文摘
常规舒喘灵使用会加剧allergen-induced气道嗜酸性粒细胞哮喘患者,但其影响气道嗜酸性粒细胞趋化因子的反应是未知的。
哮喘受试者(n = 14)与安慰剂治疗10天或舒喘灵双盲交叉研究,然后给出同等剂量的过敏原的挑战。他们的口水分析1和7 h后的面板eosinophil-related细胞因子。嗜酸性粒细胞从五个测试和测试三个对照组表达CXCL8 /白介素8 (IL)量,及其受体和响应性CCL11 / eotaxin和CXCL8 / IL 8。
痰CXCL8 /地理IL 8,但不是IL 5,应承担CCL5 /激活规范,检测T细胞表达和分泌,CCL7 /单核细胞趋化蛋白高3 CCL11 / eotaxin,集落刺激因子或肿瘤坏死因子水平,增加舒喘灵治疗(42%)。地理CXCL8 / IL 8水平与痰嗜酸性粒细胞和这些细胞的比例,但不是其他痰细胞,染色强烈CXCL8 / IL 8。测试对象的循环嗜酸性粒细胞(n = 5)表示CXCL8 / IL 8受体和高水平分泌趋化因子。中和痰CXCL8 / IL 8应承担的减少嗜酸性粒细胞趋化现象的应对这些样本19±5%。
这些数据表明,经常使用舒喘灵还可以增加气道CXCL8 /白介素8对过敏原的挑战,这CXCL8 /白介素8可能导致气道炎症反应。
这项工作是支持由萨斯喀彻温省肺脏协会和加拿大卫生研究院的研究。
吸入β2肾上腺素能受体受体激动剂(β2量受体激动剂)组成一个主要治疗过敏性哮喘患者的支气管收缩。然而,证据表明,经常使用β2受体激动剂可以减少它们的有效性1,2并导致气道高反应性的增加3- - - - - -5和嗜酸性粒细胞/柱状细胞反应4,5过敏原挑战。考虑到协会的嗜酸性粒细胞哮喘严重程度和病理6的细胞机制,可以调节这种嗜酸性粒细胞反应被质疑。
嗜酸性粒细胞表达受体对许多分子高度相关的哮喘病理生理学6。例如,CCR3受体,结合多个CC趋化因子(如。CCL11 / eotaxin6),是广泛接受为嗜酸性粒细胞反应的关键。然而,CXCL8 /白介素8 (IL)检测在过敏病变也强烈的表达7- - - - - -10和嗜酸性粒细胞反应这CXCR1 / CXCR2配体11,12。事实上,嗜酸性粒细胞减少过敏原免疫治疗后可能与减少CXCL8 / IL 8对过敏原的挑战13。
在最近的一项研究中,轻度哮喘受试者(n = 14)经常使用舒喘灵(或安慰剂)10天,哮喘恶化的反应(在一秒用力呼气量(FEV1),血清类胰蛋白酶和痰液嗜酸性粒细胞)来观察过敏原的挑战5。为了了解这背后的潜在机制嗜酸性粒细胞4,5,9个小组相关eosinophil-signalling痰细胞因子/趋化因子,之前获得这些主题5、检查,回想起来,他们的嗜酸性粒细胞的相对响应(n = 5) CXCL8 / IL 8和CCL11 / eotaxin。CXCL8 /地理IL 8的表达的痰液细胞和嗜酸性粒细胞和在多大程度上传播CXCL8 / IL 8和CCL11 / eotaxin导致他们痰嗜酸性粒细胞趋化现象的活动也被评估。
方法
研究对象
如上所述,作者曾报道基线和1》7 h FEV1价值观、肥大细胞类胰蛋白酶和痰液嗜酸性粒细胞和异染性的细胞数量在当前主题5。所有受试者20-51年岁基线FEV1预测的值≥70%,除了一个演示了气道反应与挑衅醋甲胆碱浓度导致FEV下降20%1(电脑20.2.8 mg·毫升−1(表1⇓)。所有显示特异反应性的一个或多个吸入过敏原皮试,有早期哮喘反应过敏原挑战FEV下降≥15%1。五个科目经常使用吸入糖皮质激素和持续这些相同的剂量为整个研究。使用钠cromoglycate期间每周锻炼1 - 2次,和所有但舒喘灵在过去两人使用。所有保留β2受体激动剂用于≥2周之前和期间研究(ipratropium被溴取代症状缓解,定喘乐®;Boehringer-Ingleheim有限公司、伯灵顿,加拿大)。所有受试者免费呼吸道感染或已知的过敏原暴露的持续时间和≥4周在这项研究之前,这是局限于经过季节。实验协议被人类研究机构伦理委员会批准,所有受试者签署知情同意表格之前参与这项研究。
研究设计
十四,温和,稳定,哮喘受试者参加一个双盲,安慰剂对照,交叉研究比较为期10天的治疗时间的影响舒喘灵(沙丁胺醇®;米西索加GlaxoWellcome Inc .,,加拿大)或安慰剂allergen-induced气道eosinophil-related细胞因子表达。这两种治疗方法包括随机分配舒喘灵(100µg·−1)或相同的安慰剂metered-dose吸入器,每两个泡芙,每天四次,分离时间≥7天冲刷里。每个主题收到相同剂量的过敏原后治疗,服用后12 - 15小时的最后剂量研究吸入器,其次是痰推论1和7 h以后有用。痰分析多次报道以及反映气道炎症反应明显的由支气管肺泡灌洗14,包括调节趋化因子的响应15。背景痰液样本,生成没有过敏原的挑战,也来自每个主题前1 - 5周。
方法
过敏原的挑战和痰诱导和处理
过敏原(猫上皮(10000生物活性单位·毫升−1(83000),five-grass混合花粉蛋白氮单元(PNU)·毫升−1(42000),西方杂草花粉PNU·毫升−1;格里尔实验室Inc .)、数控、美国),或爱马上皮(32000 PNU·毫升−1;西方过敏服务,里士满,公元前,加拿大)),或稀释剂气溶胶生成使用莱特nebuliser(气溶胶医疗有限公司,科尔切斯特,英国)校准到0.13毫升·分钟−1输出。痰诱导,无菌生理盐水气溶胶的3、4和5% (w / v;每个12毫升)氯化钠使用超声波nebuliser生成(输出3毫升·敏−1,Ultra-Neb 99;Devilbiss有限公司萨默塞特,美国宾夕法尼亚州)和管理通过喉舌,直到2 - 5毫升的痰已经产生。每个主题彻底冲洗他们的口腔和咽前每一轮的痰生产。所有痰样本在冰上,卷记录然后处理添加2毫升的1% (w / v)二硫苏糖醇(DTT;米西索加,西格玛化工有限公司、加拿大)在盐水中,温柔的涡流,以确保彻底的分散的标本。的痰液被标准的离心分离细胞,然后在−整除和存储85°C5。趋化性化验,整除与磷酸盐广泛渗出(PBS;pH值7.2)。痰液细胞被洗的杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)删除任何剩余德勤,然后在acid-alcohol福尔马林固定16在冰上30分钟,随后存储在70%乙醇−20°C。
细胞因子表达的评估
痰液中的目标细胞因子的水平进行评估,酶联免疫吸附试验(ELISA),而固定细胞探测CXCL8 / IL 8通过免疫组织化学方法表达。ELISA,匹配捕获和生物素化的检测抗体对和重组细胞因子激活CCL5标准/规范,检测T细胞表达和分泌(咆哮),CCL7 /单核细胞趋化蛋白(MCP)高3 CCL11 / eotaxin,基本上听不清中性粒细胞内染色,但的彩色强烈嗜酸性粒细胞趋化因子(数据没有显示)。没有染色观察细胞探测与同形像控制抗体。作为一种替代方法来确认是否嗜酸性粒细胞的受试者可以表达CXCL8 / IL 8,应承担的外周血白细胞回顾性分馏从五人,以及a / NA控制主题,和释放CXCL8 / IL 8在一夜之间文化没有额外的刺激被评估。细胞采用纯嗜酸性粒细胞占97 - 99.9%,由激光流式细胞仪一边向前散射(图3⇓),通过形态学标准彩色幻灯片。每个主题的嗜酸性粒细胞释放更多CXCL8 / IL 8比他们应承担的其他血液白细胞。综上所述,单核细胞分泌1090±175 pg·毫升−1CXCL8 / IL 8,应承担的嗜中性粒细胞分数(∼9%污染嗜酸性粒细胞)公布1814±252 pg·毫升−1CXCL8 / IL 8和嗜酸性粒细胞(纯度≥98%)9960±498 pg·毫升−1趋化因子,由ELISA。虽然这个实验没有提供洞察完整肺结构细胞的贡献(如。上皮)CXCL8 / IL 8应承担的反应,它表明,渗透嗜酸性粒细胞可能导致一个痰CXCL8 / IL 8池。
过敏性哮喘的外周血嗜酸性粒细胞主题表达CXCL8 / IL 8和CCL11 / eotaxin受体和响应chemotactically细胞因子
CXCL8 /地理IL 8的表达受体(即。CXCR1和CXCR2)在新鲜分离外周血嗜酸性粒细胞也回顾性评估从这些相同的五个科目,以及三个对照组,同时探索CCR3的细胞(即。的受体CCL5 /咆哮,CCL7 / MCP高3和CCL11 / eotaxin)表达式。FITC antimouse主要组织相容性复合体II是用作负控制抗体。的嗜酸性粒细胞哮喘主题,以及a / NA和TCL控制病人,表示CXCR1 / CXCR2、CCR3的阳性细胞比例变量(图3所示⇓和表4⇓)。na的嗜酸性粒细胞/ na捐赠基本CXCR1 CXCR2-negative但表示CCR3(表4所示⇓),而他们的中性粒细胞强烈表达CXCL8 / IL 8受体但是不能CCR3(数据没有显示)。
这些受体功能使用趋化性化验证实CXCL8 / IL 8和3 e-f CCL11 / eotaxin(无花果⇓)。每个实验对象的嗜酸性粒细胞趋化因子剂量依赖性的方式回应,CCL11 / eotaxin出现在高剂量化学引诱物更强。有最小subject-to-subject可变性的反应细胞趋化因子,证明的低方差数据(图3 e⇓)。的嗜酸性粒细胞/ NA(图3 f⇓)和TCL(数据未显示)对照组也反应强烈CXCL8 / IL 8和CCL11 / eotaxin,虽然na / na控制主体的细胞没有回应CXCL8 / IL 8,但响应CCL11应承担eotaxin(图3 f⇓)。
CXCL8 / IL 8应承担可以大大有助于整体嗜酸性粒细胞趋化现象的活动表示allergen-challenged航空,过敏,哮喘病人
这是证明免疫检测CXCL8 / IL 8出席应承担的高水平表达的痰样本,每个主题的嗜酸性粒细胞CXCR1 / CXCR2。然而,痰的受试者也含有高水平的“传统”嗜酸性粒细胞化学引诱物,CCL5 /咆哮,CCL7 / MCP的3和CCL11 / eotaxin(无花果。1⇓),所以,一个关键问题的相对重要性CXCL8 / IL 8的嗜酸性粒细胞反应。为了专门针对这个问题的嗜酸性粒细胞趋化因子水平的痰样本,化验的嗜酸性粒细胞趋化现象的活动归档salbutamol-treatment组痰液样本,纯化CXCR1 / CXCR2 CCR3-positive嗜酸性粒细胞的常见的捐赠者,a / NA控制(图。4⇓)、使用和主题的四个样本测试(图3所示⇓;口水从主题2)不再可用。作者已经证明每个主题的回应或多或少的细胞同样CXCL8 / IL 8(图3 e⇓)。的积极控制试验由水提取物lesional皮肤活检epitheliotropic TCL的病人,里面没有可辨别的CXCL8 / IL 8但应承担的高水平的CCL11 eotaxin(未发表的观察)。消极的控制样本,高渗saline-induced痰/ NA控制主题的,里面可以忽略不计CXCL8 / IL 8或CCL11应承担/ eotaxin(表2⇑)。CXCL8 / IL 8或CCL11 / eotaxin在所有的样品是使用特定的中和抗体,然后他们的剩余活动评估,相对于样品处理同形像控制抗体。
痰液样本中的每个细胞因子的水平(表2所示⇑)相关很好程度的抗体表达下调他们的嗜酸性粒细胞趋化现象的活动(r = 0.921 CXCL8 / IL 8和CCL11 / eotaxin r = 0.825)。因此,对于主题1、水平更高的痰的CCR3配体比CXCL8 / IL 8,应承担的反检测CXCL8 / IL 8应承担的抗体只温和的效果,而anti-CCL11 / eotaxin抗体,虽然还没有完全、有效(图4所示⇓)。这些实验的分析背景是每40×7±2嗜酸性粒细胞。3主题,丰富的痰CXCL8 / IL 8和低水平的CCL11 / eotaxin,相反的效果观察。主题4有微不足道的痰CXCL8 / IL 8和低水平的CCL11 / eotaxin,而主题5趋化因子和水平非常高,为主题,趋化性的数据反映了这些趋势。总的来说,CXCL8 / IL 8应承担的贡献19±5% (p < 0.01)与控制抗体治疗)的嗜酸性粒细胞趋化现象的活动这些样本,而CCL11 / eotaxin贡献46±11%的活动。/ NA控制主题的痰诱导反应和抗体治疗并不影响不显著,而anti-CCL11 / eotaxin,但不是anti-CXCL8 / IL 8,应承担治疗lesional活检提取物的TCL病人中和嗜酸性粒细胞反应样品(图。4⇓)。这些数据表明,与嗜酸性粒细胞反应CXCL8 / IL 8,应承担的比例有大量subject-to-subject可变性的痰液嗜酸性粒细胞趋化现象的活动归因于这趋化因子。然而,CXCL8的影响/ IL 8,其痰嗜酸性粒细胞趋化现象的活动(eotaxin∼< 50%)是重要的。
最后检查这些数据的相关性CXCL8 / IL 8应承担的ELISA结果,趋化性与痰化验时收获这些受试者背景评估运行对安慰剂后,舒喘灵治疗。然而,此时的股票的一些存档痰是极低的,几乎完全消失的地步,因此主题的口水是一定池(按相同比例)。尽管如此,作者只足够的口水来评估的贡献CXCL8 / IL 8的趋化现象的活动样本。安慰剂治疗的数据证实,10天后,过敏原诱导一个挑战upregulation航空(背景痰嗜酸性粒细胞趋化现象的活动的活动25±2与安慰剂痰每40×34±7细胞;p = 0.01),舒喘灵治疗导致了进一步增强此响应(43±4细胞每40×字段;p < 0.001与背景样本和p = 0.02与安慰剂样本)。Anti-CXCL8 / IL 8应承担的治疗减少了7 h应承担的趋化现象的活动背景,安慰剂和舒喘灵样品12.0±10.6 (p > 0.05), 17±7.1 (p < 0.01),和23.1±3.4% (p = 0.012),分别相对于同形像控制antibody-treated配对样本。
讨论
作者表明,经常使用舒喘灵还可以增加气道CXCL8 / IL 8的反应同样剂量的过敏原挑战温和,哮喘。而IL 5应承担的gm - csf, TNF和几个CCR3配体都强烈表达样本,对这些介质舒喘灵治疗没有明显的影响。CXCL8 / IL 8应承担的反应是唯一与嗜酸性粒细胞增加显著相关的参数对过敏原的反应发生在这些条件下的挑战4,5。它也是记录受试者的嗜酸性粒细胞coexpress CXCL8 / IL 8受体和CCR3,和同样可以基本上回复到各自的配体。最后,作者证实CXCL8 / IL 8和CCL11 / eotaxin可以大大有助于痰嗜酸性粒细胞趋化现象的活动。
从历史上看,一个角色CXCL8 / IL 8在变应性疾病一直不是很广泛的考虑,也许是因为这主要趋化因子被认为是neutrophil-specific因此多一个潜在的炎症反应的一个标志。然而,allergen-induced CXCL8 / IL 8的表达在航空公司应承担的由多个实验室报告7,19嗜酸性粒细胞,鼻之间的显著相关性,CXCL8 / IL 8水平过敏性鼻炎主题之后,而不是之前,布地奈德治疗9。嗜酸性粒细胞已报告,别人CXCL8 / IL 8的响应11,12,20.,虽然这已经受到质疑,归因于一个人工产物中性粒细胞污染21。然而,“没有”嗜酸性粒细胞,孤立的负选择mac人口纯度≥97%,,通过两个独立的方式,证实CXCR1 / CXCR2+和chemotaxis-responder细胞化验明确嗜酸性粒细胞。因此,这些数据再次确认的嗜酸性粒细胞过敏性主题表达功能齐全的CXCL8 / IL 8受体。
如上所述,CXCL8 / IL 8在过敏反应强烈的表达7,12,19,但中性粒细胞并不广泛报道是不可或缺的过敏性疾病。这些细胞渗透allergen-challenged哮喘患者的肺组织22;4小时内的节段性过敏原挑战人类主题包含中性粒细胞的航空公司7,但它不是直到∼18 h post-challenge水平明显升高19。检测到了大量中性粒细胞哮喘受试者的口水,但没有增加(高于背景水平)观察与过敏原相关的挑战。乍一看,观察CXCL8 / IL 8 upregulation不应承担相应增加中性粒细胞水平可能似乎不一致。虽然很可能上皮和其他结构的细胞会表达一些CXCL8 / IL 823它已经表明,嗜酸性粒细胞或其分泌的产品(如。主要基本蛋白质和IL-17)也强烈的诱导表达CXCL8 / IL 8的内皮细胞24或成纤维细胞25,26。因此,如果airway-infiltrating嗜酸性粒细胞产品提供重要的是总气道CXCL8 / IL 8应承担的反应,一个CXCL8 / IL 8的大部分还是依赖中性粒细胞反应可能会落后于嗜酸性粒细胞反应几个小时。中性粒细胞是主要的细胞渗透到皮肤被动过敏反应病变的老鼠;这个反应需要4 - 6 h来培养27,28。很可能,肥大细胞释放CXCL8 / IL 829日在这些反应或肥大细胞产品,如肿瘤坏死因子30.或类胰蛋白酶31日,引起当地的分泌趋化因子包含neutrophil-specific图案谷氨酸acid-lysine-arginine, cysteine-alternate氨基acid-cysteine (ELR-CXC;如。CXCL8 / IL 8)内皮和上皮细胞。事实上,allergen-induced肥大细胞类胰蛋白酶水平受试者的血清舒喘灵治疗后显著升高5。在老鼠和人类活跃的过敏反应,一个循环嗜酸性粒细胞常常存在,这样CXCL8 /地理IL 8的效果可能容易被高层蒙面的替代化学引诱物的表达,比如CCR3配体。这一事实CXCL8 / IL 8应承担的反应表面明显的嗜酸性粒细胞过敏性鼻炎只有布地奈德治疗后9证实这个假说。
CXCL8 / IL 8应承担的贡献不到总数的一半嗜酸性粒细胞趋化现象的活动由eotaxin口水。然而,它必须记住ELR-CXC趋化因子通常多余地表达32,每个chemotactically活跃细胞表达CXCR1或CXCR2 (如。嗜酸性粒细胞在本报告)。事实上,证据从目前作者的研究,结合CXCR1 / CXCR2拮抗剂,最近由这组33,34表明,CXCR1 / CXCR2配体贡献∼30%的嗜酸性粒细胞趋化现象的活动出现在本研究中使用的痰样本(未公开的数据)。当然这仍然留下化学引诱物如CCR3配体可能主要影响的反应,但当比较的情况下,这些CCR3的水平配体本质上是等价的,发生的7 h安慰剂和舒喘灵痰液样本,额外的影响,互生,趋化因子如CXCL8 / IL 8将变得更加相关。似乎逻辑表明之间的相关性CXCL8 / IL 8水平和嗜酸性粒细胞数量将在某种程度上相关的嗜酸性粒细胞组成这个趋化因子的来源,但CXCL8 / IL 8应承担是否检测到免费痰是来自这些细胞或从其他来源(如。上皮细胞)是开放的投机。自嗜酸性粒细胞水平提高后的口水舒喘灵治疗,它是合理的建议的总池CXCL8 / IL 8潜在可用的设备(即。eosinophil-associated和免费的)将会远远大于7 h应承担的痰样本中检测到测试。
多个其他研究解决接触β的影响2细胞因子受体激动剂,其生产的孤立的细胞或细胞系在体外。例如,添加舒喘灵文化刺激单核细胞35或中性粒细胞36地理CXCL8 / IL 8的分泌减少,尽管它增加或不影响表达的趋化因子通过改变了上皮细胞23或气管平滑肌细胞37,分别。一些β2量受体激动剂可以通过人类肥大细胞表达下调表达38或嗜酸性粒细胞39肿瘤坏死因子或过氧化物,分别和一个剂量的氟替卡松加沙美特罗可以抑制allergen-induced鼻粘膜血管通透性的改变,但不降低肥大细胞激活或细胞涌入在活的有机体内40。相反,长期在体外暴露的嗜酸性粒细胞β2受体激动剂增加细胞超氧化物释放39。因此,舒喘灵对细胞反应的影响与系统差异显著。作者评估其影响在活的有机体内在临床实验的条件下,发现痰嗜酸性粒细胞,最有可能一些肺结构细胞群23,37,41,强烈表达了CXCL8 / IL 8。与结构细胞,嗜酸性粒细胞会渗透到肺部的过敏原的挑战516 - 20 h后的最后剂量舒喘灵,所以他们可能没有被直接暴露于大量的受体激动剂浓度。
本研究设计并没有检验CXCL8 /白介素8应承担的由居民nonairway细胞表达,作者不能得出任何确切的结论他们潜在的贡献CXCL8 /白介素8池中应承担的口水。然而,证明定期舒喘灵治疗增加肺嗜酸性粒细胞和异染性的细胞涌入,肥大细胞类胰蛋白酶释放5然后CXCL8 /白介素8生产表明,急性在体外挑战实验可能不充分模型经常使用这个代理的复杂性在活的有机体内。
- 收到了2002年4月15日。
- 接受2003年2月28日。
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