文摘
脆性组氨酸三(FHIT)是一种肿瘤抑制基因,改变在多种上皮肿瘤,包括肺癌。生化和功能tumourigenicity尚未理解的途径。它在肿瘤扩散是特别有争议的角色。本研究的目的是在nonsmall关联FHIT基因蛋白的表达与肿瘤增殖细胞性肺癌(NSCLC)估计ki - 67抗原和p53,抑制基因。
FHIT基因,ki - 67和p53表达通过免疫组织化学方法对119年切除的非小细胞肺癌。
总之,58肿瘤(< 10%)FHIT基因表达阴性。阳性细胞表达在肿瘤中值为15%,相比之下,100%在正常肺组织匹配。正常组织中的表达的只有19例。FHIT基因表达显著低于鳞状细胞癌(SCC)(5%)比腺癌(ADC) (64%)。ki - 67表达的中位数为20%和69%的肿瘤是阳性(表达式> 10%)。ki - 67表达明显高于鳞状细胞癌(33.3%)比在ADC (10%)。FHIT基因蛋白的损失并不是与p53的表达(中位数:7.5%,58%的阳性肿瘤阳性细胞的10%)的截止或ki - 67。但是标记细胞p53和ki - 67的比例显著相关。
结果表明,脆性组氨酸三,tumourigenesis独立于p53通路和tumoural增殖,先前报道在体外。
本研究由La Vesale基础。马丁和一个。P Meert接到全国昏聩的奖学金任职(FNRS) Televie布鲁塞尔(格兰特n°7.4512.98和n°3.4579.02)。
脆性组氨酸三(FHIT)是一个模肿瘤抑制基因包括最脆弱的人类基因组,FRA3B。FHIT基因位于染色体的短臂上。3,在轨迹3 p14.2是同源基因家族的特点是组氨酸三和弦。这个基因的异常是最常见的基因改变发生在人类癌症。变更的FHIT基因转录、失去heterozygocity FHIT基因的删除和FHIT基因蛋白损失发生在多种上皮肿瘤包括肺癌1,头部和颈部肿瘤1,2、食管、胃和结肠癌3胰脏癌4、乳腺癌5颈,6和子宫内膜7癌、肾癌8、膀胱肿瘤9和肝细胞癌10。
FHIT基因在肺癌,损失已经记录在80 - 40 - 100%的小细胞肺癌和nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)的80%。减少FHIT基因表达的更重要的是在鳞状细胞癌(SCC)在腺癌(ADC)和吸烟者比非吸烟者1。FHIT基因似乎并没有损失与肺癌的预后和已经发生在肿瘤出现前的病变1,11,12。
FHIT基因的生化和功能通路tumourigenicity还不理解。FHIT基因是一个diadenosine三磷酸水解酶(Ap3A),但这种酶在抑制肿瘤的作用还不清楚。最近的一些试验表明,FHIT基因在细胞凋亡中发挥作用,但这可能不是它唯一的生物功能。FHIT基因蛋白内在细胞增殖的作用仍然是特别有争议的。在体外,FHIT基因表达似乎并没有改变细胞生长13,14,但这些试验是不确定的,因为FHIT-expressing克隆被选为本构FHIT基因的表达。相比之下,在活的有机体内研究在老鼠身上进行14表明,FHIT基因表达强烈影响tumoural细胞生长的能力。基于这些考虑,本研究使用免疫组织化学进行关联,FHIT蛋白表达,在一系列切除NSCLC tumoural增殖指数(ki - 67估计表达式)。FHIT基因表达也与病人特点和另一个肿瘤抑制基因p53。
材料和方法
组织标本
侵袭性非小细胞肺癌(n = 119)是由楔形切除,切除受累肺叶或肺切除术手术的部门,圣彼得医院,1993年1月- 2000年7月。正常肺组织匹配也被评估。
免疫组织化学研究
抗体
FHIT基因的14,15兔多克隆抗体anti-GST-FHIT(稀释1在25个,最后滴定40µg·毫升−1ZR44;酶、旧金山、钙、美国),胞质染色,使用。肿瘤扩散研究小鼠单克隆抗体(克隆MIB 1)应承担的ki - 67抗原16对应于1002个基点,人工重组肽ki - 67互补脱氧核糖核酸(互补)片段(稀释1在50个,最后滴定µg·1毫升−1Immunotech马赛,法国)。p53表达评估小鼠单克隆抗体,女士186 R717,抑制蛋白质Ab 5(克隆做检测7)(1.9稀释1在50个,最后滴定µg·毫升−1美国CA, Neomarkers联盟城市)。ki - 67和p53染色都不清楚。
染色
手术切除后,所有的组织都是中性缓冲福尔马林固定在10%,在嵌入式的石蜡。免疫组织化学显示执行标准streptavidin-biotin-peroxidase复杂18。从石蜡包埋组织部分5µm-thickness被削减,deparaffinised二甲苯和水化乙醇。幻灯片在柠檬酸缓冲提交抗原检索,0.01米pH值6.0,包含5分钟三个时期的微波治疗650 W。二次冷却后在室温20分钟,幻灯片是冲洗两次tris-hydroxymethyl-amino-methane盐酸缓冲(Tris-HCl 0.05米,氯化钠0.09%,pH值7.6,Tris-HCl缓冲区)10分钟。以下步骤都跟着一节系统自动在37°C(美国亚利桑那州图森市Ventana医疗系统)。内源性过氧化物酶是淬火与过氧化氢4分钟。30分钟的主要抗体沉积和孵化。FHIT基因之间的复合物,p53蛋白质或ki - 67和各自的抗体固定与戊二醛和0.9%氯化钠。二级生物素化的抗体是8分钟孵化。幻灯片被染色使用diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)检测设备(Ventana医疗系统),与苏木精复染色和permount安装。
负控制三个抗体是由省略主要抗体和替代正常老鼠(p53和ki - 67)和兔(FHIT)为主要的抗体免疫球蛋白。积极的控制使用一个内部控制,FHIT基因与正常肺上皮细胞,p53和ki - 67,从乳房肿瘤众所周知的外部控制每个抗体阳性。
统计分析
与非参数统计分析进行测试,因为FHIT基因的分布,ki - 67和p53表达非正态。连续和叉状分枝的变量之间的相关性测量使用Mann-Whitney U量测试。叉状分枝的变量之间的比较进行了使用校正卡方测试。生物变量之间的相关性,所有视为连续为了避免主观选择的问题水平的积极性,由斯皮尔曼等级相关系数来评估。它的重要性被测试评估一个平等的零假设为零的系数。中位数的值分布的生物变量根据分期相比,性别、年龄、烟草或组织学,Mann-Whitney U测试分成两个的变量,或利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验分类变量。生存是测量从手术的日期。kaplan meier生存分布估计的方法。生存比较是由两面log-rank测试。统计学意义p < 0.05的标准。
结果
病人的人口由97男性22(82%)和女性(18%),平均年龄63岁(范围27 - 86岁)。组织学,据《1998年世界卫生组织分类2352岁的ADC在鳞状细胞癌在59岁adenosquamous两和未分化细胞癌大细胞癌在6。17个病人是IA期疾病(14%),52阶段IB(44%)、四个阶段活动花絮(3%),28 IIB阶段(24%),10个阶段iii a(8%)、六个阶段希望(5%)和两个四期(2%,由于存在两个相同的肺肿瘤),根据1997年国际分期系统24。有40主动吸烟者(34%)、60前吸烟者(50%)和五个非吸烟者(4%)。信息被丢失在14个(12%)。吸烟年龄13 - 140岁之间packs-yr 48 packs-yr的中位数。
FHIT基因蛋白表达的中位数为15%(范围0 - 100%)在非小细胞肺癌相比,100%在正常肺组织匹配(无花果。1⇓,d)。在肿瘤中,58例(48.7%)呈阴性的FHIT基因蛋白和61例(51.3%)阳性。只有19个(16%)的样品显示表达式的正常组织。一百人(84%)从而减少或负FHIT基因表达。FHIT基因蛋白的损失没有明显与年龄、性别、阶段或烟草(表1⇓)。表达式(图。1⇓,e, f, g, h)显著降低(p < 0.001)在鳞状细胞癌(中位数:5%,范围0 - 100%)比在ADC(中位数:64%,范围0 - 100%)。ki - 67表达的中位数在非小细胞肺癌(无花果。1⇓a、b) 20%(范围0 - 92%),根据年龄没有明显不同,性别、阶段或烟草,但高(p < 0.001)鳞状细胞癌(33.3%,范围0 - 90%)比ADC(10%,范围0 - 92%)。使用截止的10%,69%的肿瘤是阳性ki - 67。中p53的表达在肿瘤(图1 c⇓)为7.5%(范围0 - 100%),没有与任何病人的特点。p53,肿瘤在48%的情况下是积极的。
如果变量是连续的,FHIT基因表达(表2⇓)不是与ki - 67(全球和根据组织学)或p53表达。然而,p53表达与ki - 67的表达显著相关(r = 0.32, p = 0.0005)。要是p53被认为是一个叉状分枝的变量,得到相同的结果,显示FHIT基因和p53表达无显著关联(p = 0.12, Mann-Whitney U检测测试)但p53和ki - 67之间的显著相关性(p < 0.0001)。如果FHIT基因和p53是分成两个的变量,如果FHIT基因根据积极评价与-(截止10%),根据强与减少正常组织相比(截止90%),之间没有显著相关性FHIT基因p53,地理和p值分别为0.07和0.47。如果FHIT基因p53和ki - 67都视为叉状分枝的变量,也没有FHIT基因表达和ki - 67之间显著相关(p = 0.39, p = 0.70,分别截止FHIT基因的10%和90%),但仍有p53和ki - 67表达式之间的显著相关性(p < 0.001)。
随访中值为28个月(范围0.3 - -109)。119例患者中,51当时死的分析。在1和3年存活率是80%(95%可信区间(CI) 72 - 88%)和59%(95%可信区间49 - 69%),分别为。生存中值为53个月。无显著差异的生存分布根据FHIT基因表达(图2所示⇓)被观察到。有24和27死正面和负面的肿瘤患者,分别为FHIT基因表达分析的时候。
讨论
从目前的研究结果证实FHIT基因蛋白的表达在肺癌比例类似的观察报告1,11,12。这也证实了一个更高的FHIT基因在鳞状细胞癌和腺癌的损失1,11。此外,ki - 67的表达明显不同根据组织学,先前报道25,26。之间没有相关性观察FHIT基因表达在NSCLC肿瘤增殖指数(ki - 67)估计表达式,也与p53表达,尽管p53与ki - 67表达显著相关。这些结果都是一样的不考虑的方法用于评估不同标记的表达(叉状分枝的变量或连续变量)显示,没有偏见由于截止的选择。这表明缺乏FHIT基因与细胞增殖的干涉,正如前面提出的在体外研究13,14,FHIT基因的生物学通路tumourigenesis p53肿瘤的扩散和独立的。一个潜在的偏见还是要考虑:ki - 67估计测量细胞增殖指数,但这个指数并不是唯一的参数确定肿瘤扩散,因为时间的细胞周期和细胞死亡率是肿瘤生长的其他重要因素27。ki - 67只评估内在细胞增殖,而不是其他两个因素确定肿瘤扩散。此外,根据烟草消费差异没有证明,虽然不吸烟者的样本太小(五个病人)是决定性的。在生存方面,初步分析没有发现任何显著性差异,但更长的随访时间导致更高的事件数量需要执行一个明确的分析或一个更大的样本量。
免疫组织化学的选择(包含IHC)评估FHIT基因的表达是基于以前的出版物15,27,28表明这种方法是最好的方法来评估FHIT基因参与临床水平相比因其灵敏度高、重现性好或逆转录酶聚合酶链反应和免疫印迹分析。ki - 67,克隆MIB检测1被选为抗体估计扩散指数以来,反对其他因素检测ki - 67,它可以用于石蜡包埋组织27。
如果认为FHIT基因不会干扰tumoural增殖,而其他生物通路将可能因为这种蛋白质?Ap3A水解酶活动从未前所述抑制肿瘤。在活的有机体内FHIT基因的表达,抑制tumourigenicity裸体小鼠的细胞系转染14。的能力为肿瘤抑制分裂Ap3A不是必需的14,但绑定Ap3A调节活动的FHIT基因和肿瘤抑制FHIT-Ap3A复杂可以发送信号。有趣的是,Ap3A在培养细胞的细胞压力积累29日,30.。FHIT基因是一个非常早期的损失事件在不同的肿瘤,包括支气管肿瘤出现前的病变1、乳腺增生31日、口腔发育异常的病变32和子宫内膜增生7。Conversley, FHIT基因似乎并没有在几个试验与预后相关1,11,12。最后这两个点建议早期FHIT基因在癌形成的作用,tumourigenic启动的过程而非侵袭性和转移性疾病的进展。
一个proapoptotic FHIT基因最近报道的函数在体外33- - - - - -35和在活的有机体内33实验。有趣的是,细胞凋亡与减少自由Ap3A人类培养细胞水平19,36建议一个可能的FHIT基因参与通过绑定形式与Ap3A诱导细胞凋亡。进一步的调查需要更好的理解这些潜在途径。
总之,本研究的数据表明,脆性组氨酸三元组的途径似乎抑制肿瘤细胞增殖和独立的p53途径不同。这些结果需要进一步分析确认,如细胞循环在脆性组氨酸三re-expressing细胞。脆性组氨酸三元组的角色在癌发生的起始,也许在诱导细胞凋亡的程度,应该进行进一步的研究。常见的影响在大多数上皮肿瘤和改变tumourigenesis建议早期阶段的一个重要的角色在癌症生物学脆性组氨酸三元组。
确认
作者要感谢他们的统计学家,m . Paesmans(数据中心,朱尔茨博尔代研究所,布鲁塞尔,比利时)。
- 收到了2002年10月2日。
- 接受2003年1月10日。
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