文摘
自从16-kDa细支气管克拉拉细胞蛋白(CC16)和肺泡surfactant-associated蛋白(SP)——和- b泄漏到循环实质健康不安时,本研究的目的是确定其血清水平是否可以作为早期外围烟草烟雾诱发上皮损伤的标志。
六十九(51岁(32-54)中位数(25 - 75))不吸烟者和54(42岁(31-53))无症状吸烟者都参加这项研究。
血清水平的SP-A受试者之间没有差别(270 (208 - 389)与259年(168 - 392)µg·L−1),然而,CC16水平下降(10.6 (8.7 - -14.6)与7.6(6.0 - -11.2)µg·L−1)和SP-B水平增加(2529 (2091 - 2943)与3053年(2613 - 4188)µg·L−1在吸烟者。当接触烟草烟雾,血清肌酐(肾指数),年龄和性别作为独立变量,CC16被累积的负面影响吸烟和积极受年龄的影响。SP-A - b和负面影响和肌酐的积极影响累积吸烟。血清SP-B呈负相关在一秒钟用力呼气量/至关重要的能力,表明阻塞性疾病之间的关联和实质肺健康。
作者认为血清surfactant-associated proteins-A和- b反映alveolocapillary泄漏增加,而克拉拉细胞分泌蛋白16反映烟草烟雾诱发克拉拉细胞毒性。他们的评价可能允许烟草烟雾的影响在不同程度的呼吸道,细胞毒性和上皮泄漏是杰出的。
这项工作是支持的国家科学研究基金(FNRS),比利时政府协会(CT DD / MD006)和欧盟委员会(QLK 4 - 1308),澳大利亚国家健康与医学研究理事会和Autogen研究企业有限公司
吸烟对呼吸道产生多种生物效应包括肾上腺素能和胆碱能刺激,ciliostasis,粘液分泌过多,氧化应激,炎症和脱氧核糖核酸损伤可能与发病率和严重程度的增加一些疾病包括癌症和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。事实上,吸烟是肺气肿的主要原因。然而,目前没有足够的敏感生物标记评估实质功能异常变得明显之前肺部健康。
肺上皮细胞分泌一些特定的蛋白质进入呼吸道的空域。其中包括16-kDa细支气管克拉拉细胞分泌蛋白(CC16),细支气管克拉拉细胞分泌的主要产品,以及surfactant-associated蛋白(SP)——和- b,主要由肺泡II型细胞分泌1。这些蛋白质生理上发生少量的血液2- - - - - -4因为它们分泌进入呼吸道,发生在血清只能解释为漏到血管隔间。尽管这些蛋白质进入血液的确切机制仍然知之甚少,他们在血清的浓度,称为pneumoproteinaemia1,可以用来评估肺上皮屏障的泄漏和/或上皮细胞分泌的完整性。事实上,他们的血管内泄漏的增加条件的特点是肺部炎症和/或肺上皮损伤2,4- - - - - -8。
吸烟增加肺泄漏,敏锐地通过烟雾诱发释放血管活性的神经肽(速激肽)从航空公司的感觉神经9并通过早期慢性肺实质结缔组织的破坏。因此,监测pneumoproteinaemia可能提供新的可能性的评估肺损伤由吸烟引起的。其他人此前报道,血清SP-A高架在吸烟者,尽管没有关系是观察与吸烟的数量10,11。然而,当前作者表明SP-A是一个相对不敏感的标志肺实质损伤,可能因为其大小(本地相对分子质量(Mr)∼650 kDa)2。尽管CC16小得多,其循环水平反映肺上皮的完整性和克拉拉细胞分泌的。事实上,它已被证明,由目前的作者,这是减少在支气管肺泡灌洗液3和血清中12,13从烟草吸烟者。
像CC16 SP-B也是一个相对较小的蛋白质。相比之下,主要的循环水平反映了alveolocapillary屏障的完整性,至少在急性肺损伤患者2,14。血清SP-B烟草吸烟者从未评估水平。在这项研究中,血清CC16的效用,SP-A和SP-B肺上皮损伤的非侵入性标记物在烟草吸烟者首次进行比较。
材料和方法
研究人群
本研究通过临床研究的伦理审查委员会的弗林德斯医疗中心(澳大利亚阿德莱德)和由当地伦理委员会鲁汶天主教大学的医学院(比利时布鲁塞尔)。
从肘前的静脉血液采样不吸烟者:55岁男性(52岁(20),中等(范围)和14个女性(26岁(18-50));吸烟者:39岁男性(51岁(22-60))和15个女性(32岁(21-42))(表1所示⇓)。吸烟者吸烟就放弃在抽样之前至少2 h。所有受试者完成一份调查问卷关于他们的职业暴露,吸烟习惯和呼吸道症状。尿液可替宁测量被用来帮助验证吸烟状态。虽然没有主题或心血管和肺部疾病的历史证据,所有的旧对象(年龄≥50岁,44不吸烟者和吸烟者23日)进行肺功能测试。样本储存在−80°C的批分析和盲随机的方式进行分析。
分析方法
克拉拉细胞分泌蛋白16
CC16乳胶免疫测定是用兔子anti-protein 1抗体(Dakopatts、斯特鲁普、丹麦)和CC16纯化的房子15。在56°C血清样本加热30分钟和聚乙二醇处理(16%,v / v, 1/1)和三氯乙酸(10%,v / v, 1/40),以避免可能的补充的干涉,类风湿因子或乳糜微粒。所有样品都是在重复分析两种不同的稀释。测定的检出限0.5µg·L−1和平均分析恢复95%,内部和interassay系数变化范围从5到10%。
表面活性剂proteins-A和- b
SP-A - b测定和酶联免疫吸附试验(ELISA)抑制化验使用多克隆抗体对肺泡蛋白质沉积症派生SP-A和成熟SP-B长大,分别2。短暂,为了自由SP-A和从任何有关等离子体- b或表面活性剂组件、整除首次接受乙二胺四乙酸(EDTA),钠dodecylsulphate (SDS)和特里同x - 100。所有样品都是在重复化验四连环稀释。标准,化验一式四份,包含在每个ELISA板系列稀释(SP-A: 1.95 -250八点µg·L−1;SP-B: 7.8 -1000µg·L−1)。吸光度测量使用Dynatech MR5000读者(美国弗吉尼亚州Chantilly Dynatech实验室)。AssayZap程序(Biosoft,弗格森,密苏里州,美国)被用来生成一个标准曲线(r > 0.99)和计算SP-A和- b的浓度。抗体不与其他等离子体反应或肺泡上皮衬里液抗原和检测内部和interassay变异系数< 10%2。
其他参数
血清肌酐由贾菲的方法测量,作为肾小球滤过率的指标。尿液中可替宁测定气相色谱法。肺功能测试评估(肺活量描记器紧凑II;组织设计和制造,埃尼斯,爱尔兰克莱尔有限公司)使用欧洲呼吸协会的建议188bet官网地址16。
统计分析
Kolmogorov-Smirnov测试与校正Lilliefors意义被用来测试正常。CC16的分布、SP-A SP-B吸烟者明显的非线性(p = 0.000, p = 0.000, p = 0.008)。因此,非参数统计。除非另有说明,结果表示为中值(范围)。曼Whitney u测验或Wilcoxon配对signed-ranks测试是用于所有的比较。测量变量之间的关系进行了测试使用斯皮尔曼秩次相关测试。统计学意义被分配在p < 0.05。
结果
吸烟者与不吸烟者
而血清的浓度SP-A持平的吸烟者,SP-B增加(p = 0.0001)和CC16下降(p = 0.0014)(图。1⇓)。这些差异是由表达强调数据作为SP-A / CC16 (p = 0.0019)和SP-B / CC16 (p = 0.0000)。
决定因素
结合
当吸烟者和非吸烟者的数据相结合,CC16受累积并继续吸烟的负面影响是积极受年龄的影响。SP-A和- b是受肌酐和积极影响累积吸烟的负面影响(表2所示⇑)。当分析重复使用目前的吸烟作为一个独立的变量,而不是累积吸烟,影响浸渍(CC16: r相似2= 0.35,SP-A: r2= 0.07,SP-B: r2= 0.48)。
Proteinaemia co-relationships
血清SP-B有关SP-A在吸烟者(r年代= 0.44,p = 0.014)和非吸烟者(r年代= 0.29,p = 0.017)。相关血清CC16只是SP-A吸烟者(r年代= 0.43,p = 0.003)和SP-B无关。
年龄
血清CC16, SP-A SP-B与年龄相关的吸烟者(CC16: r年代= 0.44,p = 0.003;SP-A: r年代= 0.41,p = 0.002;SP-B: r年代= 0.37,p = 0.006)和非吸烟者(CC16: r年代= 0.57,p = 0.000;SP-A: r年代= 0.27,p = 0.025;SP-B: r年代= 0.38,p = 0.001)(图3所示⇓)。
肾功能
血清SP-A和SP-B逆相关的肌酐吸烟者(SP-A: r年代=−0.39,p = 0.012;SP-B: r年代=−0.54,p = 0.000)和非吸烟者(SP-A: r年代=−0.38,p = 0.002;SP-B: r年代=−0.41,p = 0.001)。相反,血清CC16肌酐只有在不吸烟者呈负相关(r年代=−0.27,p = 0.036)。
当女性年龄与男性的一组中,血清肌酐在后者更多的吸烟者(1.48 (1.28 - -1.76)与1.24 (0.95 - -1.50)mg·dL−11.48,p = 0.002)和不吸烟者((1.32 - -1.76)与1.25 (0.99 - -1.61)mg·dL−1,p = 0.02)。肌酐反向反映时代的吸烟者(r年代=−0.59,p = 0.002)和非吸烟者(r年代=−0.54,p = 0.000)。
性
当女性年龄与男性的一组中,血清CC16 SP-A和SP-B相似的男性和女性非吸烟者。SP-A也是相似的男性和女性吸烟者,尽管血清SP-B高女性吸烟者(3344 (2409 - 6306)与2446年(1589 - 4101)µg·L−1,p = 0.013)和CC16较低(5.4 (2.4 - -7.6)与7.5(4.4 - -11.9)µg·L−1,p = 0.027),尽管累积吸烟暴露相似(男:14.1 (2.5 - -47.5);女:14.7 (4.0 -54)pack-yrs)。
讨论
发现而血清SP-B有密切关系,接触烟草烟雾CC16减少吸烟者。作者建议,增加SP-B反映alveolocapillary泄漏增加,而降低CC16反映烟草烟雾对克拉拉细胞的毒性作用。
在吸烟者的肺功能:气道和肺实质疾病
烟草烟雾包含2000 - 4000制剂包括一氧化碳、尼古丁、致癌物质(芳烃碳氢化合物)、氧化剂和刺激物(acrolene醛),它可以发挥毒性作用在不同级别的呼吸道(支气管和肺泡)。此外,烟草烟雾含有微粒,可以存款在细支气管和肺泡。主动吸烟,被动吸烟也可能引发生理和病理变化,改变肺完整性和功能。事实上,它是发现,FEV1减少老年吸烟者年龄与不吸烟者相比,可能反映了早期阻塞性疾病。
同时吸烟是公认的导致慢性阻塞性肺病,吸烟也会增加肺上皮通透性。急性,可逆的渗透率的变化可能出现在smoke-mediated释放血管活性的神经肽(速激肽)9航空公司而感觉神经的慢性增长可能反映了早期破坏肺泡的结缔组织20.- - - - - -22。海员和其他有毒物质在香烟烟雾增加肺中性粒细胞的数量有症状和无症状吸烟者23。“沮丧吞噬细胞”一词被创造是指无法吞噬细胞摄取或灭活异物,如。香烟烟雾玷污。在这种情况下,这将导致中性粒细胞招募和激活的恶化循环,随着外国材料继续积累,并可能最终导致慢性组织损伤。
研究设计和验证的方法
分析在这项研究已经验证了使用独立的单克隆和多克隆抗体2,15,24。的水平循环CC16, SP-A SP-B正常在本研究的受试者与先前报道的当前的作者2,3,24。虽然没有人研究过SP-B的泄漏,CC16和SP-A研究的血清水平高于那些Nomori和他的同事所描述的7,11。然而,很可能血清脂质干扰CC16决定25,26。此外,本机SP-A驻留作为低聚物与一个高度有组织的四级结构通常由18单体(Mr∼650 kDa)和不同的绑定域名磷脂、钙、碳水化合物、糖脂和脂多糖。本机SP-B还与脂质强烈关联。本研究试验过程中包含了EDTA扰乱Ca2 +脂质桥、SDS和Triton-X 100分离蛋白质,使它们免受任何相关的组件。显然,只有这样的预处理可以抗原暴露和一个真正的浓度估计。实际上,当分析重复不使用这些试剂,血清SP-A和- b决定大大减少,和描述的SP-A水平类似Nomori和同事7,11。
最后,SP-B经历广泛的翻译修饰。虽然确切性质SP-B抗原的血液仍有待澄清2,当前作者最近分析了等离子体从一个婴儿,独立消息来源的证实,两个实验室有一个常染色体隐性框架转变SP-B 121个碱基对的基因突变,导致过早终止密码子,这样也就产生不了SP-B信使核糖核酸或蛋白质。分析确定负控制证实本研究中使用的分析确实测量免疫反应性的SP-B(未公开的数据)。因此,目前的作者不相信他们的血清决定被非特异性反应活性的影响。很难想象的强相关性观察血清决定这是偶然的,鉴于分享几个结构相似的蛋白质。
在吸烟者弃权12 h,莫里森et al。23显示,50%的肺间隙锝99 m标签二乙撑三胺pentaacetate (99米Tc-DTPA)∼17分钟,而这是∼15分钟在吸烟者只有1 h投了弃权票。为了减少吸烟的小急性效应alveolocapillary泄漏,吸烟者在这项研究中弃权取血样前至少2 h。
在这项研究中,血清肌酐作为肾功能的指标,虽然感激,血清肌酐是受其他因素的影响。事实上,血清肌酐是女性比男性稍低,反向与年龄有关。当前作者相信这些小差异最可能反映肌肉而不是肾功能的变化。最后,尽管非参数分析,研究结果保持强劲时使用参数统计分析。
循环吸烟者的肺蛋白水平的决定因素
发现血清SP-B增加了吸烟者的方式受到pack-yrs和每天抽烟的数量,而血清CC16是减少吸烟者(符合以前的结果)12,13。虽然SP-A没有增加,但其含量受到烟草暴露。这些发现与Nomori和同事7,11他发现血清CC16不是吸烟者和明显不同的血清SP-A没有与吸烟的数量。很可能差异反映试验的特殊性25,26和敏感性。
凭直觉,循环的肺蛋白的水平会受到他们进入流通和等离子体间隙。
系统性的间隙
在循环,30 - 80%的低分子量通过肾小球滤过血浆蛋白27,而其余泄露到其他组织池,最终代谢或catabolised氨基酸和回收。然而,系统性的间隙不是循环水平的主要决定因素的肺急性肺损伤患者的蛋白质14和不太可能改变吸烟者在这项研究。事实上,如果肾脏循环水平的主要决定因素是肺的蛋白质,逆协会预计将与肾功能。这里,相反被发现;高水平的血清肌酐和低水平的血清CC16有关SP-A SP-B,发现最有可能反映了时代的次生效应在肌肉和肺部结构。
因此,CC16的循环水平,SP-A和SP-B必须反映“泄漏”进入循环。反过来,这可能反映了transcytosis的程度,基础分泌,浓度梯度或alveolocapillary膜的渗透性。
肺泄漏
肺蛋白质进入血液循环的路线是论战。事实上,还没有达成一致的“正常”的渗透率alveolocapillary障碍或“泄漏”网站的位置和性质。然而,人们普遍认为上皮,而非内皮,提供水和溶质运动的主要障碍。可能除外),白蛋白和其他一些蛋白质,目前没有证据表明受体介导活跃transcytosis肺泡I型和II型细胞28。限制扩散完整蛋白质的肺泡上皮细胞占> 90%的肺泡蛋白质间隙28。基底的分泌CC16 SP-A或SP-B从未被描述,然而,肺淋巴仅占总额的25%∼肺间质蛋白间隙29日。与此一致的是,当前的作者曾估计,至少在SP-A和- b,胸膜浓度和淋巴流率不足以解释发生在这些蛋白质的相对浓度变化的循环30.。吸烟降低肺的CC16水平3,31日,32和可以解释,至少在某种程度上,这种蛋白质水平降低循环的吸烟者在这项研究。然而,吸烟没有效果,或者减少,肺SP-A和- b的水平8,32- - - - - -36。因此,当前作者相信alveolocapillary渗透率的增加,而不是增加transcytosis,基底分泌或肺泡池大小,增加循环水平的主要决定因素的SP-B吸烟者。
在吸烟者Pneumoproteinaemia
血清SP-B SP-A程度较轻,与FEV呈负相关1气流/ VC和其他参数,暗示的阻塞性疾病和实质肺部健康之间的联系。虽然可以认为,这些关系是二级协会随着年龄的增长,这是不太可能给不同年龄的狭窄范围的主题进行了肺功能测试(≤10岁)和肺功能不相关的血清SP-B不吸烟者。
由于血清SP-A和- b是相关的,据推测,这两个蛋白质进入血液循环通过同样的路线,SP-B alveolocapillary泄漏的更敏感指标由于其规模较小;本机米r∼18与∼650 kDa2。由于克拉拉细胞有高含量的异型生物质新陈代谢酶,它们可能逐渐被有毒代谢产物生成的烟草烟雾通过细胞色素P450系统可能参与了吸烟者的肺实质的渐进破坏。虽然支气管肺泡灌洗液(BALF)水平CC16从烟草吸烟者通常是减少一半3,31日,32,这里的病人血清CC16只是减少了< 20%。这个微分可能反映了增加alveolocapillary泄漏负责提升循环表面活性剂蛋白质。
一致的发现在这项研究中,吸烟者不仅增加了肺的间隙99米Tc-DTPA23,37,但也增加了白蛋白漏36,38。虽然泄漏的长期增长的机制尚不清楚,最近的研究表明,这些变化与重复inflammatory-mediated急性肺损伤,增加氧化剂负载23和损耗包括谷胱甘肽的抗氧化剂37。细胞色素P450也biotransform烟草致癌物4 - (methylnitrosamine) 1 - (−3-pyridine) 1-butadone (NNK)。如果是这样,肺泡II型细胞和巨噬细胞可能对亚硝胺靶细胞毒性39。
年龄的影响
当前作者曾报道,CC16随着年龄的增加在不吸烟者13现在,他们报告说,同样也适用于SP-A和- b。的确,SP-A和- b的水平不吸烟者在这项研究在受试者∼∼50%高于之前报告25岁年轻2。在这项研究中,研究结果对于SP-A Nomori相反et al。11,正如上面所讨论的差异可能是由于检测灵敏度。
与年龄相关的结构和功能变化的肺曾被描述。气体捕获随着年龄的增加40一样,空域异常41和直径42,而肺遵从性和剪切模量降低43与肺弹性蛋白含量增加44。此外,而肺的内部表面积增加的最大∼80米2∼20岁时则减∼2.72每十年之后45。最后,增加白蛋白水平在BALF已报告从旧的主题46。没有可用的信息的影响肺泡SP-A水平或SP-B时代。然而,由于CC16表达与年龄无关47目前的作者建议,不吸烟者的年龄相关性pneumoproteinaemia反映了增加alveolocapillary泄漏和非特异性的影响肺的恶化。
血清16克拉拉细胞分泌蛋白的效用,surfactant-associated蛋白质a - b
如果一个假定血清SP-B,一定程度上SP-A,可靠地反映了肺上皮屏障的泄漏蛋白质,然后SP-A / CC16和SP-B / CC16让克拉拉细胞损伤的程度应该更好的评估,由正常化的变化CC16泄漏。即使没有这种假设,比率似乎是有用的指标,集成组件的细胞毒性和上皮屏障功能。可能pneumoproteinaemia有同等效用的概念在肾脏疾病监测蛋白尿,因为通过蛋白质在肺屏障是由肾小球滤过的相似的结构和功能特性。因此,使用不同的生物标记物,由不同地区的呼吸道,可能允许评估当前和过去的接触毒素,检测早期缺陷,识别易感个体,推导可接受的风险水平,帮助建立和公认的有毒代理人之间的因果关联影响。
研究的局限性
pneumoproteins的水平变化明显的非吸烟者。至少有一些这种多样性是由于年龄的影响。需要更大规模的研究来确定正常方差效用之前pneumoproteinaemia可以充分利用。最后,尽管尿液可替宁与受试者的自我报告吸烟状态(未显示),更好的控制研究需要标准化的各种变量与吸烟者的品牌习惯有关。然而,数据尽管这些限制进一步的力量支撑的潜在效用pneumoproteins实质肺部健康的标志。
总之,尽管alveolocapillary障碍通常是非常有效的分区肺泡上皮衬里的等离子体流体,目前的研究提供了强有力的证据表明吸烟会导致慢性肺实质的渗透性增加。在血清中,同时测定各种lung-specific分泌蛋白质代表了一个新的和原方法的无创性评估肺上皮细胞的完整性。正如所料,克拉拉细胞分泌蛋白16日surfactant-associated蛋白质a - b,这些都是非常具体的肺,都好候选标记。标记的研究到目前为止,surfactant-associated protein-B似乎最有前途的。可能,他们的决心允许细胞毒性(克拉拉细胞分泌蛋白16)区别增加上皮泄漏(surfactant-associated protein-B > surfactant-associated蛋白质a)在烟草吸烟者。
- 收到了2001年的11月2日。
- 接受2002年6月12日。
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