文摘gydF4y2Ba
肺上皮细胞活性氧簇(ROS)的一个主要目标。ROS可能导致氧化脱氧核糖核酸修饰,比如8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OHdG)。人类的同系物的杂种狗蛋白(hMTH1)防止这一修改。线粒体是最重要的细胞活性氧的来源和可能容易受到氧化损伤。本研究的目的是调查在肺上皮细胞氧化应激和线粒体损伤特发性间质性肺炎(iip)。gydF4y2Ba
作者分析了8-OHdG hMTH1,线粒体蛋白在肺癌患者标本13 iip由八个常用的间质性肺炎患者和5非特异性间质性肺炎患者使用免疫印迹和免疫组织化学分析。gydF4y2Ba
免疫反应性8-OHdG和hMTH1显著增加患者肺上皮细胞从iip与控制。hMTH1是局部的表达在核和细胞质,但没有线粒体,部分肺匀浆。免疫反应性对线粒体蛋白质和细胞色素c氧化酶复杂第四单元增加患者肺上皮细胞从iip与控制。gydF4y2Ba
当前的研究得出结论,氧化应激可能参与特发性间质性肺炎,上皮细胞损伤,增加线粒体质量可能与增加活性氧产量特发性间质性肺炎。gydF4y2Ba
这项工作是支持的科研补助金从教育部(13670604),日本的科技、文化。gydF4y2Ba
活性氧(ROS)可以引发脱氧核糖核酸(DNA)损伤、脂质过氧化反应,激活各种基因的产品参与炎症和细胞损伤。ROS产生8-oxo-7 8-dihydrodeoxyguanosine三磷酸(8-oxo-dGTP),生成8-oxo-7, 8-dihydro-2′脱氧鸟苷(8-oxo-dG;也称为8-hydroxy-deoxyguanosine 8-OHdG)在错误插入到DNAgydF4y2Ba1gydF4y2Ba。整合8-OHdG导致DNA复制缺陷,如基础错配,随机点突变和缺失gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。8-OHdG是一个很好的标志ROS-mediated DNA修改gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
蛋白质(8-oxo-dGTPase),大肠杆菌,小狗水解8-oxo-dGTP一磷酸形成,并防止核苷酸的错误插入DNA和信使核糖核酸(mRNA)复制和转录gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。人类蛋白质的酶的活动和氨基酸序列相似的杂种狗,名叫人类杂种狗同系物1 (hMTH1)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。据报道,hMTH1基因表达是氧化应激的分子标记gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。hMTH1蛋白质水平被发现增加线粒体隔绝postmyocardial梗塞的心,随着氧化应激增加gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
肺上皮细胞总是面临各种各样的压力,和是活性氧的主要目标。高细胞内和细胞外水平的抗氧化剂保护肺上皮细胞。ROS的生成等条件增加炎症,或暴露于空气污染物和香烟。ROS及其与肺上皮细胞参与反应的病理生理学一些肺部疾病,包括肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征,和肺癌gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。已经有许多研究证明增加氧化应激在特发性间质性肺炎(iip)。氧化剂的自发生产肺部炎症细胞和髓过氧化物酶浓度都是增加患者的肺泡上皮衬里流体iipgydF4y2Ba11gydF4y2Ba。硝基酪氨酸,由过氧亚硝基蛋白质硝化反应的副产品,是增加肺IIP的患者gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。F2-isoprostanes、产品radical-catalysed的脂质过氧化作用,增加支气管肺泡灌洗液(BALF)间质性肺疾病患者gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。产品的脂质过氧化反应,测定硫代巴比土酸丙二醛加合物,在等离子体和BALF IIP的增加gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。9的水平,11-diene共轭亚油酸和9,12-linoleic酸摩尔比率表示为百分之一,衡量free-radical-mediated脂质过氧化作用,升高IIP患者与对照组相比,也似乎与临床疾病活动gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。相比之下,有一个显著的抗氧化能力,减少测量Trolox等价的抗氧化能力,血浆及BALF IIP患者gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。这些结果证明的证据增加氧化应激和氧化/抗氧化失衡IIP患者。然而,在肺上皮细胞DNA氧化损伤患者iip没有评估。因此,8-OHdG和hMTH1表达的免疫反应性氧化应激指标在肺上皮细胞被免疫组织化学和免疫印迹分析检查。gydF4y2Ba
线粒体消耗∼90%的氧气使用的身体,和1 - 2%的氧代谢转化为线粒体ROSgydF4y2Ba16gydF4y2Ba。因此,线粒体是细胞最重要的来源的活性氧,可能容易受到氧化损伤。线粒体功能受损可能导致受损的电子传递和增强活性氧的生产。增加线粒体质量也可能导致活性氧的增加产量。因此,线粒体质量和mitochondria-specific蛋白的表达、细胞色素c氧化酶复杂IV(考克斯复杂IV)检查以评估线粒体损伤。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
材料gydF4y2Ba
这项研究的iip 13日进行肺样本通过胸腔镜肺活检。iip的诊断建立了结合病史,体检,实验室测试,胸部x线照片,肺功能测试,和组织学研究的结果,根据先前描述的标准gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。肺活检标本的组织学研究结果是兼容与通常的间质性肺炎(摘要)在8个病人和非特异性间质性肺炎(NSIP)在五个病人。iip患者的特点如表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。三个观察员没有知识的临床、生理或病理数据独立审查计算机断层扫描(CT)扫描。观察家得分三个CT图像2毫米厚度在主动脉弓,船底座,1厘米以上隔膜。每张图片都是在0 - 5分肺泡和间质异常:肺泡得分0,没有磨砂玻璃不透明;1、< 5%;2、5 - 25%;3、25 - 49%;4、50 - 75%;5 > 75%;间质得分0,没有纤维化; 1, interlobular septal thickening, no discrete honeycombing; 2, honeycombing <25%, 3, 25–49%; 4, 50–75%; 5, >75%, according to the scoring by Kazerooniet al。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。三个观察员的组合意味着被计算为每个病人的CT值。关于国际信息局的结果与八个正常肺实质肺癌标本通过叶切除术的孤立肺结节。这些病人由五个男人和三个女人的年龄范围从56 - 78岁(平均67岁),和所有的吸烟者。肺组织被获得后,立即在液态氮冷冻和储存在−80°C。gydF4y2Ba
本研究中使用的特定抗体如下:鼠标anti-8-OHdG单克隆抗体(NOF公司,日本东京),兔子anti-hMTH1多克隆抗体(罗福斯生物制剂,利特尔顿有限公司,美国),鼠标抗线粒体抗体蛋白(MAB1273;Chemicon国际泰梅库拉、钙、美国),和鼠标antibovine细胞色素氧化酶亚基IV单克隆抗体(20 e8-c12;分子探针,尤金,或者美国)。相同的抗体被用于免疫印迹和免疫组织化学。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
冰冻的肺组织被单一化冰上30年代(6 - 8中风)Potter-Elvehjem匀浆器在缓冲区(25毫米玫瑰,pH值7.5,5毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,1毫米egtazic酸(EGTA), 1毫米phenylmethyl磺酰氟(PMSF), 1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba亮抑酶肽和1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抑肽酶)。孵化冰上10分钟后,提取被漩涡800×10年代和离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟4°C颗粒细胞核。上层清液离心机在15000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。清除浮层被作为细胞质提取和颗粒作为mitochondria-rich分数。胞质提取物稀释了3×dodecylsulphate钠(SDS)样品缓冲和煮。mitochondria-enriched分数直接溶解在SDS-sample缓冲和煮。核丸孵化50µl缓冲B(25毫米的玫瑰,pH值7.5,420毫米氯化钠,MgCl 5毫米gydF4y2Ba2gydF4y2BaPMSF 1毫米EGTA 1毫米,1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba亮抑酶肽1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抑肽酶在冰上和25%甘油)在15000×30分钟,然后离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。上层清液作为核提取。细胞质和核提取物稀释了3×SDS-sample缓冲和煮。使用Bio-Rad蛋白质测定蛋白质浓度测定。每道30毫克的蛋白质被SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)分离。sds - page后,蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯疏水膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。膜是被三羟甲基氨基甲烷缓冲液脱脂奶粉5%盐水含0.05% Tween-20 (TBST)在4°C 2 h。膜的清洗TBST和孵化与特定的抗体阻断缓冲区在一夜之间在4°C。冲洗后,膜与生物素化的二次孵化抗体在室温下为30分钟。这些墨迹开发使用ECL免疫印迹检测工具(Amersham淀粉微球的生物技术,白金汉郡,英国)。 Pictures of the membranes were taken, scanned and analysed.
免疫组织化学gydF4y2Ba
组织样本在一夜之间在10%福尔马林固定,石蜡和嵌入。一个5-µm石蜡切片与poly-l-lysine坚持幻灯片进行预处理。这些部分被洗涤三次脱蜡用二甲苯5分钟,然后脱水在100%,95%和80%乙醇,前5分钟,最后用蒸馏水冲洗。对于8-OHdG疣状,组织部分使用µg·100毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba核糖核酸酶在磷酸缓冲盐(PBS)为了抑制非特异性RNA。免疫组织化学进行了使用修改后的streptavidin-biotinylated过氧化物酶技术使用Histofine从Nichirei SAB-PO工具公司(日本东京)。特异性的蛋白质染色被兔子和山羊血清在室温下为30分钟。部分是孵化主要抗体在一夜之间在4°C。部分被冲洗PBS和孵化与生物素化的二次抗体为30分钟。然后他们被清洗和处理0.3%的过氧化氢甲醇为30分钟,以抑制任何内源性过氧化物酶活性。幻灯片是洗,30分钟孵化streptavidin-biotin-peroxidase复杂,根据制造商的方向发展。随后的部分与苏木精复染色和安装。染色的程度的等级从0 - 3免疫反应性的细胞的百分比在细支气管和肺泡上皮细胞(0,0%;1、< 25%; 2, 25–50%; 3, >50%) per field, with 100× magnification. The fibrosis in each field was also assessed, using the criteria of Ashcroftet al。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba用细微的修改,从0 - 5评分(0,正常的肺;1,最小的纤维性肺泡或细支气管壁增厚;2,适度增厚墙没有明显损伤肺架构;3、增加纤维化肺纤维的结构和形成明确的损害乐队或小纤维质量;4、严重肺结构变形和大纤维领域(“蜂窝肺”是放置在这一类);5、总纤维消灭整个字段)。免疫反应性等级和纤维化等级字段同时测定两个观察员。两个观察员同意有关成绩。免疫反应性的平均成绩为每个病人每个字段计算。每箱20到50个字段进行评估。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
免疫印迹分析的光密度分析方差分析其次是矫正的F检验。免疫染色的不同年级被克鲁斯卡尔-沃利斯检验分析其次是Mann-Whitney紫外线测试。疣状年级之间的相关性和肺功能测试分析了斯皮尔曼等级相关。被认为具有统计显著性p值< 0.05。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
8-oxo-7, 8-dihydro-2′脱氧鸟苷免疫组织化学gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
积极信号8-OHdG主要是在细胞核中发现的细支气管和肺泡上皮细胞iip的患者,但不积极的信号检测的控制(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。半定量的结果肺上皮细胞的免疫染色等级显示摘要和NSIP有显著增加,与控制(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。摘要和NSIP,积极的信号在病变显著增加显示中度纤维化(图2 b级gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。疣状年级8-OHdG没有与肺功能测试或CT分数。gydF4y2Ba
免疫反应性的人类蛋白同系物的小狗gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
代表hMTH1免疫印迹分析的结果表明,该表达式中检测出细胞质和细胞核,但不是在线粒体分数(图3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。免疫印迹分析的定量结果表明,该表达式在细胞质和细胞核在iip而控制变量,但增加(图3 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
积极信号主要在细胞核和细胞质中发现了hMTH1细支气管和肺泡上皮细胞的摘要和NSIP,患者和控制(图。4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。疣状的半定量的结果在肺上皮细胞显示有一个年级显著增加摘要和NSIP而控制(图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。积极的信号明显增加,伴随着纤维化的进展摘要(图5 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。疣状年级hMTH1没有与肺功能测试或CT分数。gydF4y2Ba
线粒体蛋白质的表达gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
检查是否在肺上皮细胞线粒体质量是改变iip患者线粒体蛋白表达进行了分析。虽然抗线粒体蛋白质抗体与一个uncharacterised反应,免疫反应性显示一个饰以珠子的或细粒度的模式是典型的线粒体,如前所述gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。积极信号对线粒体蛋白质主要是检测到肺上皮细胞和肺泡巨噬细胞从iip患者,和控制(图。6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。疣状年级线粒体蛋白在肺上皮细胞显著增加在摘要和NSIP与控制(图7gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。强大的信号主要是在增生的上皮细胞中发现。阳性染色的程度肺上皮细胞线粒体蛋白质的增加伴随着纤维化的进展摘要和NSIP(图7 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
细胞色素c氧化酶的表达复杂的第四gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
代表结果第四考克斯复杂的免疫印迹分析表明,线粒体中的表达检测分数特别(图8gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。免疫印迹的定量结果分析表明,有一个显著增加第四考克斯复杂内容从线粒体分数相同数量的蛋白质相比,摘要与控件(图8 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
检查是否mitochondria-specific蛋白的表达变化从iip患者肺上皮细胞,第四考克斯复杂表达式进行了分析。阳性染色检测患者肺上皮细胞从摘要NSIP,和控制。强信号检测在摘要和NSIP增生的上皮细胞(图9所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
免疫组织化学检测的8-OHdG优势高效液相色谱法(HPLC),它允许8-OHdG的本地化gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba的风险,没有artifactorial 8-OHdG的生产,在提取和水解过程gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。虽然积极的信号检测肺上皮细胞的控制,这种信号显示显著增加上皮细胞从摘要和NSIP患者。积极信号8-OHdG主要是局部的原子核,而弱染色被发现在一些细胞的细胞质中。积极的信号通过免疫组织化学方法对hMTH1 iip的上皮细胞也显著增加,与控制相比,这是兼容的结果为8-OHdG免疫组织化学。hMTH1的阳性染色程度增加,伴有肺纤维化的进展在摘要和NSIP,而8-OHdG显著增加在病变显示中度纤维化等级。这些结果表明氧化DNA损伤增加iip患者的肺上皮细胞,损伤在先进纤维增生或再生上皮细胞损伤可能是修理。gydF4y2Ba
尽管8-OHdG增加吸烟者的肺比不吸烟者的肺gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,所有的控制从吸烟者使用得到的样本。因此,吸烟对8-OHdG免疫反应性的影响可以忽略。控制肺部被叶切除术获得肺癌。井上gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba表明,肺癌患者增加了8-OHdG水平周围肺组织DNA,并暗示在整个肺部,引起氧化应激通过环境代理或遗传因素的影响下在肺癌患者。iip,炎症细胞有可能损害肺上皮细胞通过释放蛋白酶和ROS,以及细胞因子,趋化因子,生长因子,除了环境因素和遗传因素。因此,8-OHdG水平可能增加患者的肺组织iip相比与肺癌。水平的提高8-OHdG iip患者的肺组织肺实质与肺癌患者可以部分解释的iip患者的肺癌发生率高。gydF4y2Ba
先前的研究显示肺组织氧化应激的IIP使用其他参数。过氧亚硝基是一个强大的氧化剂和硝基酪氨酸由过氧亚硝基蛋白质硝化反应的副产品。萨利赫gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba表现出显著增加硝基酪氨酸和诱导一氧化氮合酶的免疫反应性肺泡上皮细胞与对照组相比在early-to-intermediate阶段或晚期使用免疫组织化学学科。这些结果似乎与8-OHdG兼容,因为免疫反应性8-OHdG显著增加显示中等等级的纤维化病变。gydF4y2Ba
拉赫曼gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba证明产品的患者BALF中脂质过氧化增加IIP是否吸烟者和非吸烟者。他们推测,吸烟并不提高过氧化反应的过程已经存在于IIP患者。这些结果可能是兼容目前作者的结果有显著增加的免疫反应性8-OHdG NSIP患者,除了一个人之外谁都不吸烟者,而控制肺组织从肺癌患者都是吸烟者。gydF4y2Ba
线粒体是最重要的细胞活性氧的来源和可能容易受到氧化损伤。因此,作者认为线粒体氧化应激可能受损。然而,积极的信号在细胞核8-OHdG主要是局部的。积极的信号,通过免疫组织化学方法在细胞核和细胞质本地化hMTH1,和免疫印迹分析的结果表明,hMTH1蛋白表达在核和细胞质分数,但不是在线粒体分数。这些结果是意想不到的,可能表明,氧化损伤不显著的iip患者的线粒体。gydF4y2Ba
有显著变化的hMTH1表达在免疫印迹分析。缺乏一致性的测量8-OHdG HPLC报道;8-OHdG水平在正常的人类细胞从< 0.1 - >每10 200不等gydF4y2Ba6gydF4y2Ba碱基对gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。因此,hMTH1水平也可能在免疫印迹分析变量。另一个可能性是肺匀浆不仅的上皮细胞也由其他类型的细胞,如巨噬细胞和炎症细胞表达大量hMTH1,通过免疫组织化学方法显示。gydF4y2Ba
它最近被报道,8-oxo-dGTPase从失败中发现线粒体分数孤立的心在小鼠心肌梗死之后,用免疫印迹分析抗体人类同系物,hMTH1gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。此外,它还报道,8-OHdG被发现的免疫反应性大脑细胞的细胞质的学位阿尔茨海默氏症患者。线粒体蛋白质和第四考克斯复杂的免疫反应性降低老年痴呆症患者的大脑细胞与正常的脑细胞gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在这项研究中,线粒体蛋白质和第四考克斯复杂的免疫反应性蛋白在肺上皮细胞显著增加,特别是从iip的患者,增生的上皮细胞与控制相比,免疫组织化学。第四考克斯复杂的免疫反应性的结果通过免疫印迹分析线粒体分数似乎表明,保护线粒体功能。从先前的报道这些差异可能是由于细胞或组织特异性。由于肺上皮细胞不断接触ROS,肺上皮细胞是富含抗氧化剂gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。其他拾荒者或修复酶可能废除氧化应激在肺上皮细胞线粒体,线粒体损伤可能导致受损的电子传递,否则增强活性氧的生产,并进一步破坏上皮细胞。gydF4y2Ba
这项研究表明氧化应激增加肺上皮细胞从iip患者与正常肺实质相比,尽管患者的数量是很小的。氧化应激与细胞凋亡在许多病理条件。ROS显示移植Fas-Fas配体通路和细胞色素c的释放gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,并激活p53gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。的激活p53导致upregulation伯灵顿gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba和FasgydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。事实上,DNA损伤和细胞凋亡伴随着upregulation p53在肺上皮细胞,和Fas-FasL通路被发现调节iip患者的肺组织gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
这些结果表明,氧化应激可能参与上皮细胞损伤患者的特发性间质性肺炎,肺上皮细胞中线粒体的质量的增加可能与氧化应激增加。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
所使用的英语在这个手稿被k .修订米勒(皇家英语语言中心、福冈、日本)。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2002年7月12日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年9月17日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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