文摘gydF4y2Ba
Nonantimicrobial抗生素可能导致的影响他们的活动感染呼吸道疾病的治疗。本研究的目的是确定感染的抗生素用于治疗囊肿性纤维化,可能改变人类中性粒细胞弹性蛋白酶的活性(HNE)和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba弹性蛋白酶(PE)。gydF4y2Ba
抗生素的作用净化HNE和体育活动,并使用colourimetric HNE痰是评估和动态测量荧光底物测定,并与抑制剂通过检查HNE之间的相互作用。gydF4y2Ba
头孢他啶、妥布霉素和庆大霉素稍微抑制纯化HNE活动而红霉素和粘菌素显著刺激纯化HNE和PE(分别为557%和395)。然而,只有粘菌素增加痰HNE活动(+ 102%),因此更详细地研究。这种活动的增加不是因为特定的抑制的干扰HNEαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶但粘菌素被发现扭转的抑制性影响小分子量分子肝素。gydF4y2Ba
粘菌素增加人类中性粒细胞弹性蛋白酶的活性gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba弹性蛋白酶,蛋白酶两个导致囊性纤维化呼吸道疾病的发病机理。gydF4y2Ba
这项研究部分由谢菲尔德医院儿童基金会。gydF4y2Ba
抗生素用于治疗肺部感染代表的基石之一治疗囊性纤维化患者(CF)。多种抗生素用于治疗支气管感染的目的延迟进步肺损害这一疾病的特征。这种损坏是由于过度蛋白酶来源于中性粒细胞招募到气道等应对传染性生物体gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。后者生物也产生嗜热菌蛋白酶如弹性蛋白酶,可以直接导致组织损伤以及灭活主机antiproteinases如αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。积极的抗生素治疗结合物理疗法能有效治疗感染性急性加重,还可以消除,或延迟,假单胞菌等病原体的入侵gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
最近的研究表明,如大环内酯类、氨基糖甙类抗生素可能有益nonantimicrobial行为和这些可能导致临床使用这些药物时观察到的好处gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。大环内酯类似乎可能有益影响细胞因子的生产gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,中性粒细胞趋化性gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,抑制蛋白酶gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba海藻酸和抑制假单胞菌生物膜的合成gydF4y2Ba12gydF4y2Ba。它也被报道,氨基甙类抗生素,如妥布霉素和庆大霉素,有益nonantimicrobialgydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba弹性蛋白酶(PE)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本研究的目的是调查是否其他常用抗生素管理CF患者改变HNE的活动和体育。粘菌素的相互作用与HNE详细探索,随着抗生素的发现刺激蛋白酶的纯化形式和CF痰。的机制,导致蛋白酶活动增加了对直接影响HNE蛋白酶抑制剂与酶的相互作用,。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
患者样本gydF4y2Ba
痰液样本收集与伦理批准10 CF青少年和成人患者(6个男性,平均年龄15.6岁,范围9-22岁)在常规理疗。CF的所有患者的诊断证实了积极的汗水测试。所有的患者长期殖民gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba(一个病人还证实了gydF4y2BaBurkholdera不过gydF4y2Ba感染)和采集标本在急性恶化(平均一秒钟用力呼气量在47%的正常范围的21 - 70%)。立即收集样本离心机使用贝克曼J2-21离心机(美国贝克曼库尔特部门,帕洛阿尔托,CA)在4°C和35000×gydF4y2BaggydF4y2Ba150分钟澄清样本和去除细胞碎片和大型脱氧核糖核酸(DNA)碎片。gydF4y2Ba
弹性蛋白酶colourimetric活动分析gydF4y2Ba
HNE的活动(弹性蛋白preoducts Inc .,欧文斯城镇,密苏里州,美国)测量与特定的肽底物methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-4-nitroanilide (MSAAP)(σ化学品,普尔,英国)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba和纯化HNE或样本稀释测定缓冲区(0.1羟乙基哌嗪乙磺酸(玫瑰),0.5 M氯化钠,0.02 CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,pH值7.5)gydF4y2Ba14gydF4y2Ba。探讨抗生素或HNE抑制剂的影响,HNE和测试剂加在一起10分钟(在20°C)其次是MSAAP·毫升(0.6毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。测量样品一式三份,每个实验至少重复两次。底物和酶的混合物被孵化≤2 h (20°C)和测量在410纳米吸收能力Titretek Multiskan MCC / 340 colourimetric platereader (ICN流实验室)。标准曲线的纯化HNE(范围2 - 0.02 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)是包括在试验。gydF4y2Ba
抗生素对蛋白酶活性的影响gydF4y2Ba
调查是否抗生素刺激或抑制HNE的活动,净化HNE (2 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和痰液样本混合抗生素庆大霉素的0.5 - -0.05毫米范围(巴克斯特,塞特福德,英国)、庆大霉素(+乙二胺四乙酸),ceftadizime(礼来、汉普郡、英国),妥布霉素(Eli Lilly)、红霉素(雅培,肯特,英国)和粘菌素。这些抗生素的效果测量10分钟后pre-incubation紧随其后MSAAP衬底的之外,没有抗生素和蛋白酶相比活动。对于那些抗生素可用生理盐水或缓冲区,类似这个稀释剂的体积没有抗生素添加到其他井建立是否有干扰物质影响蛋白酶活性。粘菌素也调查进一步检查其剂量效应(3.9 -500µM)在纯化HNE (2 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和HNE痰内活动。比较相似的存在剂量依赖的相关性影响洗涤剂Brij-35(3.9 -500µM)化学(σ)和多粘菌素B(σ的化学物质)。粘菌素和Brij-35也增加了(50和500µM) 10 CF患者痰液样本比较HNE的活动的影响。gydF4y2Ba
荧光猝灭化验gydF4y2Ba
建立改变HNE活动是否也会影响大分子基质的降解,荧光色胎盘iv型胶原蛋白,明胶,Biodipy FL酪蛋白(分子探针公司,尤金,俄勒冈州,美国)。纯化HNE (0.5 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或痰,孵化了粘菌素(62.5 -500µM)稀释测定缓冲区(0.1 M消息灵通的,0.5 M氯化钠,0.02 M CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,pH值7.5)。10分钟后pre-incubation,样本添加到荧光底物在µg·50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(明胶和IV型胶原蛋白)和5µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(酪蛋白)。样品混合,在37°C湿润孵化器孵化24 h和增加荧光测量的激发波长485 nM和530 nM发射Denley荧光platereader (Denley科学、绝望、伯克希尔哈撒韦公司、英国)。基质降解的变化来衡量样品没有抗生素(或洗涤剂)但同等体积的缓冲。控制包括基质和抗生素组合没有样本,和缓冲和基质,但没有抗生素。自发荧光背景的抗生素或缓冲组件被发现非常低,但相对于样本数据。每个基质产生了不同程度的荧光,结果是标准化的成倍增加单位的荧光在24 h控制和孵化的样本有500µM粘菌素。gydF4y2Ba
弹性蛋白酶抑制剂有或没有粘菌素的影响gydF4y2Ba
确定粘菌素干扰抑制HNE由低分子量和特定的对手,竞争实验进行。α的影响gydF4y2Ba1gydF4y2Ba——(37.9 nM-7µM)gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-chloromethyl酮(MSAAPket;化学σ)(5 nM-50µM)gydF4y2Ba15gydF4y2Ba和肝素(15.6 ng-1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba16gydF4y2Ba测试在4 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba纯化HNE和CF痰液样本。αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——、MSAAPket和肝素被用于有效抑制剂量为50% (IDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)和90% (IDgydF4y2Ba90年gydF4y2Ba)水平与不同浓度的抗生素浓度和pre-incubated 10分钟,其次是增加纯化HNE和底物。光密度的变化(OD)在410 nM记录活动每隔2分钟30分钟(在20°C)。为每个条件的增加OD是策划和线性回归模型被用于配合最好的线。控制包括酶和抑制剂,但没有抗生素,酶和抗生素、酶和测定缓冲区。这些抑制剂对HNE活动的有效性在痰液样本抗生素的存在也决定在一个时间点(30分钟)。gydF4y2Ba
动力学分析gydF4y2Ba
粘菌素的影响在HNE-substrate动力学相互作用测量的最大初始反应速度(gydF4y2BaVgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)和KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba(底物浓度的一半gydF4y2BaVgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)。这些值确定活动随着MSAAP衬底(0 - 2毫克·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)浓度在500µM粘菌素和2 U·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba的痰HNE 20°C。OD的增加是测量每隔2分钟30分钟的OD 410 nM和的值gydF4y2BaVgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba测定Michaelis-Menten计算。gydF4y2Ba
抗生素的影响的活动gydF4y2Ba假单胞菌aeuruginosagydF4y2Ba弹性蛋白酶gydF4y2Ba
是否抗生素修改另一种蛋白酶的活性与CF的发病机理,25 nM PE是孵化有或没有50和500µM浓度红霉素,粘菌素、妥布霉素、庆大霉素和ceftazidine。酶和抗生素混合第一和孵化了10分钟,然后加入荧光底物。变化的荧光底物记录如前所述。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
抗生素和洗涤剂对纯化的影响或痰HNE分析意义的Mann-Whitney Kruskall-Wallis u测验和方差分析的过程。抑制剂研究的最佳线路被线性回归计算,每个斜坡的梯度差异的学习任务。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
抗生素在人类中性粒细胞弹性蛋白酶活性的影响gydF4y2Ba
使用肽链型基质测定头孢他啶、妥布霉素和庆大霉素引起抑制HNE活动的42%,分别为30%和28%(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。相比之下,红霉素和粘菌素显著刺激HNE活动(分别为395%和557%)。这刺激并不是由于缓冲区用来溶解的组分抗生素。然而,粘菌素储存在4°C > 7天刺激HNE逐渐失去了它的能力。gydF4y2Ba
粘菌素和红霉素刺激gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba弹性蛋白酶gydF4y2Ba
粘菌素、妥布霉素,在更大程度上红霉素,刺激了体育测量时退化Biodipy酪蛋白(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。其他抗生素没有刺激体育活动。这一活动的特异性phosphoramidon时确认,thermolysin-like酶的抑制剂,添加(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
粘菌素刺激的活动净化人类中性粒细胞弹性蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶在囊性纤维化痰gydF4y2Ba
测试的抗生素只有粘菌素刺激的活动在CF HNE痰。在增加粘菌素浓度(3.9 -500µM)纯化HNE和HNE痰显著刺激剂量依赖性的方式(数据没有显示)。粘菌素的纯化HNE, 3.9µM足以增加活性显著高于对照组(162%,p < 0.01),观察和最大刺激250µM (877%, p < 0.001)。10 CF的痰样本增长36%以上背景活动观察到32µM粘菌素(n = 10, p < 0.05)和活动增长102% 500µM (n = 10, p < 0.05)。在500年获得的刺激µM粘菌素57 - 135%之间变化。gydF4y2Ba
粘菌素增加了高分子基板的弹性蛋白酶降解gydF4y2Ba
粘菌素的刺激效应也发现HNE影响大分子底物的降解。HNE显著增加退化凝胶(36%),IV型胶原蛋白(39%),和酪蛋白(27%)在粘菌素(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,p < 0.05)。粘菌素单独并没有改变这些底物的荧光(数据未显示),和HNE优先退化IV型胶原蛋白/明胶、酪蛋白(图。3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。然而,增加HNE活动测量高分子基质没有那样伟大的测量与肽链型基板(图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
洗涤剂增加人类中性粒细胞弹性蛋白酶的活性gydF4y2Ba
演示detergent-like粘菌素的性质是否负责增加HNE的活动,Brij-35(3.9 -500µM)添加到缓冲和被发现显著增加最大酶活性在7.5µM (p < 0.001)。高33倍粘菌素的浓度(250µM)是需要刺激的活动HNE相同的水平。添加浓度从3.9 -500µM相关抗生素多粘菌素B也以相同的方式刺激HNE粘菌素(多粘菌素E)(数据没有显示)。gydF4y2Ba
粘菌素与低分子量的弹性蛋白酶抑制剂gydF4y2Ba
α的抑制浓度范围gydF4y2Ba1gydF4y2Ba——,MSAAPket和肝素纯化HNE决心和集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba和集成电路gydF4y2Ba90年gydF4y2Ba每个代理都有或没有的存在增加了500个µM粘菌素。gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶gydF4y2Ba
在900纳米和60 nMαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——完全抑制HNE活动(60 nM剂量数据显示在图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba独自HNE相比)。单独添加500µM粘菌素显著增加的活动纯化HNE(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。粘菌素无法逆转的抑制性影响900海里(数据未显示)和60 nM(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——对HNE活动。gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba——(Methoxysuccinyl) -ala-ala-pro-val-chloromethyl酮gydF4y2Ba
MSAAPket抑制HNE完全µM 5点和一定程度上在0.5µM(图4 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。单独添加500µM粘菌素显著增加的活动纯化HNE(图4 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。粘菌素无法逆转的抑制性影响5µM MSAAPket但逆转的影响0.5µM MSAAPket(图4 bgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),尽管活动并不好当粘菌素单独添加到酶。gydF4y2Ba
肝素钠gydF4y2Ba
肝素抑制HNE活动完全1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(数据没有显示)和15.6 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(图4 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。单独添加500µM粘菌素显著增加的活动纯化HNE(图4 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。粘菌素能部分逆转µg·1毫升的影响gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba肝素(数据未显示),15.6 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba肝素(图4 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)上方的活动增加进一步控制而不是水平观察粘菌素单独添加到HNE时。gydF4y2Ba
粘菌素改变弹性蛋白酶的动力学行为gydF4y2Ba
粘菌素增加了动力学HNE MSAAP衬底相互作用。的值gydF4y2BaVgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba0.0043吸光度的变化速度在410 nm·分钟吗gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(ΔAgydF4y2Ba410年gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和0.0946 HNEΔA单独和0.0576gydF4y2Ba410年gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba分别和0.0776对HNE和粘菌素。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
喷雾粘菌素多年来一直用于治疗CF患者和在许多国家仍然是最广泛使用的喷雾抗生素。它已被证明是有价值的消除gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba最近在病人殖民与生物体及其使用已经被证明可以减少被感染患者的恶化gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。之前报道的有利影响是令人惊讶的发现粘菌素增加HNE提纯制剂和痰的活动以及体育。gydF4y2Ba
这些意想不到的结果可能是慢性殖民患者的临床意义gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba长期治疗的喷雾粘菌素。同时发表的试验使用喷雾粘菌素治疗时间≤3个月gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,许多长期殖民病人接受喷雾粘菌素长时间。在此设置可能增强HNE和体育活动将大于积极的抗菌效果的代理。最近的一项研究提供了gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba证据表明,长期管理粘菌素与气道损伤大鼠和狗(Van缆车,凯龙星公司,西雅图,佤邦,美国个人通信)。gydF4y2Ba
是感兴趣的粘菌素刺激HNE和PE、丝氨酸和thermolysin-like蛋白酶,分别。对HNE的影响被认为在痰液样本抗生素浓度与剂量喷雾假设异构交付10 - 20%的服用剂量gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。不幸的是,缺乏一个特定底物防止粘菌素对CF痰中体育活动的影响评估。粘菌素提高HNE的机制尚不清楚,尽管这项研究的结果表明,其作用是通过代理的能力进行调节的干扰某些抑制剂分子的绑定。得到一个相同的剂量依赖性刺激HNE抗生素多粘菌素b多粘菌素有关,包括粘菌素、小环多肽与detergent-like属性对革兰氏阴性细菌的活动gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。它曾被观察者洗涤剂Brij-35能够激活HNEgydF4y2Ba20.gydF4y2Ba这种效应可能是通过一个类似的机制介导的。gydF4y2Ba
除了antiproteases,如αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——(或αgydF4y2Ba1gydF4y2Baantiprotease)和分泌leukoproteinase抑制剂,分泌物发炎航空包含分子肝素/硫酸乙酰肝素gydF4y2Ba16gydF4y2Ba和DNAgydF4y2Ba21gydF4y2Ba,这也抑制HNE活动。肝素结合带正电荷的负电荷组织弹性蛋白酶及其抑制可能占的活动gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。在此本研究低浓度的肝素抑制HNE但未能这样做500年存在µM粘菌素(图4 cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。相比之下,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——有效地抑制HNE即使粘菌素。粘菌素扰乱了肝素的结合能力HNE但无法扰乱稳定不可逆inhibitor-complexes形成αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——。粘菌素的能力提高CF痰HNE活动表明,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba——仅占的比例HNE抑制剂在CF痰,一些酶可能会绑定到肝素分子,形成一个池容易激活。gydF4y2Ba
为什么净化HNE显示增加10倍gydF4y2BaVgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba对粘菌素目前不太清楚。HNE准备从痰或纯化中性粒细胞出现纯在银染色聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(数据未显示)但可能含有小分子污染物,如肝素等。许多发表的研究,HNE活动测量没有报告包含测定洗涤剂的缓冲区。因此,测量条件HNE活动净化或呼吸道分泌物需要仔细定义Brij-35包含缓冲区在精确测量HNE的活动起着至关重要的作用。很可能的减少活动粘菌素添加到CF痰时由于抗生素的吸收到其他带电分子,因为这液体含有高浓度的蛋白质和DNA。同样,HNE抑制剂添加到痰时,不如当添加到一个等价的活动有效的纯化HNE(未发表的观察)。gydF4y2Ba
总之,人类嗜中性粒细胞和粘菌素增加了活动gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba弹性蛋白酶,这都被认为是重要的慢性肺部疾病的发病机理囊性纤维化的特征。目前的研究还表明,粘菌素增加了人类的活动在囊性纤维化痰中性粒细胞弹性蛋白酶。这些结果表明,还需要进一步的临床研究。这些研究应该包括痰弹性蛋白酶活动的测量,和组织损伤的标志(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba尿液的胶原蛋白和弹性蛋白片段)前和postcolistin吸入。这需要招聘大量的病人由于个体之间的显著变化观察痰标记。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢谢菲尔德医院儿童基金对金融支持和k Morihara(750年东亚山口大学,日本)的净化gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba弹性蛋白酶。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2001年3月26日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2002年1月18日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba