抽象的gydF4y2Ba
如果实验室诊断αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba- antiTrypsin(α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT)缺陷通常是基于其表型鉴定等电聚焦,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 茴香酶抑制剂(PI)S和PIZ基因型也可以通过脱氧核糖核酸(DNA)基础的方法来确定。最近,已经描述了用于从血清制备基因组DNA的几种方法。目前研究的目的是通过聚合酶链式反应(PCR)来确定来自血清提取的DNA的PI等位基因,并将这些结果与全血液提取的DNA获得的那些进行比较。gydF4y2Ba
血清α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT浓度和表型鉴定在43名住院患者中进行了系统地进行。基因组DNA从全血和血清同时纯化。使用PCR介导的位点定向诱变方法发现突变检测。gydF4y2Ba
关于表型鉴定,29例患者是MM纯合子,11例S(MS = 7)或Z(MZ = 4),三种显示ZZ表型。基因分析分析与血清和全血的DNA产生相同的结果,所有结果都与表型结果一致。gydF4y2Ba
作者发现,基于脱氧核糖核酸的测试证明是α的可靠工具gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 钛合金缺乏诊断,似乎是劳动密集型α的替代方案gydF4y2Ba1gydF4y2Ba等电聚焦法测定抗胰蛋白酶。作者还得出结论,这种方法可以从血清中提取高质量的脱氧核糖核酸,与从全血中提取的相同,有助于对多种遗传标记的回顾性研究。gydF4y2Ba
α.gydF4y2BalgydF4y2Ba-抗蛋白酶抑制剂(Pi)或αgydF4y2BalgydF4y2Ba- antiTrypsin(α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-At),是溶酶体蛋白酶的主要血清抑制剂,例如中性粒细胞弹性蛋白酶gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.α1-α是52kDa和394个氨基酸的多态性单链糖蛋白,在肝脏中合成,通常存在于150-350mg·dl的血清中gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.它显示> 90种不同的基因确定的表型gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表型M是正常变体(90%的群体)和表型S和Z是两种最常见的异常变种gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.PI ZZ流行率的计算值约为:1:1,000-1:145,000,位于欧洲和北部;1:45,000-1:10,000在中欧;和1:10,000-1:90,000,在东欧和大陆最南端和最北端的地区。在美国,加拿大,澳大利亚和新西兰的白人人口中,PI ZZ表型流行范围从1:2,000-1:7,000个人。在非白人人群中αgydF4y2BalgydF4y2Ba-AT缺乏被认为是一种罕见或不存在的疾病gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba.Z表型的纯合性是α型的主要原因gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏。它通常导致儿童和成人的不同肝病以及早期成人发作的肺气肿,等离子体水平αgydF4y2BalgydF4y2Ba- 在纯合的Piz个体中只达到10-15%的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT浓度在PiM个体中观察到gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba.虽然个人MS或SS不受影响,但SZ受试者可能是对症的。最近,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-At缺乏症与哮喘,支气管扩张,血管炎和Panniculitis有关gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-At基因包含分散超过12kb的染色体段14q 31-32.3的七个外显子,并以肝细胞和单核吞噬细胞表达gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.PiZ等位基因的突变包括外显子V的单个碱基替换(鸟嘌呤到腺嘌呤),导致氨基酸342(从谷氨酸(GLU)到赖氨酸)的变化。gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba.PIS等位基因的特征在于在外显子III中取代腺嘌呤的腺嘌呤,其导致氨基酸缬氨酸在264位而不是GlugydF4y2Ba11.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
实验室测试绝对是诊断α的必要条件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏。常规,该诊断基于血清α的测量gydF4y2Ba1gydF4y2BaISO电聚焦(IEF)浓度和α1-在表型的鉴定。与血清α相比,IEF有时会呈现出常见的结果或不等调gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT测量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba.从几年中,PIS和PIZ基因型也可以通过脱氧核糖核酸(DNA)基础的方法来确定gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
血浆或血清中的DNA首次于1948年由曼德尔和Metais发现gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba.尽管DNA在健康和疾病的血浆中自由循环是显而易见的,但这种DNA的来源仍然是个谜。据推测,健康人的循环DNA来源于淋巴细胞或其他有核细胞gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba.最近,已经描述了几种方法,用于从血清中制备基因组DNA,其中一些需要非常少量的血清范围为20-250μLgydF4y2Ba18.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba.这些微萃取程序允许获得DNA并用作模板,以扩增DNA片段,大小可达3789个碱基对(bp)。扩增聚合酶链反应(PCR)产物的质量与从全血标本中制备的DNA相似gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba.本研究的目的是从血清中提取DNA,以通过先前描述的PCR介导的位点诱变确定PI等位基因gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba并将这些结果与从外周血细胞中提取的对照DNA进行比较。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
耐心gydF4y2Ba
从2001年3月至12月,从南希(18名女性和25名男性)住院的患者中,共收集了43例静脉血液样本;平均52.2±22.6 YRS(平均±SD),范围为0.5-90 YRS)。共有11名患者在呼吸系统部门住院,并已知患有肺气肿(n = 10)或慢性支气管炎(n = 1)。这些患者共有三个已经被诊断出患有并且是ZZ HOMOZYGOTES。gydF4y2Ba
定量测定αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba- intrypsin浓度gydF4y2Ba
α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba使用速率免疫浊度法对血清样本进行at测量(imagage immunochemistry System, Beckman-Coulter, Roissy,法国)。免疫浊度计自动稀释样品1:36,以达到最佳抗原-抗体平衡分析。gydF4y2Ba
α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶表现型gydF4y2Ba
通过在4.2-4.9(Phast Gel Dry Ief的PhaTe Zel Dry Ief; Phast床(Phast Gel Dry Ief)的扁平床聚丙烯酰胺凝胶上系统地在3μl每种血清样品上进行表型对每个血清样品进行系统地进行。变型M,S和Z焦点在pH 4.5和4.7之间gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba.Coomassie r350染色后,根据制造商的建议(PhastGel Blue R, Pharmacia), αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT与对应于PIM,PIM,PIMZ或PIZZ对应的对照样品进行比较,并检查表型。gydF4y2Ba
α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- 聚合酶链式反应的钛素基因分型gydF4y2Ba
基因组脱氧核糖核酸提取gydF4y2Ba
基因组DNA从外周血细胞(Nucleon BACC 3; Amersham Pharmacia Biotech,Orsay,France)以及39名患者的血清中纯化。在四个患者中,DNA仅从它们的血清中提取。如林和弗洛罗斯所描述的那样gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba,测试来自少量血清的两个基因组DNA提取方法。本作者发现,用改性的蛋白酶K /钠硫酸钠(SDS)裂解法,找到了更好的结果。用蛋白酶K处理总共250μl血清(1.7mg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;Gibco BRL,Life Technologies,Cergy-Pontoise,法国)和5%SDS(Sigma Aldrich,Saint-Quentin Ralkavier,France)在65°C持续1小时。然后将该溶液在95℃加热10分钟以使蛋白酶K失活。然后将裂解物萃取,乙醇沉淀。以16000×离心后gydF4y2BaggydF4y2Ba,4℃持续15分钟,将DNA沉淀溶于25μl的Tris-HCl 10mM pH 8.5中。gydF4y2Ba
聚合酶链反应gydF4y2Ba
突变分析程序是在Tazelaar pcr介导的定点突变方法的基础上进行修改的gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba.在含50μl反应体积的含有50μm脱氧核苷酸三磷酸(Sigma Aldrich,Saint-Quentin Ressavier,France),2mM MgCl的50μl反应体积中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(Gibco BRL, Life Technologies),每个引物12.5 pM(由Nancy大学医院共同分子生物学部合成),250 ng DNA, 1.25 U Taq聚合酶(Gibco BRL, Life Technologies)。在最初变性在94°C 2分钟步,第一次放大进行了30周期,每个周期由一个30多岁变性时间在94°C, 30年代退火时间在64°C和60年代在72°C扩展时间,其次是最后一步在72°C 7分钟一个优秀的热循环(美国珀金埃尔默,诺沃克,CT)。如果第一次扩增不足以获得PCR产物,则进行第二次相同的20周期PCR程序以优化结果。gydF4y2Ba
限制酶消化和电泳gydF4y2Ba
首先在含有1mM乙二胺四乙酸的89mM Tris-硼酸盐缓冲液中在2%琼脂糖凝胶上运行PCR产物,在恒定电压为130V的pH 8.3,50分钟。然后制备限制消化混合物,如下制备:将10μlPCR产物加入40μmgydF4y2BaTaq.gydF4y2BaI限制性内切核酸酶(Ozyme,Saint-Quentin,yvelines,法国)和牛血清白蛋白(BSA)和内切核酸酶缓冲液,以终体体积为20μL。根据制造商的建议(Ozyme),将消化混合物在65℃下孵育2小时。最后,在相同的运行缓冲液中在相同的运行缓冲液中在相同的运行缓冲液中在150V的恒定电压下根据Tazelaar的结论,将消化的PCR产物分析在15%聚丙烯酰胺凝胶上。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
本文收集了2001年3月至12月间43例患者的血液样本(女性18例,男性25例,平均年龄52.2岁)。血清α共37gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT浓度被认为是正常的或增加,并且考虑到使用的参考值(91-182 mg·dlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。只有六个血清αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT浓度<91毫克·DLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
α的鉴定gydF4y2Ba1gydF4y2Ba所有这些患者的-AT表型均通过IEF获得:29例为MM纯合子,7例为S杂合子,gydF4y2Ba即。gydF4y2BaMS和4名患者是MZ杂合子(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。正如预期的那样,三名患者是ZZ Homozygotes(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。血清α1-浓度的6例较低显示MZ(n = 3)和ZZ(n = 3)表型(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,table 1⇓gydF4y2Ba)。已知这三名ZZ患者患有肺部肺气肿。通过从血细胞提取的基因组DNA和从血清中提取的基因组DNA来系统地进行基因型分析,以验证39例患者的方案。在四个患者中,仅从血清中提取的DNA分析基因型。gydF4y2Ba
如Tazelaar所述gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba,PCR引物用于产生gydF4y2BaTaq.gydF4y2BaI限制性位点,可区分正常和突变DNA。用于扩增包括Z突变位点的序列的引物在7例中产生正确尺寸(179bp)的产物。随后消化gydF4y2BaTaq.gydF4y2Ba我向IEF获得的人达成协议(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba):四名患者是杂合子(MZ),3名患者是Z等位基因的纯合子。类似地,在7例中发现包括S突变(121bp)的扩增产物。所有这些患者都是杂合子(MS)。gydF4y2Ba
与39名患者的全血DNA获得的那些相比,血清提取的DNA得到了相同的结果。43种基因分型结果与表型结果一致(图1和2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
通过PCR在43名住院患者中从血清中提取的DNA确定PI等位基因。作者发现了该程序的良好质量DNA等于从全血中提取的,无论PI等位基因如何。gydF4y2Ba
DNA在疾病和健康中自由地在血浆中循环,但这种血清DNA的来源并不完全已知gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba.在健康受试者中,假设循环DNA衍生自淋巴细胞或其他核细胞。癌症患者的循环DNA比健康受试者更大gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba.这种肿瘤DNA似乎不太可能来源于循环癌细胞的裂解,因为通常在血浆中发现的循环细胞的数量不足以解释检测到的大量DNAgydF4y2Ba27.gydF4y2Ba.肿瘤坏死的作用尚不清楚,因为癌症患者的DNA血浆水平在放射治疗后达到90%,而如果坏死是DNA释放的主要途径,则会增加增加gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba.细胞凋亡被认为是循环DNA的起源gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba然而,这种机制应该通过增殖细胞丢失。第四个假设是肿瘤通过类似于观察到的机制积极地释放血液中的DNAgydF4y2Ba体外gydF4y2Ba当淋巴细胞或整个器官自发地释放DNA而没有任何细胞死亡gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
在本研究中,在从血清中提取的全血和DNA中提取的DNA之间比较PI基因分型。在所有情况下,两种提取程序都具有相同的PI基因型,结果符合等电聚焦的表型测定。本作者证实,由少量血清制备的基因组DNA可以用作扩增DNA段的模板,以检测遗传改变,如Lin和Floros所述gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba.血清微萃取和PCR基因分型的结合为基因分析提供了一个快速和廉价的工具gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba.少量血清(250μL)可以非常有信息,因为它产生足够的DNA来分析几种遗传标记。gydF4y2Ba
通常同意PCR方法可用于测定αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏变种PIS和PIZgydF4y2Ba12.gydF4y2Ba.最近,哥斯达黎加gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba已经提出了在定量α中使用干血斑样品gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT检测。缺乏α.gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT通过组合α的结果来评估gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT定量和表型。在α之间有一种不和谐的情况下gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT浓度和表型,遗传α的诊断gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT缺乏症是由α建立的gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT基因分型。在哥斯达的研究中gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-AT基因型测定使用从干血斑样品和来自四个不同表型患者(PI M,MZ,MS和Z)的四名患者的新鲜血液样品进行。用从干血斑样品或新鲜血液中获得的PCR产物观察到相同的基因型gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
本研究首次显示,据作者的知识首次表现出,该研究可以从血清中获得血清,当用于α时,与全血相同的质量。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- intrypsin基因型分析。虽然需要进一步的研究来确认这些发现,但初始结果非常令人鼓舞。这种基于脱氧核糖核酸的方法是快速,方便,更容易地表现,而不是等电聚焦技术的表现较小。作者认为,从外周血细胞提取的脱氧核酸的替代品似乎是少量血清的基因组脱氧核糖核酸。此外,它将是等电聚焦技术的良好补充,即使它不太可能完全取代它,由于这种经典方法可以检测到的大量变型。此外,这种基于脱氧核糖核酸的方法,允许从血清中获得基因组脱氧核糖酸,可用于遗传分析与多种遗传标记而不是αgydF4y2BalgydF4y2Ba- 抗肝脏抑制剂等位基因。它应该为分析现有标本的分析,并且由于血清文库更常用于实验室而不是脱氧核糖核酸酸。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者谨此感谢R. Demard和M. Valentin的优质技术援助。gydF4y2Ba
- 已收到gydF4y2Ba2002年5月23日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年8月26日。gydF4y2Ba
- ©ers Journals LtdgydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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