摘要
对人体组织的研究表明生产性爱泼斯坦巴尔病毒和特发性肺纤维化(IPF)之间存在关联。然而,该病毒的致病作用尚未确定。本研究旨在建立一个动物模型,探讨病毒感染与肺纤维化之间的关系。
对博来霉素耐药BALB/c小鼠(n=30),用小鼠γ疱疹病毒68引物,腹腔注射博来霉素。博莱霉素治疗后28天处死小鼠,对其肺进行组织学和生化检查。肺病理纤维化和炎症改变评分为0-3分。
BALB/c小鼠给予病毒和博莱霉素后肺纤维化程度(中位数评分2.2)高于单独给予博莱霉素组(中位数评分0)。同样,与博莱霉素(中位数0.5)、病毒(中位数0.8)或PBS对照组(中位数0.2)相比,同时给予病毒和博莱霉素的小鼠表现出更多的肺部炎症(中位数评分1.9)。博莱霉素和病毒组的胶原蛋白含量(平均1.86 mg)与博莱霉素单独组(平均1.52 mg)有显著差异。
这些结果表明,病毒本身不会导致肺纤维化,但在存在外源性损伤的情况下复制病毒可能促进肺纤维化的发展。
特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明、预后差的疾病。病毒有改变细胞功能从而导致疾病的潜力。例如,eb病毒是一种疱疹病毒,是伯基茨淋巴瘤和鼻咽癌的病因之一1.有报道称IPF与EBV有关2- - - - - -5虽然因果关系尚未建立。
血清学研究表明,活跃的EBV与IPF有关3.,6.组织基础分析已在IPF患者的II型上皮细胞中鉴定出EBV生产周期抗原7,8以及EBV脱氧核糖核酸9,10但目前尚不清楚该病毒是旅客还是具有致病作用。
了解EBV在肺纤维化中的作用将有助于建立动物模型。不幸的是,EBV的宿主范围有限,限制了它在动物身上的使用。然而,小鼠γ疱疹病毒68 (MHV)是一种密切相关的小鼠病毒,是有效的小鼠等效的EBV11- - - - - -13.在复制过程中,基因组与生产周期抗原的合成具有较强的同源性。急性感染后的临床疾病在各自的宿主中是相似的。
在动物模型中,博莱霉素诱导纤维化是研究纤维化的常用方法,但这有几个局限性。选择对博莱霉素耐药的小鼠来研究病毒感染是否会导致博莱霉素诱导的纤维化。本研究旨在探讨疱疹病毒作为辅助因子在宿主肺纤维化发展中的作用,宿主暴露于外源性损伤,而疱疹病毒通常对外源性损伤具有抵抗力。
方法
动物
所有实验均采用5 ~ 6周龄、体重21 ~ 29 g的博莱霉素耐药BALB/c小鼠进行。老鼠被安置在硬木剃须上的塑料笼子里,可以免费获得实验室的食物和水,房间条件符合内政部的指导方针。
试验协议
进行了两组实验,一组用于组织学评估(n=30),另一组用于胶原含量评估(n=28)。每个实验将小鼠分为如下四组。1) B组(仅博莱霉素组):经鼻给予磷酸盐缓冲生理盐水,腹腔注射博莱霉素。2) V组(仅病毒组):经鼻给予MHV,腹腔注射PBS。3) BV组(博来霉素+病毒组):经鼻给予MHV +腹腔注射博来霉素。4) C组(对照组):经鼻、腹腔给予PBS。
第1天,经鼻给予MHV,剂量为4×105平台单位在氟烷麻醉。第8天腹腔注射博莱霉素(不经镇静),剂量40 mg·kg−1·天−1每隔3天(累积剂量120 mg·kg)−1).PBS作为对照物质。这些老鼠每天都被检查,那些过早死亡或表现出痛苦迹象的老鼠被提前宰杀并检查。第36天腹腔注射戊巴比妥致死性剂量处死所有存活小鼠,解剖并摘除肺。
组织学检查
解剖后直接注射福尔马林充气肺。肺进一步固定,并储存在福尔马林,直到准备常规脱水和石蜡包埋。
从石蜡保存的肺组织中取3 ~ 5 mm的切片,用血氧杆菌素和伊红染色。组织病理学家(ps . s . Hasleton)对各组盲视,根据已公布的评分系统的简化修改对纤维化和炎症程度进行评分14.这些切片在低功率下进行了系统扫描。纤维化和炎症根据扫描区域受影响的百分比分别从0-3分。无纤维化或炎症评分为0,三分之一的受影响部位评分为1,三分之二以下为2,三分之二以上为3。肺泡壁增厚时考虑纤维化。
羟脯氨酸估计
心脏和肺被作为一个块移除,心脏被分离。肺被压在纸巾之间彻底干燥。一旦所有的水分被清除,肺被放置在埃彭多夫,并立即称重。记录肺重量,标记标本并放入液氮中。样品保存在−80℃,待分析。采用高压液相色谱(HPLC)方法测定羟脯氨酸水平,作为评估肺组织中胶原蛋白含量的一种方法。每个样品都放在研钵里,然后用杵把它们碾成粉末。将灰浆放置在干冰上保持凉爽,并根据需要在肺上添加液氮来保持冷冻。获得的粉末储存在−80°C的eppendorf中,直到为下一阶段做好准备。
将已知的粉末称重并放入耐热玻璃管中。向试管中加入3毫升6 M盐酸,在110°C下水解16小时。将水解液与活性炭混合45分钟,然后以每分钟5000转的速度离心15分钟。取1毫升水解液过滤(DA型,孔径0.65µm;Millipore, Bedford, MA, USA)置于1.5 mL微滤管中,10µL过滤后的溶液用90µL水进一步稀释,然后取10µL使用。滤液用离心真空浓缩器干燥。用100µL 0.4 M四硼酸钾缓冲水重组干滤液,再与100µL 12 mM 7-氯-4-硝基苯-2-氧-1,3-二唑在甲醇中反应。样品于37℃黑暗孵育20分钟。加入50µL的1.5 M盐酸和150µL的167 mM醋酸钠(体积/体积为26%)后,反应停止。样品经过滤(孔径为0.22 μ m),滤液上载100 μ L,乙腈梯度洗脱,反相高效液相色谱法。
将得到的色谱峰面积与标准品进行比较,计算羟脯氨酸含量。假设肺胶原中含有12.2% w/w羟脯氨酸,测定各组肺胶原含量。排除4个异常结果,1个来自C组,2个来自V组(1个错位),1个来自BV组。
统计分析
组间组织学分析和羟脯氨酸估计采用单因素方差分析进行比较。一个事后采用Bonferonni校正进行多组比较。各组间进行羟脯氨酸估计的非配对t检验。p<0.05为显著性。
讨论
先前的人类研究表明EBV与IPF有关联。然而,获取人肺组织的实际困难可能限制了对病毒损伤和肺纤维化关系的进一步研究。这些实验表明,暴露于外源性肺损伤的小鼠,在存在活性病毒感染的情况下,会发生肺纤维化,而单独接受病毒的小鼠则不会。组织学评估显示,博莱霉素耐药BALB/c小鼠同时接受博莱霉素和病毒治疗后,肺纤维化和炎症明显加重。
本小鼠模型用于特异性研究EBV在肺纤维化中的作用。之所以选择MHV作为感染源,是因为它在小鼠中的行为与EBV在人类中的行为相似。MHV基因组由末端重复序列两侧的118 kb基因组组成。基因组序列显示,许多基因在EBV和MHV基因组中具有很强的同源性和可比性12.例如,MHV从其基因组的左手端产生病毒潜伏时表达的蛋白质,这些蛋白质与EBV中与EBV相关的小信使核糖核酸蛋白质相似,它们来源于其基因组的同一区域,并在潜伏时表达。斯图尔特et al。13强调了MHV和EBV之间的密切关系。他们研究了MHV gycloprotein B (gB),并将其与EBV gB (gp110)进行了比较。这种gB在疱疹病毒组中是不寻常的,这种强烈的相似性说明了EBV和MHV之间的密切关系。在活的有机体内小鼠体内的MHV导致脾肿大15,16淋巴瘤和原因。该病毒在肺和上皮细胞中持续存在,并进入潜伏在b淋巴细胞中,其活性与人类的EBV非常相似。
盲法组织学评估采用了基于扫描切片受纤维化或炎症影响的百分比的评分系统。要确定纤维化评分的最小病理变化是肺泡或细支气管壁的中度增厚。因此,评分是一种可靠的技术,因为它消除了可能受到任意解释的温和变化。由于病理学家是盲目的群体得分过高是不可能的。大多数BV组有明显的肺泡纤维化改变,肺结构扭曲。
如果使用其他染色方法来量化组织学纤维化,本研究的结果可能会更容易实现。特别是,氮杂酚染色可以更准确地定量纤维化。羟脯氨酸含量的生化分析在很大程度上支持组织学结果,但胶原含量在各组之间没有总体差异。由于BV组的肺重量明显更大,且BV组(平均1.86 mg)与B组(平均1.52 mg)之间的胶原蛋白含量存在显著差异,大量样本可能已经对此进行了校正。
在人类中,EBV促进IPF发展或进展的机制可能与其对细胞周期蛋白的影响有关。EBV在上皮细胞复制过程中产生的抗原(如。EBNA5和BZLF1)影响细胞周期蛋白如p53的功能17,18.这反过来又会干扰正常的细胞生长和分裂,包括上皮细胞。完整的肺上皮对控制正常的细胞因子功能很重要。导致上皮细胞受损的病毒因子可能导致细胞因子平衡的改变,从而导致修复过程的失调,从而促进纤维化。
这项研究表明,单纯的MHV病毒感染并不会导致肺纤维化。选择BALB/c小鼠是因为它们对博莱霉素具有固有抗性,这表明病毒感染启动了正常情况下对博莱霉素肺损伤具有抗性的肺,因此作为疾病发展或疾病进展的辅助因素。这是一个重要的概念,因为免疫抑制治疗经常用于IPF患者,可能促进人肺组织内的病毒复制。这种病毒复制可能会提供重复损伤的来源,而重复损伤越来越被认为是IPF发病机制中的一个关键因素。此外,这一概念可能阐明了为什么免疫抑制在很大程度上未能影响IPF的疾病进展,而非免疫抑制治疗,如抗氧化剂、秋水仙碱和可能的干扰素γ至少提供了一些令人鼓舞的结果。
总之,这项研究表明,复制病毒的存在可能有助于外源性肺损伤后纤维化的发展,所描述的模型可能有助于进一步研究人类病毒介导的肺纤维化发病机制。
致谢
作者感谢G. Laurent对完成这项研究的支持。
- 收到了2001年8月21日。
- 接受2002年3月22日。
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