文摘gydF4y2Ba
之前的研究表明,表面活性剂脱辅基蛋白(SP-A)和天然或合成表面活性剂可以调节肺泡单核吞噬细胞的促炎细胞因子的释放。gydF4y2Ba
本研究的目的是评估SP-A或表面活性剂(冲浪)患者肺肺泡蛋白质沉积症(PAP)会影响两个趋化因子的释放(白介素8 (IL)和单核细胞chemtactic肽(MCP) 1)从人类单核细胞和鼠肺ⅱ型细胞。除了引发和MCP-1水平评估brochoalveolar灌洗液(BALF)七PAP患者并与那些在一组对照组(n = 5)。gydF4y2Ba
SP-A,测试在一个广泛的浓度,显著增加引发和MCP-1释放单核细胞。胶原酶消化后SP-A保留其活动,但热处理后并不活跃。引发的释放单核细胞也刺激了冲浪。最后,BALF中位数引发和PAP患者MCP-1水平显著高于控制(9.50和9.51 pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在控制gydF4y2Ba与gydF4y2Ba151.95和563.70 pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba分别在PAP)与BALF SP-A浓度显著相关。gydF4y2Ba
总体认为,这项研究的结果支持高含量的肺泡表面活性剂脱辅基蛋白可能导致upregulation肺肺泡蛋白质沉积症的趋化因子的释放,从而导致气道炎症。gydF4y2Ba
- 趋化因子gydF4y2Ba
- interleukin-8gydF4y2Ba
- 单核细胞趋化peptide-1gydF4y2Ba
- 肺肺泡蛋白质沉积症gydF4y2Ba
- 表面活性剂gydF4y2Ba
- 表面活性剂apoprotein-AgydF4y2Ba
肺表面活性物质是一个复杂的磷脂和蛋白质的混合物,其主要功能是降低表面张力在肺部的气液界面,从而防止肺泡崩溃结束时到期。主要surfactant-associated蛋白质表面活性剂脱辅基蛋白(SP-A), c型凝集素家族的成员还包括SP-D。这些蛋白质共享一个collagen-like域和域,结合碳水化合物calcium-dependent方式(CRD)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。归因于SP-A几个函数,包括防御病原体的调制gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。事实上,SP-A增强了附件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba趋化作用,吞噬作用和氧依赖性的杀戮gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba14gydF4y2Ba特定的呼吸道病原体在单核细胞和肺泡巨噬细胞。此外,SP-A刺激许多促炎细胞因子的生产由人类ⅱ型细胞和单核细胞gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba和释放肿瘤坏死因子(TNF) -α白介素(IL) 1β,IL - 6和引发的单核细胞的THP-1细胞系gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。的影响SP-A TNF-α释放被表面活性剂抑制脂质,建议在生理条件下的影响SP-A可能抵消其他表面活性剂组件。促炎细胞因子之一,极大的兴趣已经给趋化因子,一个家庭的蛋白质,其主要生理功能是某些白细胞亚种群的迁移的选择性控制网站的炎症。两个趋化因子,引发和单核细胞趋化现象的肽1 (MCP)已被证明在一些病理中发挥作用的肺条件,包括感染、肺纤维化疾病gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。引发的主要细胞来源和MCP-1肺巨噬细胞,ⅱ型细胞gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
摘要SP-A或未分离表面活性剂的影响引发和MCP-1释放人类单核细胞和鼠肺ⅱ型上皮细胞进行了研究。发现SP-A刺激引发和MCP-1释放,浓度在支气管肺泡灌洗液(BALF)的患者影响肺肺泡蛋白质沉积症(PAP),一个条件过多的表面活性剂组件(尤其是SP-A)的航空公司,是测量。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗(BAL)收集从七个特发性PAP患者和5个志愿者没有肺部疾病。七PAP患者属于一群12个学科进入整个lung-lavage亲自到圣马特奥的计划,帕维亚gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。特发性PAP的诊断是由肺活检,SP-A测量在支气管肺泡灌洗液(BALF),高分辨率计算机断层扫描和排斥潜在的条件。七个PAP患者27-56岁男性和两个女性(5)年(平均年龄43岁)。五个影响志愿者(三个男人和两个女人)22-51岁(平均39岁)岁已经落下帷幕,因为咯血或来历不明的咳嗽。所有参与者给了他们的知情同意这项研究伦理委员会批准的史di Ricovero e看台Carattere Scientifico,圣马特奥,帕维亚。Fibreoptic支气管镜检查如前所述gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。BAL细胞数,用于cytospin准备。BALF用于浊度的白蛋白测定(美国贝克曼、沥青、钙),由超滤浓缩(Centriplus-3;Amicon Inc .)、贝弗利,妈,美国)和存储在−80°C。gydF4y2Ba
隔离的人性的表面活性剂、表面活性剂脱辅基蛋白gydF4y2Ba
人类表面活性剂(冲浪)从BALF纯化获得PAP患者gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。BALF离心机在85000×gydF4y2BaggydF4y2Ba45分钟,颗粒悬浮在5毫米N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic(玫瑰),1毫米CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba2 M蔗糖,pH值在100000×7.4和离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba16 h在SW 28转子。浮动材料悬浮在5毫米玫瑰,145毫米氯化钠,CaCl 1毫米gydF4y2Ba2gydF4y2BapH值7.4,沉淀在85000×gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟和颗粒悬浮在蒸馏水和存储在−80°C。gydF4y2Ba
SP-A孤立了丁醇萃取PAP患者BALF的描述gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。孤立的纯度SP-A证实了二维凝胶电泳和银染色或通过放射自显影法与125标签后碘gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。SP-A是溶解在5毫米三(羟甲基)氨基甲烷pH值7.4 1 mg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba并存储在−80°C。gydF4y2Ba
在一些实验中,热处理SP-A(煮15分钟)或减少和烷基化SP-A (ALSP-A)。ALSP-A, SP-A孵化了0.1米二硫苏糖醇1 h在37°C,然后0.1碘乙酰胺的添加和孵化持续了1 h在黑暗中在室温下,在广泛的透析对5毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4。gydF4y2Ba
在其他的实验中,collagenase-resistant片段(CRF) SP-A准备如前所述gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。简单地说,0.5毫克SP-A 50毫米三,CaCl 2毫米gydF4y2Ba2gydF4y2BapH值7.4,孵化24 h在37°C的250单位的胶原酶iii型gydF4y2Bahistolyticum梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba美国圣地亚哥(Calbiochem CA)。然后,消化的缓冲区组成SP-A改为绑定缓冲(BB: 5毫米三,100毫米氯化钠,CaCl 25毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,pH值7.4)通过缓冲交换10 DG列(生物Rad,赫拉克勒斯、钙、美国)。消化SP-A被应用到一个2毫升mannose-sepharose 4 b列预平衡与BB,和未装订的材料与10卷的BB被冲走了。消化SP-A被筛选了5卷5毫米三,100毫米氯化钠,乙二胺四乙酸2毫米,pH值7.4。gydF4y2Ba
SP-A浓度是衡量抗原抑制酶联免疫吸附试验(ELISA)gydF4y2Ba27gydF4y2Ba和总是表达为µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。净化人类的脂质/ SP-A比率计算表面活性剂1:179。gydF4y2Ba
所有准备的冲浪或SP-A检测内毒素污染的鲎变形细胞溶解产物测定(Limusate Haemachem公司,密苏里州的圣路易斯,美国)。一些实验也进行内毒素免费SP-A (ef-SP-A)与多粘菌素纯化B-agarose和octyl-glucopyranoside(σCheminal Co,圣路易斯,密苏里州,美国)如前所述gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
所有集中冲浪和SP-A准备也评估引发的内容,MCP-1 TNF-α和干扰素(IFN) -γ。后两个因素是上调由单核细胞趋化因子释放。细胞因子水平总是低于检测商业分析的局限性。在一些实验中使用2 Mα-methy——SP-A准备gydF4y2BaDgydF4y2Ba-mannopyranoside(奥德里奇化学、Steinheim、德国)30分钟在室温下,分离水和用于单核细胞的刺激。gydF4y2Ba
单核细胞文化gydF4y2Ba
人体外周单核细胞(跨国公司)隔绝巴菲外套献血者的密度梯度离心法在Ficoll-Hypaque(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典):450×gydF4y2BaggydF4y2Ba20分钟20°C。跨国公司是洗两次,悬浮在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)介质(西格玛化工有限公司),统计和坚持2 h在37°C的氛围中5%二氧化碳(有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。不依从细胞培养在RPMI介质(添加抗生素(西格玛化工有限公司)和2毫米谷氨酰胺)±不同的刺激。收集浮在表面的游离是储存在−80°C。gydF4y2Ba
肺大鼠ⅱ型肺泡上皮细胞隔离和文化gydF4y2Ba
刚分离大鼠ⅱ型肺泡上皮细胞获得如前所述gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba。ⅱ型细胞被播种在3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在24-well菜肴和培养与或没有ef-SP-A 72 h。gydF4y2Ba
髓过氧物酶释放试验gydF4y2Ba
髓过氧化物酶的生物测定人类嗜中性粒细胞释放gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba被用来确定不同刺激的活动。其中包括重组大鼠细胞因子诱导中性粒细胞chemoattractant-1 (CINC-1)(研发系统,明尼阿波利斯,美国),formyl-methionyl-leucyl-peptide (FMLP)引发的上层清液培养大鼠ⅱ型细胞。化验是cytochalasin-B预处理获得的人类中性粒细胞和髓过氧化物酶的释放与ⅱ型细胞培养上清液与刺激后,获得CINC-1和引发。此外,CINC-1或二型上层清液在室温下也preincubated 60分钟20µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba阻止反rat-CINC-1多克隆抗体(研发系统)。gydF4y2Ba
Interleukin-8 peptide-1单核细胞的趋化作用,肿瘤坏死factor-αinterferon-γ决定gydF4y2Ba
人类引发的浓度,人类MCP-1和TNF-α量化了酶联免疫试剂盒(研发系统),而人类IFN-γ和老鼠MCP-1评估设备购买的单子叶植物(美国马Wolburn)。化验是一式两份和结果表示为±sd方法。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
结果表示为±sd 5 - 9不同的实验手段。考虑到非正态分布的变量,应用非参数测试(Wilcoxon符号秩检验,Mann-Whitney紫外线测试,和斯皮尔曼等级相关系数)。意义接受的程度是5%。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
净化人类的影响表面活性剂脱辅基蛋白peptide-1 interleukin-8和单核细胞的趋化作用释放人类单核细胞和鼠肺ⅱ型细胞gydF4y2Ba
SP-A的影响引发和MCP-1释放人类单核细胞24小时后刺激如图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba。SP-A调节引发释放单核细胞(图1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。最低浓度诱导一个重要影响是1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba最高是10µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。的影响SP-A引发是由于刺激活动gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba趋化因子的合成,因为增加2毫米环己酰亚胺在文化SP-A废除引发释放单核细胞(数据没有显示)。MCP-1释放单核细胞也受到SP-A但重大活动明显只有10µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(图1 bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。的刺激活动SP-A并非由于脂多糖(LPS)污染的准备工作。所有SP-A和表面活性剂准备,有限合伙人含量< 0.001 ng·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2BaSP-A。此外,没有减少SP-A活动中发现的存在1µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba多粘菌素b Ef-SP-A保留一个鼓舞人心的活动引发类似的SP-A只有丁醇萃取纯化(表1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
自ⅱ型细胞趋化因子的另一个重要的细胞来源肺部,ef-SP-A在新鲜分离的影响大鼠肺ⅱ型细胞进行了测试,确定生物,通过髓过氧物酶释放试验,大鼠的释放CINC-1(人类引发的鼠对应)和评估释放鼠MCP-1 ELISA。大鼠ⅱ型细胞产生中性粒细胞刺激活动甚至在基底条件但这生产显著(32%)增加SP-A治疗(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。反CINC-1中和抗体没有完全废除这一效应。MCP-1释放通过大鼠ⅱ型细胞也受到SP-A(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba):ef-SP-A活跃在5和10µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba生产增加了68%和73%,分别在基底的水平。gydF4y2Ba
修改表面活性剂脱辅基蛋白对释放的影响interleukin-8从人类单核细胞gydF4y2Ba
为了澄清的机制SP-A诱发引发释放,其活动在一些实验条件下评估:煮SP-A SP-A使用α-MMP, CRF和ALSP-A(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。热处理SP-A完全废除其活动引发释放,而预处理α-MMP或ALSP-A SP-A产生轻微但不显著下降的效果。CRF的影响高于SP-A单独使用时在同一浓度。然而,由于分子量的CRF可能比本地SP-A三分之一,给定的重量比本地SP-A CRF包含更多的分子。gydF4y2Ba
人类表面活性剂的效果比未interleukin-8 peptide-1释放人类单核细胞和单核细胞的趋化作用gydF4y2Ba
为了评估是否SP-A刺激活动是影响表面活性剂的存在脂质在单核细胞的活动也是考验。如图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaPAP患者未分离获得的表面活性剂(冲浪),其中包含表面活性剂脂质和表面活性剂相关的蛋白质,显示刺激影响引发释放类似于由等效浓度仅纯化SP-A(图1gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。冲浪的效果与影响Curosurf(基耶西制药、帕尔马、意大利)和Exosurf(英国葛兰素史克、中的)。Exosurf并不影响引发释放单核细胞Curosurf轻微但不显著刺激引发释放。此外,Exosurf SP-A单核细胞治疗不影响引发释放。尊重MCP-1释放,冲浪很明显的活动只有在非常高剂量的对应4.47 pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba磷脂。Exosurf和Curosurf没有任何明显的活动。gydF4y2Ba
peptide-1 interleukin-8和单核细胞的趋化作用在支气管肺泡灌洗液从肺肺泡蛋白质沉积症患者gydF4y2Ba
建立后的效果SP-A和冲浪引发和MCP-1释放单核细胞和ⅱ型细胞,作者质疑一个条件特点是高浓度的SP-A肺泡与增加引发的生产和MCP-1相关联。引发和MCP-1一群PAP患者BALF水平评估(n = 7)和一组控件(n = 5)。BAL巨噬细胞·毫升的数量gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba的数量和百分比落下帷幕,PAP患者淋巴细胞和中性粒细胞明显高于未受影响对象(表2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。此外,中位数引发和PAP患者MCP-1水平显著高于控制。此外,显著相关(斯皮尔曼等级相关系数,p < 0.05)被发现引发和MCP-1和SP-A内容之间落下帷幕。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
巨噬细胞和macrophage-derived趋化因子至关重要的起始肺部炎症的招聘和激活细胞的特定子集gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。最近的报告关注SP-A的免疫调节功能,主要是针对单核细胞和巨噬细胞gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba。SP-A可以刺激巨噬细胞抗菌功能,特别是几个细菌的吞噬作用gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba包括gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。的吞噬作用gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba,最大SP-A活动对人类单核细胞施加µg·5毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(数据未显示),gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba在浓度观测到的类似于活跃在趋化因子释放。gydF4y2Ba
SP-A活动促炎细胞因子释放仍然是有争议的。SP-A已表现出抑制生产有限合伙人和促炎细胞因子的反应gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba分别在周边单核细胞和肺泡巨噬细胞gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。相比之下,其他研究显示,SP-A移植生产TNF-α,IFN-γ,IL-1β、il - 6和引发THP-1细胞系gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba和牛的添加表面活性剂脂质(Survanta)可以抑制TNF-αSP-A活动但不是引发释放。这项研究的结果证实了这些后者观测和扩展。首先,它发现SP-A显著但不同刺激引发的生产和MCP-1通过两个重要的肺部细胞来源:单核细胞和ⅱ型细胞。此外,引发SP-A活动不是由表面活性剂中和的脂质,因为表面活性剂还能够刺激引发释放单核细胞。此外Curosurf和Exosurf没有明显影响引发释放当评估作为单一代理商或者添加到SP-A。gydF4y2Ba
SP-A活动单核细胞的分子机制已经被Schagat研究gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba谁显示SP-A刺激特定的巨噬细胞的快速酪氨酸磷酸化蛋白(类似于所观察到的免疫球蛋白),最大的活动,包括酪氨酸磷酸化的蛋白激酶C的激活和肌动蛋白聚合,达到浓度从1 - 5µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。此外,KoptidesgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba发现SP-A可以诱导核因子(NF) -κB THP-1细胞活化。激活这些细胞内途径也是一个关键事件的趋化因子的生产,包括引发、刺激单核细胞gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba。可以推测,不同的刺激活动SP-A施加于单核细胞和巨噬细胞的共同分子通路。gydF4y2Ba
SP-A可以直接绑定到脂质和碳水化合物组件的有限合伙人和最近的研究强调了监测的重要性SP-A准备有限合伙人污染gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba。努力是为了排除这样一种可能性,即SP-A和冲浪的影响可能是由于有限合伙人污染。特别是对引发ef-SP-A制备的影响进行了测试和刺激的活动还检测到。这些数据是按照最近的观察的歌gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba观察到不同的作用机制SP-A和有限合伙人之间对THP-1细胞的激活。gydF4y2Ba
为了确定的机制SP-A刺激单核细胞,一些实验与热处理SP-A ALSP-A, CRF或co-incubating细胞SP-A +α-MMP进行。这些数据表明,变性蛋白质不是有效但SP-A的单体的形式(ALSP-A)二硫化物的烷基化得到的桥梁,对引发保留了一些刺激的影响。这与先前的观察结果是一致的gydF4y2Ba12gydF4y2Ba提供的证据表明,烷基化和减少SP-A影响其增强巨噬细胞的趋化作用的能力。一些作者认为SP-A collagen-like域可能负责巨噬细胞刺激gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba210年与一个特定的交互——kda受体表达单核细胞和淋巴细胞。这个假设仍然是有争议的,因为SP-A也被证明与白细胞进行交互gydF4y2Ba通过gydF4y2Bamannose-dependent绑定到细胞表面的碳水化合物gydF4y2Ba45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba47gydF4y2Ba。这项研究的结果似乎证实了这一观察,自从SP-A由胶原酶消化不损害其活动引发。因此,胶原蛋白尾巴SP-A可能不是必要的行动。相反,这里的观察了α-MMP能够只是部分(但不明显)反向SP-A效果没有提供明确的证据表明CRF域参与单核细胞活化。gydF4y2Ba
最后,作者还测试了这些gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba数据可以是任何相关性gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。因此,引发和BALF MCP-1水平的控制和PAP患者评估。这项研究的结果,虽然从数量有限的病人,获得支持gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba观察,因为PAP患者BALF的引发和MCP-1水平明显高于在控制。最近在一项研究证实了这个观察IyonagagydF4y2Baet al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba发现高BALF MCP-1 PAP患者的水平比控制。因此可以推断,SP-A诱导调制趋化因子水平的航空公司可能导致某些子类的效应炎性细胞的招募。这是符合巨噬细胞数的增加,中性粒细胞和淋巴细胞落下帷幕的PAP患者对控制,这一发现与其他作者是共享的gydF4y2Ba49gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
最后,证据被发现,表面活性剂脱辅基蛋白可以不同移植人类单核细胞和大鼠ⅱ型细胞趋化因子释放。此外,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba本研究的结果是一致的与高水平的interleukin-8 peptide-1单核细胞的趋化作用和更高的中性粒细胞和淋巴细胞计数在brochcoalveolar灌洗肺的肺泡蛋白质沉积症病人,因此这表明表面活性剂脱辅基蛋白可能导致招聘空气空间内的炎症细胞在这种情况下。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者想感谢m . Gorrini技术援助。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2001年2月2日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2001年12月13日。gydF4y2Ba
- ©人期刊有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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