抽象的gydF4y2Ba
本研究的目的是揭示小细胞肺癌(SCLC)患者血清中的抗肿瘤抗体。gydF4y2Ba
以SCLC细胞全提取物为抗原源,采用免疫印迹法检测SCLC及其他肿瘤患者血清中的抗体。还分析了在切尔诺贝利核电站事故后果清理期间受到辐射的各种肺部疾病患者(肺癌高危人群)的血清。gydF4y2Ba
目前的作者发现SCLC血清中含有一组抗肿瘤抗体,这种抗体在不同于SCLC的癌症患者血清中很少被检测到,在健康人的血清中也很少(如果有的话)存在。该模式的灵敏度和特异性分别为80%和91%。在肺癌高危人群中,抗体频率略低于SCLC血清中相应值,但明显高于健康血清。gydF4y2Ba
本研究的发现为上述抗肿瘤抗体的临床应用奠定了基础。gydF4y2Ba
这项工作得到了路德维希癌症研究所和俄罗斯基础研究基金会(N°00-04-48332)的资助。gydF4y2Ba
针对肿瘤抗原的血清抗体被认为是癌症早期诊断的有希望的工具。因此,癌症相关的神经综合征,被认为被肿瘤表达的抗原植物抗原的抗体引起,通常在癌症诊断之前出现几个月甚至几年,有时肿瘤太小而无法通过通常的诊断技术检测gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
迄今为止,许多研究表明,存在于正常组织或肿瘤中的抗原可以通过包括癌症在内的各种疾病患者的血清显示出来。第一个例子是20世纪80年代发表的使用视网膜病变患者血清的著作gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba或平原背根神经病变gydF4y2Ba5gydF4y2Ba与小细胞肺癌(SCLC)相关联,以检测SCLC和视网膜内瘤之间共同的抗原,分别是视网膜或脑皮质的神经元。通过重组表达克隆的抗原血清学鉴定的许多使用方法也采用血清抗体来鉴定肿瘤抗原gydF4y2Ba6gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
在一系列的研究中,提出了另一种方法来检测癌症患者血清中相应的抗体。例如,针对副肿瘤抗原Hu的抗体gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba, Yo和RigydF4y2Ba9gydF4y2Ba, recoveringydF4y2Ba10gydF4y2Ba,用肿瘤患者血清中相应抗原检测。在本研究中,SCLC患者的血清抗肿瘤抗体(ATA)是通过整个SCLC细胞提取物而不是以往研究中使用的已知的特异性抗原来揭示的gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.使用这种提取物,目前的作者还筛查了不同于SCLC的癌症患者和在切尔诺贝利核电站事故后果清理期间受到辐射的各种肺部疾病患者的血清。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
血清gydF4y2Ba
1999-2001年期间,在莫斯科N.N. Blokhin癌症研究中心和肺科研究所的诊所收集了各种癌症患者的血清。下面的癌症患者治疗前调查:SCLC(52男八女),nonsmall细胞肺癌(30男七女),结肠癌(15男10女),甲状腺癌(女)25日,乳腺癌女性(30),子宫内膜癌(女)25日,宫颈癌(女)25日,卵巢癌女性(25)。根据体格检查和患者病史,所有癌症患者均未出现副肿瘤综合征征象。在莫斯科肺科研究所收集了36名在切尔诺贝利核电站事故后果清理期间受到辐射的各种肺部疾病患者(男性)的血清。后一组患者在1986-1987年切尔诺贝利核电站事故后在该地区工作了2-4个月。在切尔诺贝利工作之前,这些病人都没有任何慢性呼吸道疾病。以115名健康人群(男女)的血清为阴性对照。从全血中制备血清,在−70°C保存。gydF4y2Ba
癌症细胞系gydF4y2Ba
细胞:美国国家癌症研究所(NCI)的SCLC细胞-N417、NCI- h69和NCI- h82原产自美国型培养标本;Sp 20(鼠骨髓瘤),H33(人肝癌)和K562(人白血病)细胞,来自G.I. Abelev实验室,癌变研究所,N.N. Blokhin癌症研究中心,莫斯科,在Roswell Park纪念研究所1640培养基中培养。(俄罗斯)在37°C、7.5%二氧化碳的大气中添加10%胎牛血清。收集细胞,用20 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)洗涤3次,离心3万倍gydF4y2BaggydF4y2Ba, 15分钟)。获得的颗粒用10 mM的Tris-HCl (pH 7.2)提取,该Tris-HCl含有1 mM二硫treitol和蛋白酶抑制剂。细胞每周传代两次。gydF4y2Ba
西方墨点法gydF4y2Ba
在室温下对作为抗原来源的各种癌细胞提取物(见上节)进行Western blot分析,12%凝胶中进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳;每个跑道施用0.05 mg总蛋白。凝胶板在pH 8.3的tris -甘氨酸-甲醇缓冲液中电转移到hybonding - c Extra硝化纤维素膜(Amersham Pharmacia Biotech,乌普萨拉,瑞典)。首先将膜与10% (w/v)脱水奶粉在20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中孵育(1.5 h,室温),其中包含500 mM NaCl, 0.05% TWEEN-20和1 mM CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(缓冲液A),使非特异性结合位点饱和。然后膜在室温下孵化了血清(1:20的稀释缓冲)12 h,冲洗三次(10分钟)和缓冲,孵化与羊反人类的免疫球蛋白G过氧化物酶共轭(Amersham法玛西亚生物技术)在1:50 0的稀释缓冲为1.5 h,再用50 mM的Tris-HCl (pH 7.6)冲洗,最后在含有10 mM的3,3 ' -二氨基联苯胺(底物)和0.01%的过氧化氢的相同缓冲液中孵育。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
组间比较采用卡方检验。p值<0.05被认为是显著的。敏感性和特异性用以下公式表示:gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba结果显示,整个SCLC细胞提取物(NCI-N417)含有许多蛋白质(track E)。一些蛋白质与SCLC患者血清发生交叉反应,显示15种典型的条带模式(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba跟踪3 - 17)。这种提取物通常不会与健康人的血清发生交叉反应(例如,track 1),尽管在某些情况下,具有明显分子量的条带(MgydF4y2BargydF4y2Ba)可以存在高于45 kd(轨道2)。在没有SCLC血清(未示出)的情况下未发现交叉反应。人们还可以看出,抗P40-P42,最常见的ATA,主要在九个不同的上下文中检测到(见图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba跟踪3-11)。Anti-p26和anti-p30通常在7个(音轨5、7和12-16)和5个(音轨4、7、9、14和17)不同的环境中显示。此外,抗p36(曲目6、11、13、14和15)、抗p28(曲目7、8、9、11和16)和抗p14(曲目8、10、15和16)也出现在SCLC血清中。在某些情况下,提取的图像显示相对高分子带MgydF4y2BargydF4y2Ba> 45 kD(例如,看到追踪3、4、7、11、13、15),它可以被认为是不具体的,因为他们也发现偶尔不仅在SCLC血清,而且在健康人的血清(跟踪2)。整个提取两个SCLC行,NCI-H69 NCI-H82,也用来想象ATA SCLC患者的血清。当使用这些细胞时,ATA的模式与NCI-N417细胞相似,主要区别是NCI-H69提取物根本检测不到抗p36和抗p28(数据未显示)。使用SCLC线获得的频率如表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.与SCLC血清相比,健康人血清中仅含有抗p40 - p42和抗p30,其相应频率分别为6%和3%(表1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba);在这两种情况下,SCLC血清与健康个体之间的差异有统计学意义(p<0.0001和p<0.001经卡方检验)。gydF4y2Ba
下一步工作的目的是确定SCLC细胞提取物是否与SCLC以外的癌症患者的血清发生交叉反应(为此目的,只使用了一个细胞系NCI-N417)。从表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba可以看出,这些癌症患者血清中ATA的检测频率明显低于SCLC (p<0.05),但anti-p30和anti-p14的检测频率差异无统计学意义(p=0.6和0.07)。gydF4y2Ba
表3总结了SCLC患者与健康人相比血清ATA的敏感性和特异性gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.所有ATA都具有高于90%的特异性。对于P40-P42估计59%的最大敏感性为P40-P42,其它ATA为<22%。然而,组合ATA的诊断价值明显优于单个抗体的诊断值:敏感性升至80%,保留高值等于91%。gydF4y2Ba
不同于SCLC的癌细胞株的整个提取物是否能与SCLC血清发生交叉反应是一个有趣的问题。为了回答这个问题,我们使用了细胞系sp 20(小鼠骨髓瘤)、H33(人肝癌)和K562(人白血病)。在与SCLC细胞提取物相同的条件下,这些细胞株的提取物均未显示从SCLC患者血清中提取的任何ATA(数据未显示)。gydF4y2Ba
上述数据表明,抗p40 - p42在SCLC患者中最常见,而在健康个体中很少出现(表1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).因此,确定是否能在肺癌高危人群的血清中发现ATA是特别有意义的。为此目的,SCLC细胞(NCI-N417)的提取物被用于筛查36名在切尔诺贝利核电站事故后果清理期间受到辐射的患者的血清。这些患者有各种肺部疾病,如慢性阻塞性或非阻塞性支气管炎和支气管哮喘。根据组织学调查,大多数患者有轻到严重的支气管上皮发育不良或局灶性或弥漫性肺纤维化。如表2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba在美国,抗p40 - p42的存在尤其引人注目:这些ATA出现的频率为36%,比正常血清高6倍。因此,SCLC患者(p=0.04)和健康个体(p<0.0001)血清中抗p40 - p42的频率处于中间位置。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
SCLC已知表达一系列神经内分泌细胞标志物。特别地,一些副肿瘤抗原被描述为与SCLC相关,这些副肿瘤抗原可引起相应的神经综合征的早期发展,这些神经综合征是由针对这些抗原的抗体介导的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.有数据表明,神经系统综合症可能在癌症变得明显之前的几个月甚至几年就出现了gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.尽管血清中抗原和相应抗体的检测可以指示患者SCLC的存在,但应该记住,作为规则,没有一个单独的标记似乎具有重要的临床意义,因此需要使用标记组gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
本研究采用含有大量蛋白抗原的SCLC细胞全提取物,尽可能直观地显示SCLC患者血清中存在的相应抗体的数量。结果表明,NCI-N417、NCI-H69和NCI-H82细胞系的SCLC细胞整体提取物显示,在SCLC患者血清中,有几种具有明显M的蛋白的抗体gydF4y2BargydF4y2Ba40-42,36,30,28,26和14 kd。最常遇到的抗体是对40-42kd区的抗原的抗原,其在SCLC血清中发生的频率为58-70%,而这些ATA非常罕见,如果有史以来,在健康个体的血清中存在(表1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).上述ATA对SCLC并不是绝对特异性的,因为它们也可以在SCLC以外的癌症患者的血清中检测到。此外,其他癌症细胞系的提取物,如sp 20(小鼠骨髓瘤)、H33(人肝癌)和K562(人白血病),与SCLC血清无交叉反应,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba这些癌细胞不含有上述ATA所对应的抗原。gydF4y2Ba
为了评价血清ATA的临床价值,可以将血清ATA全模式的敏感性和特异性与已建立的肿瘤标志物进行比较。虽然所有ATA个体的特异性都在90%以上,但除了anti-p40-p42的敏感性估计为59%外,它们的敏感性都低于22%。然而,在模式的情况下,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba针对p40-42kd,p36,p30,p28,p26和p14的抗体的组合分别等于80%和91%(表3gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).这些数值可与神经元特异性烯醇化酶等已建立的肿瘤标志物的相应特征相比较(分别为74%和83%)。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba和泌胃素释放肽(47%和95%)gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.因此,可以得出这样的结论:使用ATA模式所描述的方法与前面提到的已建立的肿瘤标志物的使用一样有效。gydF4y2Ba
人们特别感兴趣的是,了解在切尔诺贝利核电站事故后果清理期间受到辐射的各种肺部疾病患者(肺癌的高危群体)的血清中是否存在ATA模式。结果表明,这些患者血清中抗p40-p42抗体的频率处于SCLC患者血清与健康人血清之间的中间位置。这组患者继续接受仔细的医学观察,特别是测量ATA模式的动态,以回答这个模式是否可以预测肺癌的后续发展的问题。gydF4y2Ba
结合当前研究中获得的结果,问题仍然存在,“对应于上述抗肿瘤抗体的抗原的性质是什么?”。目前的作品为进一步鉴定抗原的性质和临床应用而产生基础。使用二维电泳,可能具有额外的纯化方法,与基质辅助激光解吸方法组合可以有助于鉴定这些抗原。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者感谢K. Rawson-Jones(莫斯科国立大学外国语学院,M.V. Lomonosov Moscow State University)和E.V. Bragina的帮助,感谢E.E. Skorikova和I.P. Vorojeikina的帮助。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2002年6月5日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年9月25日。gydF4y2Ba
- ©ers Journals LtdgydF4y2Ba