摘要
闭塞性细支气管炎通常解释为慢性排斥反应,累及支气管和细支气管上皮。支气管上皮细胞(BEC)主要组织相容性复合体(MHC) II的上调被认为是支气管定向排斥反应的重要触发因素。最近,在抗原提呈细胞上额外表达的共刺激分子B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)被发现在移植排斥反应中t淋巴细胞的激活中发挥重要作用。BEC表达这些分子的作用尚不清楚。
采用半定量逆转录-聚合酶链反应对肺移植受者经支气管刷拭和支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞获得的BEC进行了B7-1和B7-2信使核糖核酸(mRNA)表达的研究。肺移植后的前3个月,肺移植患者BEC中B7-1/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) mRNA比值显著升高。有趣的是,在一小组闭塞性细支气管炎综合征患者中,BEC的B7-1/GAPDH和B7-2/GAPDH比值显著升高,而BALF细胞没有发现差异。
综上所述,支气管上皮细胞表达B7信使核糖核酸可能在(慢性)同种异体肺移植排斥反应中发挥作用。
这项研究得到了德国科学研究中心的资助。406/2-1。
除了t细胞受体/主要组织相容性复合体(MHC)相互作用引起的刺激外,共刺激信号对t淋巴细胞的完全激活是必需的。B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)都是抗原提呈细胞(APCs)表面的共刺激分子。B7信号通过反受体CD28在t细胞上传递1.虽然B7-1和B7-2通常由“专业”apc表达,如巨噬细胞和单核细胞、b淋巴细胞、皮肤中的朗格汉斯细胞和树突状细胞,但也可以在上皮细胞上检测到表达。叶et al。2报道了B7-1和B7-2在人胃上皮细胞系以及胃活检分离的上皮细胞中的表达。B7表达的其他类型的上皮细胞包括来自干燥综合征患者的涎腺导管和腺泡上皮细胞3.,原发性胆汁性肝硬化或原发性硬化性胆管炎患者的胆道上皮细胞4,以及桥本氏甲状腺炎患者手术切除甲状腺组织的甲状腺滤泡细胞5.最近,金子et al。6报告B7在细支气管和肺泡上皮细胞中的表达。B7共刺激通路在移植排斥反应中发挥重要作用1.然而,B7分子与肺移植排斥反应的相关性尚未得到证实。B7通路在闭塞性毛细支气管炎(OB)发病机制中的相关性尤其值得关注,因为OB是LT术后长期随访中最重要的并发症,涉及发病率、发病率和死亡率7.本研究的目的是检测肝移植受者支气管刷活检和支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞中B7-1和B7-2信使核糖核酸(mRNA)的存在。
材料和方法
病人
每隔3-6个月对接受肺移植的患者进行肺功能测试、支气管肺泡灌洗和支气管刷活检。将患者分为3组:肝移植后早期(<3个月)(n=7);闭塞性细支气管炎综合征(BOS)患者4例;以及肝移植后无明显异体移植物功能障碍的患者(n=8)(表1)⇓)。只有临床稳定且无急性排斥反应和感染迹象(包括BALF的微生物学分析)的患者才合格。支气管肺泡灌洗时未进行常规肺活检。根据国际心肺移植学会注册标准,评估肺功能检测结果,确定诊断BOS8,但有以下例外。在BOS组中,四名患者中有三名患者在一秒内有强迫呼气量(FEV)1>为基线的80%和≤90%,但强迫中呼吸流量(FEF25% - -75%) <80%的基线后,报告FEF25% - -75%可能是检测发生BOS更敏感的标记物9.
支气管肺泡灌洗
采用柔性支气管镜将支气管肺泡灌洗至楔形位,分别注入3个肺叶,每个肺叶灌注5份20 mL 0.9% NaCl(共300 mL)。在一些患者中,由于呼吸功能下降,不得不使用较小的量(100-200毫升)。细胞保存在−70°C,直到核糖核酸(RNA)提取如下所述。
支气管刷标本
为了从气道粘膜获得细胞,有鞘支气管标本刷(产品# 149R;(Mill Rose Laboratories, Mentor, OH, USA)通过支气管镜的操作通道,放置在支气管段内,轻轻前后推。在将针尖缩回保护套后,将刷子去掉。为了获得足够数量的细胞,这个过程重复了5次。将细胞在盐水溶液中轻轻摇匀,将其从刷子上轻轻移除,随后将其保存在−70°C。使用Coulter计数器(Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA)测定细胞总数。从玻片制剂中获得每个样品的细胞差异,用May-Grünwald-Giemsa染色。
半定量聚合酶链反应
将冰冻的上皮细胞裂解,提取RNA并将其逆转录为互补脱氧核糖核酸。以下特异性引物用于扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH;作为参照的管家基因),B7-1和B7-2。GAPDH:转发:5“-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3”;反序:5 ' -CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 '(聚合酶链反应产物大小:900碱基对(bp))。B7-1:转发:5“-AGTACAAGAACCGGACCATC-3”;反向:5 ' -GGCGTACACTTTCCCTTCTC-3 ' (PCR产物大小:605 bp)。B7-2: Forward: 5 ' AGGACAAGGGCTTGTATCAA-3 ';逆序:5 ' ATTGCTCGTAACATCAGGGA-3 ' (PCR产物大小:332 bp)。GAPDH的循环条件为:94°C for 3 min/94°C for 45 s/60°C for 45 s/72°C for 1 min for 24个循环,然后在72°C下延长10 min。 The same cycle conditions were used for B7-1 and B7-2. The annealing temperature and PCR cycles for B7-1 and B7-2 were 60°C and 40 cycles, respectively. In preceding experiments the linearity of the mRNA amplification had been determined and ranged from 37–45 cycles (data not shown). Products were electrophoresed on a 1% agarose gel and viewed using a 300 nm ultraviolet (UV) transilluminator (Cybertech, Berlin, Germany). Samples from reverse transcription reactions, which did not contain reverse transcriptase, served as negative controls. For quantification, PCR bands were stained with ethidium bromide (Sigma, Munich, Germany) and scanned with a UV densitometer (Cybertech). The intensity of the B7-1 and B7-2 bands was corrected for the housekeeping gene GAPDH. To confirm that the correct PCR products had been amplified, the gel bands were excised from the gel and sequenced (TopLab, Martinsried, Germany).
统计数据
所有数据均表示为平均值±sem。采用Mann-Whitney秩和检验比较数据的显著差异。
结果
支气管刷样的细胞差异
使用支气管刷扫技术的支气管上皮细胞的返回率在BOS患者中为79%,在无BOS患者中为95%,污染巨噬细胞的数量很低(3-6%)(表2)⇓)。与移植后3个月的患者(3%)和未移植患者(1%)相比,在BOS患者中收获了更多的中性粒细胞(15%)。这一有趣的发现解释了BOS患者支气管上皮细胞的相对产量略低的原因。
支气管刷状活检收集的细胞B7-1和B7-2信使核糖核酸水平
与非BOS患者相比,LT后3个月和BOS组的B7-1 mRNA水平均显著升高(p<0.005)。BOS组的B7-2 mRNA水平高于非BOS组,差异均有统计学意义(p<0.05)(图1)⇓)。
支气管肺泡灌洗液样本的细胞差异
巨噬细胞是三组患者的主要细胞类型(占总细胞的63-87%)(表3)⇓)。BOS患者的特点是,在肝移植后的前3个月,与对照组(5%)和无BOS患者(11%)相比,BOS患者(31%的总细胞)中可以观察到更多的中性粒细胞(绝对和相对计数)。
支气管肺泡灌洗液细胞B7-1、B7-2信使核糖核酸水平
BALF细胞中B7-1和B7-2 mRNA表达无显著差异(p=0.683)(图2)⇓)。
讨论
明显B7-1 mRNA水平升高的支气管上皮细胞中发现了病人检查肝移植后早期(< 3个月)相比,患者没有LT功能障碍的证据> 3个月后患者群BOS中尉显示严重超标costimulatory分子B7-1和B7-2相比病人无肝移植功能障碍(肝移植后3个月>)。考虑到BOS患者正常肺和移植肺的主要细胞为巨噬细胞,BALF细胞中发现B7-1和B7-2 mRNA。由于B7-1和B7-2 mRNA在BOS患者和无明显肝移植功能障碍的患者之间无显著差异,肺泡巨噬细胞共刺激在肝移植后患者中的作用尚不清楚。尽管有统计学意义,但在这一点上,由于本组患者数量较少(n=4), BOS患者中B7-1和B7-2 mRNA水平升高需要仔细解释。
该研究的另一个局限性是,差异仅通过相对mRNA水平的比较显示,即使GAPDH在逆转录酶-PCR中被广泛使用并被接受为内标,也不能保证该管家基因的恒定表达水平。理论上,半定量RT-PCR检测的B7-1和B7-2 mRNA可能来源于支气管刷标本中污染的巨噬细胞。然而,有几个论点反对这一假设:1)通过刷状活检收集的巨噬细胞数量与B7-1或B7-2的信息之间没有发现相关性;2)在未检测到巨噬细胞污染的样品中可以检测到大量的B7-1和B7-2 mRNA;3)为PCR条件(循环次数,等。B7-1和B7-2在低数量(3-6%)污染的巨噬细胞中含量如此之高,这是意料之外的。
这里研究的患者临床稳定,没有急性异体排斥反应,巨细胞病毒肺炎,细菌或病毒感染的证据。因此,共刺激分子在支气管上皮细胞上的上调是否是BOS特异性的,还是在其他多种病理条件下也会发生,目前尚不清楚。
有趣的是,在本研究中,特发性肺纤维化最近被描述为细支气管和肺泡上皮细胞中B7-1和B7-2的表达6在LT(<3个月)后早期检查的7例患者中,有5例是基础疾病。与非bos患者相比,该组B7-1 mRNA水平显著升高(p<0.005)。虽然不太可能,但B7-1 mRNA水平升高与这些患者移植前疾病相关的事实不能排除。
众所周知,有效的同种免疫反应需要t细胞激活,而要实现完全激活,就需要像B7-1和B7-2这样的共刺激分子与MHC II协同作用1.B7-1和B7-2的重要性得到了动物和人类研究的支持,融合蛋白CTLA-4-Ig阻断了B7-CD28通路。在灵长类动物同种异体肾移植模型中,CTLA-4-Ig能够预防和挽救同种异体肾移植排斥反应10.在组织不相容同种异体骨髓移植的患者中,使用CTLA4-Ig诱导同种异体抗原特异性无能导致急性移植的发生率非常低(11例中3例)与宿主病11.在正常情况下,实质供体细胞缺乏B7共刺激分子,而专业APCs介导的移植受体间接的同种异体抗原呈递被认为是移植后长期t细胞激活的主要途径1.然而,这一概念主要基于啮齿动物实验,没有考虑到最近关于B7在人类细胞上表达的报道,这些细胞不属于专业apc,例如来自不同组织包括肺的上皮细胞2- - - - - -6.与B7分子的表达不同,人类支气管上皮细胞表达MHC II抗原12.
共刺激分子发现之前,发现OB患者LT后支气管上皮细胞MHC II分子表达增强13以及同种异体动物肺移植模型14导致了一种假设,即OB是由支气管上皮发起并指向支气管上皮的排斥过程。本研究中显示的BOS患者B7-1和B7-2 mRNA水平升高的结果为这一假设提供了新的线索。目前尚不清楚B7-1和B7-2在上皮细胞中的表达是如何调控的。通常细胞间的相互作用,细胞因子(如。白介素-4、干扰素-γ)或细菌内毒素是调控B7-1和B7-2表达的因素15.推测供体上皮与受体细胞的接触、反复或潜伏的病毒感染(如。或细菌感染和定植(如。假单胞菌(pseudomonas species))在气道内产生炎症性千微粒,导致上皮细胞上B7分子的上调。
综上所述,目前的数据支持支气管上皮细胞可能在(慢性)同种异体肺移植排斥反应中发挥主动免疫作用的假设。肺上皮细胞在闭塞性毛细支气管炎发病机制中的作用有待进一步研究。
- 收到了2001年8月1日。
- 接受2002年2月8日。
- ©ERS期刊有限公司