文摘gydF4y2Ba
哮喘和鼻炎常常共存并分享许多临床特征。上皮改变鼻腔炎症的程度是有争议的。信息粘附中扮演一个重要的角色在组织形态发生和体内平衡是由钙粘蛋白家族。作者表明,在人类支气管上皮细胞肿瘤坏死因子(TNF) -α诱导的钙粘蛋白和β-catenin表达明显降低。加入地塞米松抑制减少。本研究的目的是探讨TNF-α和地塞米松对调节的影响钙γ-catenin和β-catenin人类鼻上皮细胞(HNEC)。gydF4y2Ba
HNEC的主要文化,从人类鼻内窥镜鼻窦手术后使用。钙粘蛋白的定量和定性调制,γ-catenin和β-catenin表达被免疫印迹和免疫荧光分析评估。为了评估HNEC TNF-α-induced激活,interleukin-8和咆哮(激活规范,正常t细胞表达和分泌)释放被酶联免疫吸附试验评估。gydF4y2Ba
结果表明,TNF-α诱导,在γ-catenin和β-catenin表达减少,但没有影响钙粘蛋白的表达。免疫荧光显示,TNF-α诱导胞质钙粘蛋白的本地化,γ-cateninβ-catenin。地塞米松抑制TNF-α的影响和诱导钙粘蛋白表达增加三倍。gydF4y2Ba
这些结果表明,鼻和支气管上皮凝聚力的差异可能是由于肿瘤坏死的微分效应factor-α和地塞米松钙粘蛋白的表达。gydF4y2Ba
哮喘和鼻炎现在被认为是同一疾病的两端gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。事实上,他们常常共存gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和分享等临床特征断断续续的症状,严重的波动,炎症和阻塞。具体的过敏原引起早期和晚期阶段的反应gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在肺部和鼻子。支气管上皮的损伤是一种常见的特征哮喘和哮喘患者的支气管上皮细胞不太可行的比对照组gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。上皮异常程度的慢性鼻炎是有争议的。一些研究报道,上皮损害频繁gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,而其他人则表示,鼻腔上皮仍几乎完全完好无损gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。先前的研究从目前作者组显示鼻腔上皮不改变与常年鼻炎,过敏性哮喘患者支气管的上皮改变更大比鼻粘膜的哮喘病人常年鼻炎gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
信息粘连组织形态发生和体内平衡中起着重要的作用gydF4y2Ba13gydF4y2Ba通常是由钙粘蛋白,一个家庭的CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba端依赖跨膜粘附受体。钙粘蛋白家族参与控制细胞的结构。钙粘着蛋白亲同种抗原的交互形式相似的邻近的细胞受体而与细胞骨架的胞质域进行交互gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。这些交互是介导gydF4y2Ba通过gydF4y2Baβ-catenin或γ-catenin (plakoglobin),与微丝通过α-actinin和α-catenin交互gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
局部糖皮质激素被认为是最有效的一线治疗过敏性鼻炎。他们都是有效的缓解鼻炎的症状,可以管理长时间没有严重副作用的风险gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。最引人注目的糖皮质激素的作用是抑制多种炎症基因的表达(细胞因子、酶、受体和粘连分子)。此外,糖皮质激素发挥根本性作用的功能和维护信息接触诱导乳腺上皮细胞的紧密连接的形成gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
作者显示之前,人类支气管上皮细胞,促炎介质肿瘤坏死因子(TNF) -α参与哮喘的过程诱导显著减少钙粘蛋白和β-catenin表达式。这些粘附分子的减少可能是负责支气管上皮的结构损伤和可能参与上皮失去凝聚力。这个过程可能会被逆转的类固醇,如图所示的地塞米松抑制钙粘蛋白的减少和β-catenin表达细胞gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。小林和同事gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba表明,在培养鼻上皮细胞钙粘蛋白的表达受到transepithelial炎症细胞迁移的影响,特别是嗜酸性粒细胞。他们建议transepithelial炎症细胞的迁移可以直接诱导上皮钙粘蛋白表达减少。gydF4y2Ba
在目前的研究中,人类鼻腔上皮细胞(HNEC)文化获得人类鼻鼻甲骨。首先,在上皮细胞培养、免疫印迹和免疫荧光分析是用来确定TNF-α和地塞米松可以调节钙粘蛋白,β-和γ-catenin表达和监管。最后,释放促炎细胞因子白介素(IL) 8和咆哮(激活规范,正常t细胞表达和分泌),已知受TNF-α和地塞米松gydF4y2Ba22gydF4y2Ba评估,为了检查炎症状态的上皮细胞培养。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
HNEC鼻甲手术后获得知情同意。鼻鼻甲骨是取自病人没有任何宏观炎症的证据和断奶类固醇治疗手术前至少2个月。切除后,一夜之间,鼻甲骨被清洗和孵化在4°C·毫升0.38毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba透明质酸酶,0.75 mg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba胶原酶,1 mg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba蛋白酶和0.3 mg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba脱氧核糖核酸酶在罗斯威尔公园纪念研究所媒体(RPMI) 1640 (Gibco,宏伟的岛,纽约,美国),然后透过100 -µm网状细胞尼龙过滤器。件与小气道上皮细胞保留在过滤器恢复细胞生长介质(SAGM;Bio-Whittaker Walkersville,医学博士,美国),转入12-well板块(美国Nunc公司,内伯威尔市,IL)。gydF4y2Ba
人类鼻腔上皮细胞的刺激gydF4y2Ba
TNF-α剂量/响应曲线进行HNEC (0.1 ng·-100毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)48 h(研发系统,阿宾顿,英国)。为了测试刺激特异性抗体TNF-α(研发系统,明尼阿波利斯,美国),100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba浓度,添加到刺激的媒介。地塞米松(1×10gydF4y2Ba−7gydF4y2BaM)同时添加到刺激的媒介。gydF4y2Ba
测量的咆哮和interleukin-8释放人类鼻上皮细胞gydF4y2Ba
引发和咆哮以浮在表面的游离使用商业刺激细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Quantikine、研发系统,阿宾顿,英国)。elisa进行根据制造商的指示。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
刺激后,整个细胞被洗冷磷酸盐(PBS)和细胞溶解在10毫米Tris-HCl, pH值7.4,50 mM氯化钠,5毫米乙二胺四乙酸(EDTA), 1%诺乃清洁剂p 40,和10µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Baphenylmethylsulphonyl氟化物。细胞提取物被转移到微型离心机管、混合、和留在冰10分钟。一个冻结/解冻周期后,他们在12000×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C。浮在表面的蛋白质样品被评估和调整其余部分4×Laemmli离解缓冲区。十µg总蛋白质受到钠十二烷基sulphate-polyacrylamide在4 - 12%梯度凝胶电泳凝胶(美国Novex,圣地亚哥,CA)然后在硝化纤维膜涂抹。屁股被封锁与含有3%牛血清白蛋白的PBS, 0.1%渐变20日和探测anti-E-cadherin(1:2,500)β-catenin(1:50 0)和γ-catenin(下)主要单克隆抗体。包含0.1%渐变20与PBS系列洗后,膜与peroxidase-conjugated孵化山羊anti-mouse抗体(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)作为二级抗体1:3,000稀释。单克隆抗体anti-β-actin 1:3,000(σ)是用作控制。启示进行了使用一个增强化学发光系统(NEN波士顿,MA,美国)自动射线照相术紧随其后。Autoradiographical电影进行分析通过光密度扫描使用黑白CCD相机rs - 170 (COHU)耦合的美国国立卫生研究院(NIH)图像分析程序。gydF4y2Ba
免疫荧光gydF4y2Ba
特定的刺激后,HNEC被cytocentrifugation获得。细胞被固定在4%多聚甲醛和permeabilised 4分钟在0°C使用0.5%(体积/体积)特里同x - 100在PBS。在PBS包含驴血清阻断后,细胞被孵化与anti-E-cadherin 1 h在室温下,β-catenin和γ-catenin单克隆抗体(美国肯塔基州的列克星敦转导实验室)稀释1:10 0在同一个缓冲区。在控制实验中,主要的抗体取代了一个无关紧要的抗体,鼠免疫球蛋白(Ig) G1 (Dako、Golstrup、丹麦)。使用cy标签了gydF4y2BaTMgydF4y2Ba3-conjugated AffinePure驴anti-mouse免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch实验室、公司、西树林,PA,美国)。广泛的洗涤后,细胞被安装和使用尼康Optiphot-2观察荧光显微镜(尼康,东京,日本)。gydF4y2Ba
统计方法gydF4y2Ba
定量结果表示为均值±sem中执行的三个实验重复。所有结果都与基底值相比,除了anti-TNF-α效果和地塞米松,而TNF-α100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。细胞因子的作用及地塞米松用配对t检验和分析认为重要的假定值< 0.05时。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
定量调节细胞因子表达在人类鼻上皮细胞gydF4y2Ba
上层清液的刺激细胞,引发和咆哮的水平用ELISA测定。TNF-α增加引发和咆哮的释放与最大剂量依赖性的方式释放100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba浓度对引发(p = 0.0001)和咆哮(p = 0.03)。地塞米松逆转这种效果与49%抑制引发咆哮释放(p = 0.0001)和72% (p = 0.03)。Anti-TNF-α抗体诱导回归基础值两种细胞因子在100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba浓度、引发p = 0.0001, p = 0.03咆哮,而独自TNF-α(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
定量调节钙β-catenin和γ-catenin表达在人类鼻上皮细胞gydF4y2Ba
免疫印迹分析表明,HNEC展出基底的钙粘蛋白的表达,β和γ-catenin。TNF-α刺激48 h显著减少的表达β-cateninγ-catenin但没有影响钙粘蛋白的表达(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。最大降低β-catenin表达式得到10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抑制浓度(71%,p = 0.008)。γ-catenin,极大减少了100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抑制浓度(56%,p = 0.01)。gydF4y2Ba
当anti-TNF-α(100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)添加到刺激介质,β-catenin和γ-catenin回到水平指出如果细胞(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。当地塞米松(1×10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba米)被添加到刺激中等(100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2BaTNF-α)β-catenin (p = 0.0002)和γ-catenin (p = 0.04)表达式返回到基底的水平,而钙粘蛋白表达增加三倍相对于基准面(p = 0.03)和TNF-α独自住在100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba浓度(p = 0.005)(图1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
定性监管钙β-catenin和γ-catenin表达在人类鼻上皮细胞gydF4y2Ba
钙粘蛋白,β-和γ-catenin表达被刺激的免疫荧光48 h后评估TNF-α(100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)±地塞米松(1×10gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba米),如果细胞钙β-catenin和γ-catenin表达主要是限制膜的横向细胞壁以最小的细胞质表达(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。在刺激细胞,免疫反应性保持膜上皮,β-cateninγ-catenin,细胞质表达增加(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。地塞米松添加时,钙β-catenin和γ-catenin免疫反应性再次成为膜和细胞质表达降低(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这项研究中,免疫印迹分析显示β-catenin基准面,γ-catenin HNEC和钙粘蛋白表达。TNF-α显著降低β-cateninγ-catenin表达式,但没有影响钙粘蛋白的表达。这种减少是抗体对TNF-α以来具体能够扭转它。此外,加入地塞米松逆转的影响TNF-αβ-catenin和γ-catenin和诱导钙粘蛋白表达增加三倍。使用免疫荧光分析,证明这些粘附分子主要是膜。TNF-α异于寻常的粘附分子在细胞质内,由地塞米松的逆转。此外,观察到TNF-α诱导引发和咆哮释放HNEC和添加一个anti-TNF-α抗体或地塞米松抑制这种作用。gydF4y2Ba
呼吸道上皮取决于各种粘附机制维持上皮结构gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。横向边界的上皮细胞,紧密连接,附着连接和桥粒结构特征的上皮细胞间连接复合体gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。这些细胞接触是由多种粘附分子,包括钙粘蛋白。钙粘蛋白是best-characterised跨膜糖蛋白表达了对许多类型的上皮细胞表面,包括鼻上皮gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。钙粘蛋白有亲同种抗原的邻近的细胞受体相互作用相似,而与细胞骨架的胞质域进行交互gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。细胞粘附机制最可能发生病变引起上皮炎症过程中损坏。gydF4y2Ba
气道上皮细胞能够应对这种频繁的环境压力,分泌促炎症介质如引发和TNF-α刺激后咆哮gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。在当前的研究中,TNF-α刺激有效地导致引发强烈的增加和咆哮HNEC释放。没有任何刺激,HNEC发布了一个非常低水平的引发和咆哮,确认细胞最初处于静止状态。与之平行的诱导炎症,降低水平和不同细胞本地化的β-catenin和γ-catenin被观察到。没有观察到TNF-α对钙粘蛋白的影响,与当前作者之前的研究在人类支气管上皮细胞gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。此外,目前的结果不同于那些在腹腔疾病gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,在Langherans状的树突细胞gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba。在这两个模型和支气管上皮细胞模型,减少钙粘蛋白的表达可能与E-cadherin-mediated附着力的损失而且可能与上皮凝聚力的丧失。gydF4y2Ba
β-catenin结合钙粘蛋白的胞质域结构和保护上皮免受proteolitic退化gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。目前的结果表明,钙粘蛋白的胞质域可能即使没有保护β-catenin绑定。TNF-α低效的抑制鼻上皮钙粘蛋白表达可能与缺乏明显的上皮损伤鼻过敏,即使在炎症的存在。gydF4y2Ba
多年来,糖皮质激素可以减轻过敏性疾病,如哮喘和鼻炎的症状时管理口服或局部使用gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在这项研究中,它已经被证实,地塞米松有效抑制TNF-α影响引发释放和咆哮。地塞米松也可以恢复β-catenin和γ-catenin表达水平及其膜本地化。此外,地塞米松诱导钙粘蛋白表达增加3倍和钙粘蛋白的免疫反应性再次成为膜。在这项研究中,结果表明:地塞米松能够加强上皮和信息粘附钙粘蛋白的诱导表达和恢复连环蛋白表达。目前的结果是符合Zettl的建议gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba糖皮质激素可以发挥根本性作用的功能和维护信息联系在乳腺上皮细胞诱导紧密连接的形成。此外,FotygydF4y2Baet al。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba表明地塞米松明显减少ht - 1080人纤维肉瘤细胞的侵袭性。因此他们提出这invasion-suppression地塞米松可能至少部分由于cadherin-mediated增加凝聚力。gydF4y2Ba
这里给出的结果,得到了在鼻上皮细胞,突出主要矛盾钙粘蛋白的调节促炎细胞因子在鼻和支气管上皮细胞之间。的不同调节上皮钙粘蛋白可以解释可能的不同改变。作者可以因此得出结论,钙粘蛋白可能参与增强鼻腔上皮细胞粘附和信息的完整性,尽管持续炎症慢性鼻炎。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢联合国Lautredou-Audouy (CRIC,蒙彼利埃,法国)和a - m。Pinel和他的同事们(纽约研究所生物Cellulaire,图卢兹,法国)的专家技术援助。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2002年2月18日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年7月25日。gydF4y2Ba
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