摘要gydF4y2Ba
在恶性肿瘤和免疫抑制的儿童中,呼吸并发症的显着发病率和死亡率。本研究的目的是调查这是否与改变的表面活性剂组分或功能相关。gydF4y2Ba
对24例对经验抗生素治疗无反应的恶性肿瘤、免疫抑制、肺浸润和发热患儿的支气管肺泡灌洗液与24例健康儿童进行比较。表面活性剂蛋白(SP) A和D的水平及其与gydF4y2Ba假单胞菌铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,以及SP-B和SP-C水平,通过酶联免疫吸附试验进行评估。用脉动气泡表面仪对表面活性剂的大小团聚体进行了分离,并测定了其生物物理活性。gydF4y2Ba
与健康对照组相比,SP-A水平增加了4倍,在那些从支气管肺泡灌洗液中回收病原体的儿童中增加最明显。在患有恶性肿瘤的儿童中,SP-C水平增加了2倍,小表面活性剂聚集水平增加了5倍。SP-B和SP-D水平、SP-A和SP-D结合能力以及大型表面活性剂聚集物的表面活性均无差异。gydF4y2Ba
表面活性剂蛋白A水平的升高,特别是在微生物恢复的儿童中,表面活性剂蛋白A的结合能力没有变化,这与局部宿主防御机制的上调是一致的。表面活性剂蛋白A和C的增加也可能是表面活性剂在儿童恶性肿瘤、免疫抑制、肺浸润和发烧中保持生物物理活性的原因。gydF4y2Ba
- 支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
- neutropaenicgydF4y2Ba
- 磷脂gydF4y2Ba
- 大小表面活性剂聚集gydF4y2Ba
- 表面张力gydF4y2Ba
- 表面活性剂的蛋白质gydF4y2Ba
在免疫抑制期间,恶性疾病的治疗常伴有下气道感染。在儿童中,最初使用广谱抗生素的经验性治疗往往是成功的。然而,如果发烧持续,肺部浸润增加,可使用诊断性支气管肺泡灌洗(BAL)来恢复病原微生物和协助治疗gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
确定感染的严重程度的因素并不完全理解,但包括宿主因子,例如免疫抑制程度,以及毒力因子,例如暴露于特异性微生物。另外,肺部上皮衬里局部的局部先天免疫因子的浓度和调节可以易于满足或确定给定患者的过程。肺表面活性剂蛋白(SP)A和SP-D似乎在对各种微生物的先天免疫应答中枢转。这是建立的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba淘汰小鼠的研究。针对SP-A缺失的小鼠显示出增加的易感性和死亡率gydF4y2Ba化脓性链球菌,铜绿假单胞菌gydF4y2Ba、呼吸道合胞病毒等病毒gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.最近,显示SP-D缺陷小鼠在呼吸合胞病毒或脂多糖攻击后,患有肺炎细胞数量增加,较高百分比的中性粒细胞gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba.SP-A和疏水性SP-B、SP-C在肺中除了具有免疫调节功能外,还具有重要的生物物理功能gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba.肺部到期和抑制水肿形成期间小型气道和肺泡的通畅和稳定性主要取决于含有足够的功能性SP-A,SP-B和SP-C的表面活性剂。gydF4y2Ba
这些SPS的浓度和调节在免疫抑制治疗肿瘤中产生严重的呼吸并发症的儿童中是未知的。表面活性剂的改变的生物物理性能可能有助于与空间的间接和抑制分泌物和碎片的清除,并且SP-A和SP-D的改变水平或性质可能会损害宿主防御机制,从而影响肺部感染的临床过程。在肺炎期间,SP-A的水平降低gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba最小表面张力增加gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba;未见SP-C相关资料报道gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.此外,在肺炎和新生儿的医院感染期间改变了小(SA)和大(LA)和大(LA)表面活性剂聚集体的含量gydF4y2Ba11gydF4y2Ba和成人gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba.LA组分具有较强的表面活性,被认为是表面活性剂表面活性的主要原因gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
本研究的目的是评估的水平四个SPs, LA和SA和表面活性剂的表面活性恢复了BAL从儿童恶性肿瘤与免疫抑制治疗,对治疗发烧和肺浸润和比较这些结果与正常儿童。假设这些肺表面活性剂关键成分浓度的改变与特定病原体的存在或不存在、放射性浸润或预后有关。gydF4y2Ba
患者和方法gydF4y2Ba
控制孩子gydF4y2Ba
24名健康儿童(中位年龄10.2岁(范围4.5-15.3岁),14名男性),无心肺疾病,无慢性呼吸道症状或近期上呼吸道或下呼吸道感染史。所有儿童均因非肺部疾病接受选择性手术,如泌尿生殖道轻微异常(尿道下裂和膀胱输尿管反流;扁桃体切除术(N =11),腺切除术(N =6)和侧颈囊肿(N =2)。采用柔性支气管镜(Pentax®,Hamburg, Germany;在全麻(氧化亚氮、氧气和氟烷1-5%)和气管插管时,10岁以下儿童的外径为3.5 mm,年龄稍大的儿童为4.9 mm。该研究经机构审查委员会批准,并在研究前从父母那里获得了知情同意。gydF4y2Ba
患有恶性肿瘤和免疫抑制的儿童gydF4y2Ba
支气管镜检查执行gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba局部麻醉后的软性内窥镜,在支气管镜检查前吸入4%的利多卡因雾化吸入,在气管镜检查时需要注入2%的利多卡因。利多卡因在0.00001-0.1%的最终浓度范围内测试,对所使用的分析系统没有影响。镇静剂量0.3 mg·kggydF4y2Ba-1gydF4y2BaMidazolam。在连续24名儿童前瞻性进行了两种患有在射线照相上的各种恶性肿瘤的两种恶性肿瘤进行了> 48小时,或者没有响应初级经验抗生素治疗。表1中提出了患者及其课程的细节gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.灌洗液中的儿童中位数为8.1岁(范围2.0-16.5 YRS)。该研究经机构审查委员会批准,并在研究前从父母那里获得了知情同意。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗和灌洗液加工gydF4y2Ba
在所有正常儿童和恶性肿瘤及弥漫性浸润的儿童中,支气管镜显示肺中叶楔形。在有局部浸润的儿童中,对放射学改变最明显的肺叶进行灌洗。生理盐水0.9% (3 mL·kg体重gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)将体温升温在20ml等分试样中使用。分别处理的第一种回收的BAL流体并使用2-4mL用于微生物研究。将其他样品合并,并通过纱布过滤后,以200×以200×离心10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba为清除细胞和碎片,上清置于−70℃保存。无细胞上清在40000 ×差速离心30mingydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C中含有含有较低表面活性的SA的级分,以及含有LAS的更少的表面活性部分,其沉积在管的底部gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
磷脂的分析gydF4y2Ba
如前所述gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,从混合样品的等份中提取脂质,从无机磷酸盐含量中测定磷脂含量。本测定法适用于微量滴定板。所有测量都是一式两份。gydF4y2Ba
表面活性剂蛋白A和B的固相酶联免疫吸附测定gydF4y2Ba
如前所述进行这些测定gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.所有样品一式两份评估。gydF4y2Ba
表面活性剂蛋白C的酶联免疫吸附测定gydF4y2Ba
SP-C分析如前所述gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.简而言之,标准(人重组Dipalmitoyl-SP-C; Altana Pharma Ag,Constance,Germany),20μlBal流体样品和SP-C掺入的BAL流体样品,如内标在80%2中稀释- 聚苯乙烯微量滴定板(Polysorp F96; Nunc,Wiesbaden,德国)。在37℃下干燥6小时后,加入100μl三氟乙醇,并将板再次干燥2小时。然后将板用200μl甲醇洗涤两次,用200μl50mM三(羟甲基) - 氨基甲烷(Tris)/盐酸(HCl)用0.5%Tween 20(pH7.6)。多克隆兔抗SP-C(1:10,000,在50mm Tris-HCl / 1%牛血清白蛋白(BSA);然后加入来自W. Steinhilber,Altana Pharma Ag的礼物,并将平板孵育12-15小时室内温度。洗涤三次后,通过过氧化物酶 - 缀合的抗碱性的抗体抗体检测结合的抗SP-C(50mM Tris-HCl / 1%BSA,pH 7.6; Calbiochem,Bad Sodene,Gerand)和20毫克2,2'-唑胺 - 二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS; Boehringer,Mannheim,德国)在30mL底物缓冲液中。所有样品一式两份分析。外源SP-C尖峰(平均99%)的回收与BAL流体蛋白浓度无关。酶联免疫吸附测定(ELISA)不受样品的总蛋白质含量的影响; in particular, SP-A, SP-B and serum albumin did not interfere with SP-C measurement15gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
酶联免疫吸附法测定表面活性剂蛋白DgydF4y2Ba
Maxisorp 96孔板(Nunc, Roskilde, Denmark)在4°C下用单克隆小鼠抗大鼠SP-D (VI f11;BMA, 8月,瑞士)与人类SP-D交叉反应(E. Crouch, Dept of Pathology, Washington University, St Louis, MO, USA)在2µg·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba在碳酸盐缓冲液(15mm NagydF4y2Ba2gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba, 35mm NaHCOgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,ph 9.6)。封闭10mg·ml后gydF4y2Ba-1gydF4y2BaBSA在Tris缓冲盐水中含有5 mm CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba将样品或标准物在37℃下孵育1小时。用单克隆小鼠抗真菌SP-D抗体(II e 11-Biotin; BMA)检测到结合的SP-D在阻断缓冲液中,然后用抗葡萄蛋白 - 生物素 - 辣根过氧化物酶复合物(Abcomplex; Dako,Glostrup,Denmark),在阻塞缓冲液中稀释1:100。检测的下限为30 ng人SP-D·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba.采用ABTS和双氧水在室温下进行比色反应,在405 nm下用分光光度法测定产物。gydF4y2Ba
假单胞菌铜绿假单胞菌gydF4y2Ba表面活性剂蛋白A和D的结合分析gydF4y2Ba
将nnc Maxisorp微滴度片在4°C下涂过夜gydF4y2Ba假单胞菌铜绿假单胞菌gydF4y2BaP11,来自囊性纤维化患者的非黏液样临床分离物,在碳酸盐缓冲液中。封闭和洗涤后,如elisa所述,标准品或100µL样品,160 ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2BaSP-D和50 ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2BaSP-A是在2 mM CaCl的存在下添加的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.在浓度<160或<50ng·ml的情况下gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba分别不预先妨碍样品。然后将所有样品在板中稀释在四个步骤中以靶向结合测定的最佳浓度范围,并在25℃下温育3小时。洗涤后,如对于SP-A或SP-D ELISA所述,与结合的SP-A和SP-D的交联15分钟并堵塞,检测和可视化,并进行交联,检测和可视化。所有测定均用两份进行。在对照样品中检测到的相应收集素(SP-A或SP-D)的量除以该收集素浓度的标准量。确定了中值值,每个样品的碳水化合物结合能力表达为该值的百分比。gydF4y2Ba
表面张力gydF4y2Ba
如前所述,使用脉动气泡表面测试仪(电学,Amherst, NY, USA)对LA馏分的表面张力改性性能进行了评估gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.吸附定义为气泡形成10 s后获得的表面张力,最小表面张力定义为脉动5 min (20 cycles·min)后的表面张力gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba;最小半径0.40 mm,最大半径0.55 mm),以气泡的最小半径确定。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
数据作为N个独立测定的间隔范围和范围作为中位数给出。表面活性剂蛋白质测定的结果相对于欧洲呼吸协会特遣部队在BAL上的建议所回收的BAL流体的体积表达188bet官网地址gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.然而,为了允许与其他研究进行比较,结果也相对于蛋白质和磷脂浓度表达。计算Spearman等级相关系数以确定不同变量之间的相关性。kruskal-wallis对方差分析进行了比较,以计算四组比较的整体p值,gydF4y2BaIE。gydF4y2Ba对照组,所有患有恶性肿瘤的儿童,以及BAL液中有或没有病原体的儿童。不同组之间的多重比较由Dunn's进行gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba测试。p值<0.05被认为是显著的;所有给定的p值都是精确的gydF4y2Ba17gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
本研究的主要目的是比较全组儿童的恶性肿瘤,发烧和胸部浸润与对照儿童。此外,第一组被分为从BAL液中回收病原体(n=10,年龄13.9岁(范围2.0-16.5岁))和未回收病原体(n=14,年龄7.1岁(范围2.2-14.2岁))的患者。患儿灌洗液中有病原体时,BAL液恢复量较低(表2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).无论有无病原体存在,肺浸润时总细胞计数均增加。中性粒细胞的比例从4倍增加到>10倍,而肺泡巨噬细胞的比例只略微增加淋巴细胞的比例(表2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
在患有恶性肿瘤、发烧和胸部浸润的儿童中,BAL液蛋白总量大约增加了4倍,而总磷脂保持不变(表3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).SP-A水平增加了约4倍,在从BAL液中回收病原体的儿童中,增幅更明显(近10倍)(表3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).SP-A水平仍然增加,即使纠正BAL液体恢复(246 ng·mLgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba(范围51-1,109 ng·mlgydF4y2Ba-1gydF4y2Ba)在健康儿童中gydF4y2Ba与gydF4y2Ba794 ng·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba(范围126 - 3313 ng·毫升gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba), p=0.0004)。SP-A的绑定容量gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在所有被测试的组之间没有差异(表3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).既不是SP-D浓度也不是其绑定能力gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在恶性肿瘤,发烧和渗透的儿童中被改变(表3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
虽然疏水性SP-B的浓度在组中没有差异,但在恶性肿瘤,发烧和渗透的儿童中,SP-C水平明显增加,而不管是否从BAL流体中回收病原体(表4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).这些儿童的SA分数也有所增加(表4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).总体而言,La分数的生物物理性质,gydF4y2BaIE。gydF4y2Ba在所有时间点的最小表面张力达到5分钟,吸附在空气/水表面,没有改变(表4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).各组间SP-A、-B、-C、-D无明显差异。gydF4y2BaIE。gydF4y2Ba弥漫性或间质性(表1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在恶性肿瘤的儿童中,发烧和胸部浸润,SP-A的水平增加,这些患者在其BAL流体中的病原体患者中的增加最明显。增加为4-10倍,并未反映BAL流体回收的差异。SP-A水平的这种增加可能反映了监管现象,gydF4y2BaIE。gydF4y2Ba肺启动局部先天性宿主防御机制的急性期反应。在动物实验中,已观察到脂多糖或细菌气管内攻毒后SP-A浓度的急性增加gydF4y2Ba18gydF4y2Ba-gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.在具有获得性免疫缺陷综合征的免疫功能不全的成人患者的肺炎中,SP-A水平增加已被报道gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,而免疫正常的患者SP-A水平下降gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaSP-A基因的表达受多种因素的影响,包括糖皮质激素,SP-A的响应性不同gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和SP-AgydF4y2Ba2gydF4y2Ba基因gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.在动物实验中,通过皮下皮质类固醇来上调SP-A信使核糖核酸(mRNA)gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.在本研究中,在没有皮质类固醇的情况下,在治疗的那些患者之间没有观察到SP-A水平的差异,表明最近的系统类固醇的治疗方法不是确定BAL流体SP-A浓度的主要因素。gydF4y2Ba
SP-A的绑定容量gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在不同的测试组之间没有差异。结合碳水化合物表面是集合素的核心特征,因此,与它们激活巨噬细胞或清除微生物的能力密切相关gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.这些结果表明SP-A的功能活动没有明显的损害。从目前的数据来看,没有证据表明SP-A浓度降低,而SP-A敲除小鼠的数据预测了SP-A敲除小鼠可能与清除肺部微生物受损有关gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba.相反,本组患者的结果表明SP-A具有细菌肺部感染的上调。SP-A的其他替代是否加强本地肺部宿主防御可能是值得的,gydF4y2BaIE。gydF4y2Ba通过吸入人重组蛋白,需要在合适的动物模型中进行试验。gydF4y2Ba
基于大量的gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaSP-D是另一种可能参与宿主防御的肺集蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.然而,目前的结果表明,它的浓度和功能结合活性都没有改变。因此,排除了SP-D水平降低可能导致肺部感染的可能性。然而,SP-D上调的潜在失败只能在不同对照组的纵向调查中评估。在患者中,BAL液中SP-D的量与中性粒细胞的数量之间没有观察到相关性(相关系数=−0.22,p=0.33),与SP-D敲除小鼠的报告相同gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba.大鼠吸入脂多糖也改变了BAL液中SP-D的浓度,但在该模型系统中,吸入后2h内SP-D的碳水化合物结合位点被脂多糖占据gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.综上所述,在恶性肿瘤、发烧和胸部浸润的儿童中发现SP-A和SP-D的不同调节作用。SP-A浓度增加,尤其是在BAL液中含有病原体的儿童,而SP-D水平没有变化。gydF4y2Ba
令人惊讶的是,表面活性剂的其他主要功能,生物物理表面活性,与对照组相比,在患病儿童中没有改变。然而,SA水平的增加表明表面活性剂体系的整体变化显著。保守的表面活性可以用几种单独或联合作用的机制来解释。这包括观察到的SP-A浓度的增加,这将有助于增加表面活性剂对进入空气中的蛋白质失活的抗性gydF4y2Ba27gydF4y2Ba.在患者中,总蛋白的增加约为4倍,而重症肺炎患者的增加为6倍gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba,尽管没有这些患者的详细临床资料。更重要的是,SP-C水平也不断增加,可能有助于稳定表面活性剂的表面活性,如动物和gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.在成人肺中调节SP-C表达或浓度的因素包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、皮质激素和暴露于增加浓度的吸入氧gydF4y2Ba28gydF4y2Ba.虽然TNF-α浓度的增加降低了SP-C基因转录gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,观察到SP-C水平升高,该细胞因子在患者中未被评估。本研究中的患儿没有接受明显的氧疗,但其中8人在BAL前一周内接受了全身类固醇治疗。SP-C水平在接受或未接受皮质激素治疗的儿童之间没有显著差异。儿童SP-C与SP-A、SP-B与SP-D均无相关性,动物实验提示SP-C mRNA的调控不受其他表面活性蛋白的调控gydF4y2Ba28gydF4y2Ba.不幸的是,没有其他关于BAL液中SP-C水平的定量数据可供进一步比较。gydF4y2Ba
总之,在治疗期间具有恶性肿瘤和免疫抑制的儿童,他在其支气管肺泡灌洗液中具有高度表面活性剂蛋白A和C的水平增加。分离的表面活性剂的生物物理性质不会受到损害,尽管增加的小表面活性剂聚集体的增加表明表面活性剂的肺泡代谢的一些改变。增加浓度的表面活性剂蛋白A和C可能具有保守的表面活性剂功能。表面活性剂蛋白的最大增加在那些从其支气管肺泡灌洗液中回收的微生物的儿童中,与所描述的条件下的上调局部肺机宿主防御系统的概念一致。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
感谢A. Schams优秀的技术支持。作者感谢Y. Kuroki和国际试剂公司,日本神奈山,慷慨捐赠的单克隆小鼠抗人表面活性剂蛋白A抗体PC-6, E. Crouch(华盛顿大学病理学系,圣路易斯,MO,美国)的重组人表面活性剂蛋白D和W. Steinhilber (ALTANA Pharma AG, Constance,美国)(德国)为兔抗人表面活性剂蛋白C多克隆抗体。本文章包含了M. Neumann的医学论文的部分内容。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2001年1月16日。gydF4y2Ba
- 公认gydF4y2Ba2002年6月9日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba