimetrically通过辣根peroxidase-catalysed氧化tetramethylbenzidine根据描述的方法以前byGallati Pracht12。简而言之,100µL 3′, 5、5′tetramethylbenzidine应承担(溶解在0.42 M柠檬酸缓冲(pH值3.8))和10µL辣根过氧化物酶(σ化学品,圣路易斯,密苏里州,美国;52.5 U·毫升−1)反应了在室温下100µL EBC 10分钟。随后,混合物被酸化pH值1和10µL 36 M硫酸。反应产物是衡量spectrophotometrically 450海里。一个单独的标准曲线为H2O2为每一个分析了。
所有EBC样本分析一式两份,在一个运行绕过interassay变异。此外,EBC整除汇集在一个样本。Intra-assay使用合并样本含有可检测浓度变化进行了计算,分析了每次运行一式三份,8 isoprostane应承担7.5%和3.3% H2O2。
化验8 isoprostane和H2O2进行稀释和nonconcentrated EBC样本。检测下限(LOD),定义为标准曲线的浓度最低,为3.9 pg·毫升−18 isoprostane和0.31µM H2O2。浓度低于LOD指定没有检测到。
结果
8 isoprostane和H2O2浓度低于许多样品的LOD(表1所示⇓)。8量isoprostane EBC样本中检测到只有三个吸烟者在1周内所有三次(平均5.3,4.0和4.5 pg·毫升−1)。这三个吸烟者没有不同于其他的关于年龄、身体质量指数和累积香烟消费。八12吸烟者表现出8 isoprostane应承担的浓度高于3.9 pg的LOD·毫升−1至少一个测量(36%的EBC样品含有可检测8必经isoprostane)。8 isoprostane应承担这些样品的浓度范围3.9 - -10.6 pg·毫升−1。
没有一个吸烟者显示可检测浓度的H2O21周内的所有三个测量,但11 12个受试者表现出H2O2浓度高于0.31的LODµM至少一个测量(47%的EBC样品含有可检测H2O2)。H的浓度2O2在这些EBC范围0.31 - -0.49µM样品。
测量的重现性进行了计算:组内相关系数为0.33 8 isoprostane和−0.34 H2O2。然而,这些值计算从只有少数可检测浓度。
单独强化实验通过添加3.1 pg·-50毫升−1-10µM必经isoprostane或0.5 H2O2新鲜和解冻(5 h后−80°C) EBC收集从一个健康的话题。这些实验,重复进行,显示经济复苏的外生8 isoprostane应承担的新鲜样品的83.2 - -109.5%和114.5 -145.6%,解冻样本。然而,恢复体内添加H2O2范围69.9 - -129.0%的新鲜样本和甚至在解冻样品达到> 200%。
讨论
目前的报告显示,8水平isoprostane和H2O2不能反复评估在EBC从健康的吸烟者,因为他们的低浓度和/或缺乏敏感性的测定方法。
相信吸烟会导致增加的自由基和活性氧水平,而氧化状态可以监控分析EBC标记3。8高isoprostane前列腺素F2α异构体,是由花生四烯酸的自由基脂质过氧化作用,可能是一个定量的标志在活的有机体内氧化应激在吸烟者的航空公司14。Montuschi等等。78日之前调查吸烟的影响量isoprostane水平使用类似的冷凝设备(商用EcoScreen®)和免疫化学测定相同(LOD)用于本研究。他们观察到更高的平均浓度的8 isoprostane应承担的12个健康吸烟者(24.0±2.6 pg·毫升−1),以及在10健康不吸烟(10.8±0.8 pg·毫升−1),比本研究观察到(5.4±2.0 pg·毫升−1所有学科的总和)。浓度的差异吸烟者可能会由于不同的基线特征。目前的吸烟者是年轻和有一个累积香烟消费低于Montuschi的吸烟者的研究et al。7(44与60岁;29日与34 pack-yrs)。
它可能认为广泛的年龄(24 - 61岁)和累积香烟消费(3-57 pack-yrs)现在吸烟者中牵涉到对氧化应激的敏感性的变化,随后可能会影响8的水平isoprostane以EBC。然而,无论时代andcumulative香烟消费确实增加EBC 8 isoprostane浓度在先前的研究尚未解决。
在目前的研究中,吸烟者没有抽烟一段只有2 h生产EBC之前,而在其他研究8必经isoprostane EBC,吸烟者放弃吸烟≥12 h。然而,Montuschiet al。7表明,短时间内不吸烟提高呼出8 isoprostane浓度。因此,这不能解释低8 isoprostane浓度在目前的实验中发现。
8的浓度检测isoprostane发现在目前的健康的吸烟者更接近那些健康不吸烟的科目(4.5±0.5 pg·毫升−1;n = 15;八个男性;平均年龄42岁)在Carpagnano的研究et al。15使用相同的环境影响评价,也分析了装备。研究人员报道,8 isoprostane检测在EBC的所有科目。但是,图1的报告显示,四15健康受试者表现出8 isoprostane应承担的浓度低于LOD (3.9 pg·毫升−1)。这些结果和现在的发现表明更敏感比唯一商用环评工具需要化验检测8量isoprostane浓度EBC从健康(吸烟)主题以更精确的方式。此外,免疫测定需要而获得的数据通过质谱等方法更敏感。此外,特异性可用的环评工具应进一步调查。
Isoprostanes不挥发性物质,因此,它可能是预期的浓度在健康吸烟者EBC将非常低。凝析油样品没有浓缩提取或升华干燥,因为用于铀浓缩的可能性方法的样品可能会影响8 isoprostane测量不可能被排除在外。此外,以往的研究并不丰富EBC样品测量8 isoprostane浓度7。然而,在最近的一个抽象的范德梅尔先生等等。17,所有EBC样本集中使用真空离心三倍,和平均浓度5.2 pg·毫升−1在健康受试者观察。
EBC主要由水和挥发性和水溶性有机化合物,如H2O2。这些物质能够到达呼出的气息,可以很容易地发现在EBC。H的检测浓度2O2在目前的男性吸烟者的浓度范围内所有以前的观测在健康吸烟者(0.10 - -0.75µM)5。这种广泛的呼出H2O2浓度可能解释说,在某种程度上,通过不同设计的各种冷凝设备被用于EBC样本的收集或分析方法用于测量的差异H2O2。例如,Guaturaet al。18解释他们较高的H2O2(0.75µM)在健康受试者使用面罩、鼻呼吸。EBC收集最常用的设备是Teflon-lined管在冰桶,一个特别设计的双层光学玻璃容器被放置在冰或液态氮,或者double-jacketed冷却管。冷管的材料(玻璃或聚四氟乙烯),以及管的长度,对捕获的化合物可能是重要考试。本研究采用一种新的商用设备(Ecoscreen®),这是由片状电容器(铝、长度∼10厘米)和电动制冷系统。推荐使用它之前,这个设备的性能应与其他冷凝器进一步测试和比较。此外,一个标准化的方法分析EBC H2O2仍然缺乏。反应底物的选择(tetramethylbenzidinep-hydroxyphenylacetic酸或高香草酸),以及使用的新鲜与解冻EBC样本,可以解释变异的另一部分在H2O2浓度。在一项由范Beurdenet al。4、使用不同的化验报告LOD 0.02µM,低于在本研究报告(0.31µM)。这个分析是基于H2O2端依赖氧化p-hydroxyphenylacetic酸高荧光二聚体。的p-hydroxyphenylacetic酸试剂添加后30分钟内收集,样品冻结在−70°C, 2周后高度测量荧光二聚体。然而,另一项研究评估EBC H2O2报道的LOD 0.1µM van Beurden使用相同的分析方法et al。4使用19。相反,霍等等。20.和迦纳王国et al。8报道的LOD H2O20.1∼µM使用相同的分析方法研究。此外,之前的两项研究使用一个分析基于H2O2端依赖氧化高香草酸的LOD 0.1µM报道5。据不同的测量技术和钟表的H2O2在可用的研究可能会妨碍足够的这些研究结果之间的比较和说明需要标准化的EBC样品的分析。
尽管目前的研究与已发表的研究关于8 isoprostane和H的水平2O2在EBC,目前作者相信是尽一切努力避免错误在所有阶段的研究。经过15分钟的呼吸通过冷凝器,样本运输在< 5分钟−80°C冷冻和储存直到分析。所有分析后2个月内收集。
在目前的研究中,几个分析问题可能会干扰的评估8 isoprostane和H2O2EBC得到解决。所有的制造商的指导方针EIA装备之后,包括处理积极控制(最大吸光度绑定),这是在预期的范围内。试验板8 isoprostane和H2O2也读添加试剂后在不同的时间,没有观察到的差异。在另一项实验中,不同浓度的反应底物(tetramethylbenzidine)被添加到H2O2化验。这个结果和LOD的影响。最后,复苏实验(使用新鲜和解冻(5 h后−80°C)样本)也进行评估的组件是否EBC可能掩盖了检测8 isoprostane和h2O2。复苏的83.2 - -109.5%(新鲜样品)和114.5 - -145.6%(解冻样本)获得8 isoprostane。然而,恢复体内添加H2O2范围69.9 - -129.0%的新鲜样本和甚至在解冻样品达到> 200%。
由于缺乏敏感性的方法在目前的研究中,再现性不能可靠地评估。最近,两项研究中,由范Rensenet al。22和范德梅尔先生et al。17报道说,8必经isoprostane或H的水平2O2以EBC连续两天没有重现在哮喘患者或健康志愿者。他们使用了组内相关系数来评估测量的重现性,导致的价值观−0.35(哮喘)和0.08(健康)8 isoprostane和−0.14(哮喘)和−0.08(健康)H2O2。目前的研究证实了再现性差范Rensen的结果et al。22和范德梅尔先生et al。17。
总之,8 isoprostane和过氧化氢水平不能反复评估从健康吸烟者呼出的气息凝结,因为他们的低浓度在大多数呼出的气息凝结样品和/或缺乏敏感性的分析使用。为了使用这些呼出的气息凝结标记为研究目的或作为识别可能的诊断测试ofsmokers患吸烟相关肺部疾病的风险更高,更敏感的检测低浓度的检测是至关重要的。此外,不同的呼出的气息冷凝水收集装置的性能需要比较。
确认
作者要感谢志愿者的参与这项研究和b Nemery临界评定的手稿。
- 收到了2003年5月5日。
- 接受2003年8月29日。
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