抽象的
与严重哮喘相关的细胞机制仍然知之甚少。本研究调查了严重哮喘患者糖皮质激素受体(GR)改变与持续口服糖皮质激素治疗需求之间的关系。
GR结合亲和力(Kd)评估从10个正常受试者获得的外周血单核细胞(PBM)中的受体数(N),10个未处理的,间歇性哮喘和10SEVERE哮喘学。此外,地塞米松以抑制在激活的抑制的能力,表达和分泌(Rantes)释放的T细胞通过这些细胞在体外调查了。使用a在PBM中研究了GR结合特征3.H地塞米松配体结合分析和Scatchard分析。采用酶联免疫吸附法在PBM上清液中测定RANTES释放24小时。
K值无显著差异d在三组患者之间发现了n。地塞米松在体外均能抑制RANTES释放(平均值±sem),间歇、未治疗哮喘患者的浓度/反应曲线相同(0.47±0.22与1.64±0.31 ng·mL−1)和严重的哮喘(1.49±0.64与2.59±0.77 ng·毫升−1).
本研究显示,尽管长期口服糖皮质激素治疗,但严重哮喘患者糖皮质激素受体结合特征未见异常,且糖皮质激素受体具有功能在体外.
这项研究得到了法国楚蒙彼利埃的方向德拉·赫尔特尔(Chu Montpellier)的支持。
糖皮质激素是最有效的抗炎药物,广泛用于治疗哮喘1.虽然糖皮质激素疗法有效地控制了大多数患者的哮喘,但有些哮喘患者没有反应,被称为“类固醇抵抗”。2,3..此外,哮喘的另一个亚群被称为“糖皮质激素依赖”或严重,因为他们需要长期的全身糖皮质激素来达到充分的控制4.他们不同于激素抵抗患者,因为他们可以在短期口服糖皮质激素后改善肺功能。
已经提出了几种假说来解释严重哮喘患者慢性口服糖皮质激素的需求,但这一过程仍然知之甚少。一种可能与糖皮质激素受体(GR)结合特征的潜在异常有关。一些研究表明,在严重哮喘患者中,这些参数是不正常的。外周血单个核细胞(PBMC)中gr结合特征的改变已被证实。5,6,但尚未对严重哮喘患者的分离血液单核细胞进行研究。
在本研究中,使用全细胞竞争性结合试验研究了GR与分离外周血单核细胞(PBM)的结合特征。这项研究是由3.与正常科目和间歇性 - 未经处理的哮喘患者的H个地塞米松与严重的哮喘有关。这在体外通过评价释放对来自这些相同患者的地塞米松的释放和分泌的T细胞(rytes分泌(Rantes)的释放来研究糖皮质激素反应。
主题和方法
主题
根据美国胸科协会标准选择20例哮喘患者7.根据哮喘指南的全球倡议评估临床严重程度8.10名间歇性哮喘患者,服用β2包括所需的角度。它们与10名受试者进行比较,具有严重的哮喘称为糖皮质激素依赖性9,10.他们定期接受强的松、吸入氟替卡松、长效β治疗2- 一个角度和短起β2视角根据需要。用竞争放射免疫测量测量血浆皮质醇。采取的特性被诊断为至少一个阳性皮肤刺(Weal> 3mm),从蒙彼利埃地区(法国)共同过敏原。
最后选取10名正常受试者作为对照组。所有患者均无支气管或呼吸道疾病和/或过敏症状。所有人的甲胆碱激发试验和皮肤点刺试验均为阴性。
参与这项研究的受试者中没有一个是吸烟者。所有受试者签署知情同意书,本研究经本研究所伦理委员会批准。
全细胞结合测定
如前所述,通过对等渗Percoll解决方案(Pharmacia,St.Quentin En Yvelines,France)离心,从血液中分离出PBM11.使用台盼蓝排除测试确定细胞活力和数量。细胞活力总是> 95%。获得的PBM的纯度> 95%。隔离后,a3.如前所述,使用地塞米松放射性配体结合分析和斯卡查德分析12以确定PBM的gr结合参数。洗三次30分钟后,清除内源性皮质醇,PBM (3×106细胞·ml.−1)暴露于氚化的地塞米松(Amersham Life Science,Buckinghamshire,UK)的浓度增加了7.5-80.0nm,在存在或没有1,000倍过量的未标记的地塞米松(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)的情况下。在β光谱仪(Wallac,Turku,Finland)中的液体闪烁小瓶中计数放射性。计算特异性结合作为在细胞沉淀中残留在细胞沉淀中的术语的差异和每个地塞米松浓度下的非特异性结合的放射性。具体的数量3.H每个细胞(n)和平衡解离常数的H个地塞米松结合位点(kd)根据Scatchard计算13或采用计算机辅助的迭代非线性回归曲线拟合程序进行分析。
调节t细胞的活化、表达和分泌
新鲜分离的PBM以106细胞·ml.−1在含有10%热灭活的胎牛血清的培养基中,100 u·mL−1青霉素、100µg·毫升−1链霉素和2毫米谷氨酰胺。在0.1µM地塞米松或无地塞米松条件下培养细胞24 h。
测定地塞米松对PBM释放RANTES的浓度/反应曲线及50%抑菌浓度(IC50.)用10℃孵育地塞米松,将PBM孵育24小时,浓度为10次−5-10年-14M。地塞米松集成电路50.从对应50% RANTES抑制的横坐标上的交叉点确定。
根据制造商的建议(R&D Systems,英国R&D Systems),通过定量夹心酶免疫测定在上清液中测量rantes。对咆哮的粘附性为8 pg·ml−1.通过尖峰实验测量的rantes回收率为97%。
统计分析
人口统计学特性和rantes释放被表示为平均值±SEM,GR数据表示为中位数(范围)。进行非参数Kruskal-Wallis对方差试验的分析,用于比较三组受试者。配对的Wilcoxon试验用于分析地塞米松对rantes释放的影响。配对T检验用于分析rantes释放的地塞米松浓度/响应曲线。使用Spearman等级测试分析相关性。
结果
表1中显示了正常受试者,间歇性,未经治疗的哮喘和严重哮喘的人口特征⇓.
Scatchard13分析显示了来自三组受试者的PBM中的单一地塞米松结合位点。PBM GR亲和力和组之间的GR数字没有显着差异(图1⇓).GR亲和力与密度、性别、年龄、1秒用力呼气量和血浆皮质醇水平无相关性。
图2显示了地塞米松对严重和间歇性、未经治疗的哮喘患者PBM释放RANTES的影响⇓.在基线时,与间歇哮喘患者相比,严重哮喘患者的PBM倾向于释放更多的RANTES,但统计分析没有显示任何差异。与基础值相比,地塞米松显著抑制间歇性RANTES释放(0.47±0.22)与1.64±0.31 ng·mL−1, p<0.05)和重度(1.49±0.64)与2.59±0.77 ng·毫升−1哮喘病患者,p < 0.01)。间歇哮喘患者PBM获得的地塞米松浓度/反应曲线与严重哮喘患者相似,RANTES抑制最大为10−6M(分别为61和62%的RANTES抑制)。地塞米松IC50.在间歇性和严重的哮喘中相似(0.3×10−7和0.5×10−7M,分别)。
讨论
在本研究中,在比较严重哮喘、间歇性哮喘、未治疗哮喘和正常受试者的PBM时,未发现GR结合亲和力和GR密度的差异。作者已经证明糖皮质激素反应是有效的,因为添加地塞米松仍然能够抑制PBM释放RANTES在体外在两组患者中。此外,地塞米松IC50.PBM发布的RANTES在间歇性和严重哮喘患者中相似。
最近的一项研究表明,严重哮喘患者PBMC中gr结合亲和力降低5,6而在本研究中,作者没有注意到同一组患者分离的血液单核细胞中有任何gr结合异常。目前的结果与类固醇抵抗性哮喘的结果一致。的确,莱恩和李14没有显示出抗类固醇哮喘的血液单核细胞中的任何GR结合异常,而同一患者的T淋巴细胞呈现了每种细胞的减少的GR结合亲和力和增加的GR数15,16.严重哮喘中的持续性气道炎症可能与PBMC gr结合亲和力的改变有关,如类固醇抵抗性哮喘中所描述的。事实上,已经描述了gr结合亲和力的减弱在体外当来自正常供体的PBMC与白细胞介素(IL)-2和-4一起温育时15.这些结果仅限于t细胞,在非t细胞中没有发现gr结合亲和力的变化15.shet al。16观察到具有每种细胞显着减少的遗传性的类固醇抗性哮喘患者。这结果有关非T细胞。这些观察结果表明,在严重的哮喘中观察到的糖皮质激素的反应不良,包括类固醇和严重哮喘,可以部分地解释血液T淋巴细胞中的降低的GR结合亲和力。
严重哮喘的主要特征之一是高水平炎症的杂志9,17,18.在使用地塞米松对Rantes释放的效果研究糖皮质激素响应时,末端观察到显着咆哮抑制。此外,使用浓度/响应实验,他们表明,来自严重哮喘的PBM对抑制咆哮的辐射的地塞米松治疗比来自间歇性哮喘学的爆发性同样敏感。该结果符合先前描述的IL-8和粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子的那些9这表明,离体,严重哮喘患者细胞通过抑制炎症细胞因子和趋化因子对糖皮质激素敏感。
综上所述,重症哮喘患者外周血单核细胞中糖皮质激素受体的密度和亲和力与间歇性哮喘患者和正常受试者的水平相似,与糖皮质激素反应无关体内.此外,作者已经证明存在糖皮质激素受体功能在体外.这还表明,哮喘的严重程度和对口腔糖皮质激素的连续要求不被血单核细胞中潜在的糖皮质激素受体结合异常介导的。
- 收到了2002年7月8日。
- 接受2003年2月6日。
- ©ers Journals Ltd