抽象的
CD4+ t细胞可能是哮喘中促炎细胞因子的来源。本研究评估了输注克利昔单抗(IDEC CE9.1)(一种抗CD4+单克隆抗体)对糖皮质激素依赖性哮喘患者外周血CD4+ t细胞的影响。
三个患者队列(称为C.0.5:n = 6,c1.5:n = 5,c3.0:n = 5)接收单一输注0.5,1.5或3.0 mg·kg-1分别与第四个接收安慰剂(Cpl:n = 6),随访4周。通过外周血流式细胞术,预先和产后评估是:A)CD4和CD8计数和平均荧光;b)CD25,人白细胞抗原-DR(HLA-DR),CD45RO和CD45RA在CD4 + T细胞上表达;C)干扰素(IFN)-γ,白细胞介素(IL)-4和IL-5在CD4 + T细胞中表达。Keliximab的在体外还评价了对特异性哮喘患者的过敏原特异性外周血单核细胞(PBMC)增殖的影响。
C组肺功能(峰值呼气流量率)显著增加3.0团体。在输注后0.5C1.5和C3.0但不是Cpl:1)CD4,但不是CD8计数显着下降;2)Leu3a染色的总丧失;3)OKT4结合的平均荧光显着降低;4)CD25,HLA-DR,CD45RO和CD45RA / CD4 +细胞的数量显着降低。CD4 +细胞表达IFN-γ,IL-4或IL-5没有变化。与对照单克隆抗体相比,Keliximab导致T细胞增殖显着降低。
作为抗CD4单克隆抗体的Keliximab导致CD4 + T细胞的数量和严重哮喘患者的CD4 +受体表达的调节瞬变降低。除了降低过敏原增殖之外,keliximab的效果可以通过CD4 +表面表达和T淋巴细胞数的降低来介导。
本研究由Smithkline Beecham Pharmaceuticals提供资金。
哮喘气道的粘膜损伤和支气管高反应性特征被认为是由脂质介质和嗜酸性粒细胞颗粒源性碱性蛋白引起的1.细胞因子白细胞介素(IL)-5,IL-3和粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)增强了嗜酸性粒细胞分化,成熟,内皮粘附,活化和脱落。CD4 + T细胞是这些细胞因子的重要来源2此外,哮喘患者的支气管肺泡灌洗液和支气管活检中也有增加3.那4.,以急性和严重的哮喘激活5.并与嗜酸性粒细胞数和激活相关2那6..
kaiximab (IDEC CE9.1)是一种嵌合免疫球蛋白(Ig)G1 λ单克隆抗体(mAb)7.与人类CD4抗原特异性结合最近进行了一项随机双盲、安慰剂对照试验,评估单次输注克利昔单抗对严重慢性皮质类固醇依赖哮喘患者的疗效8..在最高剂量中观察到早晨和晚期峰值呼气流量(PEFR)的显着增加(3.0 mg·kg-1)队列。
为了探讨哮喘中Keliximab的可能模式,本研究评估了本研究在活的有机体内这种单抗对外周血CD4+ t细胞的影响体外这些患者细胞因子的表达。假设Keliximab临床疗效与:1)CD4的涂层涂层;2)减少CD4抗原对T细胞的表达;3)循环抗体的浓度;4)激活标记的变化;5)改变T-辅助细胞(TH)1 / Th2细胞因子谱。除此之外在体外抗体对外周血单核细胞(PBMC)过敏原特异性增殖的影响是从房屋粉尘螨敏感的哮喘学评价的。假设这些将以剂量依赖的方式降低。
研究设计
临床研究
从伦敦胸部医院和伦敦皇家Brompton医院招募了二十二次严重口腔皮质类固醇依赖性哮喘。先前已经描述了完全患者特征8..在>基线期5天后,单次静脉输注克利昔单抗或安慰剂,患者随访4周。研究了三个连续的患者队列。第一组(n=6)服用0.5 mg·kg-1keliximab (C0.5),第二组(n=5) 1.5 mg·kg-1(C1.5),第三组(n=5)服用3.0 mg·kg-1(C3.0).在随机顺序中,每个群组的两名患者(总体六名患者)接受安慰剂输注(Cpl).所有患者均以东伦敦市和哈克尼卫生局和皇家布朗普顿医院的伦理委员会批准了书面,知情同意和该研究。
在预灌注中收集外周血,在48小时和14天内灌注细胞内流式细胞术。在输注后,在基线和24小时,48小时,7天,14天和28天内,还收集血液的全血差异和三种颜色流动细胞术分析。所有样品在09:00 H(±2小时),并在接受每日口服皮质类固醇剂量的患者之前进行。在输注前(0h)和0.5,1.0,2.0(输注末端),2.08,2.25,2.5,3.0,4.0,6.0,8.0,12和24小时之前进行药代动力学评估。进一步的药代动力学评估在第2天,7,14和28天后进行。
材料和方法
抗体和试剂
以下直接结合的单克隆抗体用于外周血的流式细胞分析:OKT4 phycoythrin (PE) (Ortho Diagnostics, Bucks, UK), OKT8异硫氰酸荧光素(FITC), OKT3能量偶联染料(ECD), CD3 ECD, CD8 ECD (Coulter, Bedfordshire, UK), IgG1 FITC, Leu3a PE, CD2 FITC, CD25 FITC, CD45RA FITC, IgG2a FITC, HLA-DR FITC (Becton Dickinson, Oxford, UK), IgG2 FITC, CD45RO FITC (Dako, Bucks, UK)。以下PE偶联抗体来自Pharmingen (San Diego, CA, USA)用于细胞内细胞因子评估:MOPC-1 (IgG1), 4S。B3 (IFN-γ)、8D48 (IL-4)、R35-95 (IgG2a)、JES1-39D10 (IL-5)。Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA),胎牛血清(FCS), Histopaque,人AB(血型)血清,钙离子载体,莫能菌素和皂苷从Sigma (Poole, UK)获得。谷氨酰胺、青霉素、链霉素和罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640购自Gibco(佩斯利,英国)。n -2-羟乙基哌嗪- n -2-乙基磺酸(HEPES)缓冲RPMI培养基购自Chester Beatty Laboratories (London, UK)。“Multiprep”细胞裂解固定系统和Isoton II等渗缓冲液购自Coulter (Hialeah, FL, USA)。多聚甲醛(PFA)和二甲基亚砜(DMSO)从英国埃塞克斯的BDH获得。Dermatophagoides Pteronyssinus.(Der-p)(Aquagen提取物)购自来自alk(Horshølm,丹麦)。氚化甲基尿苷购自Amersham(Buckinghamshire,英国)。
三色表面流式细胞术
选择用于分析的流动细胞术细胞表面参数(±它们的替代抗体表位)是:CD2:该受体在几乎所有T细胞,天然杀伤剂(NK)细胞和胸腺细胞上都存在。CD3(OKT3):常见的T细胞受体复合物(TCR)。CD4(Leu3a / OKT4):主要的组织相容性复合体(MHC)II受体。CD8(OKT8):MHC级I受体。CD25:IL-2受体β链。CD45RA:在休息和天真的T-Memory单元中表达。CD45RO:在激活的T图像中表达。HLA-DR:MHC II类分子(人白细胞抗原DR)之一。
每次就诊时,使用Technicon H*1 (Coulter)进行全血鉴别计数。100微升等量乙二胺四乙酸(EDTA)外周血全血用抗体染色,黑暗孵育30分钟。与克利昔单抗竞争的Leu3a被用于识别“包被”细胞,与克利昔单抗不竞争的OKT4被用于识别与克利昔单抗结合但仍在外周血中的CD4+细胞。然后,红细胞被裂解,其余的细胞使用“Multiprep”系统固定。细胞重悬在250µL含0.5%甲醛的等渗缓冲液(Isoton II, Coulter)中,由“盲法”流式细胞仪在配备488 nm氩激光的Elite Epics细胞分选仪(Coulter)上进行分析(48小时内完成)。每个参数分析了一万次事件。
细胞内流式细胞术
每个受试者均获得肝素化的外周静脉血。采用密度梯度离心法分离细胞。细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次,然后在1×10悬浮6. cells·mL-1在培养基中,RPMI 1640,10%胎牛血清(FCS),2mM L-谷氨酰胺,青霉素(100个单位·mL-1),链霉素(100μg·ml-1)并用Phorbol 12-Myristate 13-醋酸酯(PMA)刺激(10ng·ml-1)在3μmmonensin存在下,钙离子载体(1μm)。将细胞在37℃下在含有5%CO的湿化空气中温育5小时2.PBS洗涤2次后,PBS溶解4%多聚甲醛,4°C悬吊10分钟固定。PBS洗涤一次后,将细胞重悬在10%二甲基亚砜(DMSO)的溶液中,50% FCS在RPMI 1640中以10×10的浓度重悬6. cells·mL-1并在-80°C中储存直至在临床研究分析结束时以批量和“盲目的”方式进行加工和分析。
细胞在水浴中除霜30秒,然后在室温下加入5ml PBS。将细胞在PBS中洗涤两次,然后通过将其悬浮在含有10%混合人血清的PBS的0.1%皂苷溶液中,透过渗透(“皂苷缓冲液”)。等分试样106.将透氧细胞与皂苷缓冲液中的PE缀合的细胞因子特异性mAb或同种型对照一起温育(在5μg·ml的最终抗体浓度下-1)、OKT4 FITC、CD3 ECD静置30分钟。细胞在皂苷缓冲液中洗涤一次,然后在PAB(含0.5%重量/体积牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠的PBS)中洗涤一次,然后在250µL 0.5%甲醛溶液中isoton重悬,并用流式细胞仪分析。淋巴细胞群通过特征的正向和侧向散射门控,然后由CD4和CD3阳性抑制。每种细胞因子分析了2000个事件。
药代动力学测定
将血液样品收集到肝素化管中并在冰浴中冷却。通过在-70℃下储存在聚丙烯管中的离心直至分析,通过离心分离等离子体。使用Tektagen的电化学发光免疫测定(Malvern,Pa,USA)测定Keliximab,检测限为40.0 ng·ml-1.
细胞增殖研究
采用密度梯度离心法从肝素化血标本中分离PBMCs,在hepes缓冲的RPMI培养基中洗涤2次,在添加5%人AB血清、2 mM l-谷氨酰胺、青霉素(100单位·mL)的RPMI培养基中重悬-1)和链霉素(100µg·mL-1).如前所述,使用了一种需要PBMC单一抗原刺激的短期培养技术9..PBMC在1×10培养6. cells·mL-1用25μg·ml-1Der-p扩散化验。在培养基中加入Keliximab或不相干的人/猕猴嵌合IgG1单克隆抗体(抗呼吸道合胞病毒),浓度分别为0.5、1、10、50、100µg·mL-1镜像在临床研究中实现的浓度。通过加入37 kBQ的氚化甲基吡啶··井,在第7天测量增殖-1在培养的最后16小时,用液体闪烁光谱法测定标记掺入。
统计方法
资料由独立统计学家分析。
表面和细胞内流式细胞术
在基线时四组之间记录值的差异用单因素方差分析进行检验。一组内随时间变化的显著性用两方方差分析(ANOVA)进行检验。在发现显著变化的地方,使用配对t检验对基线的变化进行检验。四组间每天基线变化的差异使用单因素方差分析进行测试。在发现显著差异的情况下,使用5%水平下的最小二乘法的所有两两比较进一步进行调查(p⪕0.05的统计学意义)。
增殖反应
测试数据的分布,并发现了与正常性的显着偏差。使用非参数双向ANOVA测试每组内剂量的变化,并使用Wilcoxon签名秩检验进一步研究任何显着的变异。使用Wilcoxon Rank-Sum测试测试同种型对照和Keliximab组之间的变化的差异。
结果
药代动力学
在所有活性处理队列中,keliximab的浓度在2-H输注期间增加,其最大浓度(Cmax)为11.5μgml-1对于C.0.5, 42.9µg mL-1对于C.1.5和107μgml-1对于C.3.0.然后,这仍然是〜6小时的常数0.5,10 h for c1.5和2 22小时3.0.在第1天,第2天和第7天的六个受试者中有两个受试者中的两项,在第7天的第2天和六个受试者中的两项中发现了非质量浓度。0.5.在C.1.5第2天中的五个患者中的一个,群体中发现了非夸夸光浓度,但剩余的四个患者在第7天内没有可检测的抗体。在C中3.0组中,5例患者中有1例在第7天出现不可量化的浓度,2例在第2周出现不可量化的浓度,其余2例在第4周出现不可量化的浓度,虽然没有对最后两名受试者的两周来访进行样本分析(因此增加了他们在两周时无法检测到浓度的可能性)。这些数据汇总在图1中⇓.在输注后28天未检测到抗独特型抗体。
临床研究免疫蛋白型
在接受keliximab的所有受试者中实现了CD4 +淋巴细胞的快速高效涂层,如Leu3a染色的平均荧光(MF)的完全丧失所示(图2⇓).MF返回到C中的基线值0.5和C1.5,但在c中仍然很明显3.0在第7天(图3⇓).OKT4染色在所有受试者中也有变化,但幅度小于Leu3a的变化。在C区,OKT4 mf的调制幅度最大3.0组(图。3⇓).
CD4 + T淋巴细胞的绝对计数在1天下降,但在C中返回到基线值0.5和C1.5尽管在C组,直到第14天它们都显著下降3.0(图3⇑).尽管这种影响在C3.0组,在24小时在24小时分娩时,在任何活性处理组之间的CD4计数的最大绝对减少方面没有剂量效应(图3⇑).虽然CD2和CD3的变化相似,但对CD8计数没有影响(表2)⇓).
表达CD25,HLA-DR,CD45RO和CD45RO的CD4 +细胞的数量在所有三个活性治疗(但不是安慰剂)队列中减少(表3⇓).这些返回到C中的基线值0.5和C1.5在第7天,在C3.0白天14。在其余循环CD4+淋巴细胞中,C0.5在第1天,第2天和第7天发布(图4⇓)和两个C中HLA-DR表达的增加0.5(输注后第1、2、7天)和C1.5(输液后第1天)(图4⇓).CD45RO表达没有显着的变异性,但在所有三个活性队列中发现了CD45ra表达的显着降低(C.0.5直到第2天邮局,c1.5直到第1天邮政和c3.0直到第2天的发布档)(图4⇓).
细胞内流式细胞术
在任何三个队列中,OKT4+/CD3+ t淋巴细胞中IL-4、IL-5和IFN-γ的表达与基线相比均无显著变化。
单核细胞和嗜酸性粒细胞计数
在三个队列中的任何一个中,外周血单核细胞或嗜酸性粒细胞计数没有显着减少到基线中的基线。
扩散的结果
keliximab被禁止P.- 来自所有六种敏感的哮喘的刺激性的T细胞增殖在体外(图5⇓).随着升高浓度的抑制而似乎存在趋势,但这并不统计学意义。
讨论
CD4蛋白是55kD分子,具有四个细胞外结构域,单个跨膜结构域和短血晶滴尾部。它在成熟的细胞膜上表达,胸腺衍生的淋巴细胞。它与II类MHC分子上的非聚对区域结合,并通过稳定T细胞受体 - 抗原相互作用,与粘合分子类似,从而促进T细胞活化通过t细胞受体(TCR)作为抗原识别过程的一部分,CD4分子也在物理上与TCR对TCR的交联结合,并可能作为辅助受体直接参与t细胞的激活通过酪氨酸激酶p56克斯.
Keliximab.7.,嵌合人/猕猴抗CD4 mAb是具有短尾克可变区和人常数区域的IgG1λ抗体。先前已经描述了在输注后克利克里昔单抗后一组严重哮喘患者的临床改进8.但是,它在这组患者中的确切作用机制尚未阐明。
所有CD4+ t细胞都有有效的涂层,这可以通过完全失去Leu3a染色来证明,它直接竞争克利昔单抗的结合位点。由于其与MHC结合位点相邻的D1结合,MHC与CD4结合的立体定向抑制可能是一种机制。CD2+和CD3+ t细胞的绝对数量的减少,以及OKT4+ t细胞(与D4域结合,因此不与克力西单抗竞争)的绝对数量的减少,表明这类细胞也从循环中短暂的移除了约50%。认为抗cd4单克隆抗体清除细胞的机制是通过Fc部分、C3b受体介导的吞噬、补体介导的杀伤或凋亡10.那11..虽然克利昔单抗能够结合Fc受体,但它不能结合C1q,也不能介导补体依赖的细胞细胞毒性12..在C细胞中,这些细胞在7天内快速繁殖0.5和C1.5但只有14天的c3.0.循环中CD4 +细胞的最大降低不是浓度依赖性,并且在24小时的所有活性队列之间没有显着差异。这反映了keeliximab结合的有效性,通过在24小时灌注时通过在24小时染色的Leu3a染色的完全丧失证实,而施用剂量(因此甚至在该时间点的最低计量队列中暗示CD4受体的完全饱和度)。但是,C的减少3.0最延长的是,CD4表达对T细胞的调节时期可能是改进PEFR在这队列中指出的临床效果的关键因素8..此外,先前的研究表明,循环CD4+计数可能不是靶器官抗炎作用的良好指标13.并且只有最高剂量的队列在支气管组织中才能实现足够的局部浓度。外周血的变化由药代动力学数据镜像(图1⇑)并且所述重新预期可以反映来自keliximab的间隙的淋巴或非淋巴结组织的细胞释放。重新灌注细胞的MF和免疫蛋白型在第14天的基线上与基线相同,并表明这些可以是返回到外周循环而不是幼稚的T细胞群体的原始细胞。此外,没有细胞因子释放综合征的事件。因此,不太可能存在任何显着的细胞死亡。
还注意到CD4分子的下调/调节CD4分子的调节受体密度直至14天评估。这是与先前研究过此类抗CD4抗体在其他患者组中的效果14.那15.这种降低可能会降低其辅受体的功效。
CD25/CD4+、HLA-DR/CD4+、CD45RO/CD4+和CD45RA/CD4+绝对数量的减少也反映了CD4+绝对数量的变化,但这些可能仅仅反映了单克隆抗体对CD4细胞总数的影响。除了CD45RA的降低,其余循环细胞中这些标志物的表达百分比也有不同的影响,与临床效果无关。可能CD45RA+/CD4+细胞对克利昔单抗的作用更敏感,但需要注意的是,CD45RO+细胞的比例并没有随之增加。这与以前的一致在活的有机体内在类风湿关节炎中研究抗cd4 mAb (cM T412)对CD45RA+细胞的影响16.虽然其他在体外对抗CD4 mAb的研究表明了不同的效果17.-19..因此,克利昔单抗似乎没有任何选择性地隔离活化或记忆t细胞。同样,IFN-γ、IL-4和IL-5在其余循环CD4+ t细胞中的相对表达未发生改变。这表明克利昔单抗对Th1型和Th2型细胞因子没有明显的差异作用。抗cd4单克隆抗体能够诱导耐受,而不管它们是否能够引起衰竭15.那20.并且还可以提供负信号通过它们与CD4分子的相互作用21..特异性刺激研究的结果表明了对增殖性反应的抑制,但没有明确的剂量反应证据。
CD4也表达单核细胞22.和嗜酸性粒细胞23..尽管克利昔单抗可能通过作用于这些促炎细胞发挥其临床作用,但在本研究中,外周血嗜酸性粒细胞和单核细胞计数并未降低。
鉴于抗CD4 mAb在哮喘中可能临床疗效的证据,考虑人免疫缺陷病毒(HIV)中的哮喘发病率可能是有用的。虽然众所周知,患有可获得的免疫缺乏症综合征(艾滋病)或HIV感染的患者增加了IgE的血清浓度,但没有证据表明哮喘,特应疾病或艾滋病毒过多的患者患病率更多或更小24.-26..事实上,CD4计数更严重的患者的患者具有较小的哮喘患病率27..HIV病的气道疾病表现复杂,可能与HIV直接气道感染、继发感染甚至同时治疗有关。鉴于抗CD4单克隆抗体对t细胞的确切作用差别很大,这取决于所研究的特定的单克隆抗体,因此很难用HIV作为CD4耗尽的临床模型来推断所有抗CD4单克隆抗体对哮喘的作用。
总之,本研究评估了慢性严重哮喘抗CD4单克隆抗体的免疫效应,并证明了与循环CD4 + T细胞数量的瞬时降低的瞬时降低,伴有快速且有效结合所有CD4 + T细胞,除了调节CD4 +受体表达。抗独特型抗体在第28天灌注时未被检测到。本研究还表明,旨在CD4 T细胞的治疗可能是皮质类固醇依赖性哮喘学的有用辅助治疗。
致谢
作者谨感谢参与审判及其推荐医师的患者,J.特纳统计服务和J. Mitchell在研究期间的帮助。
- 收到了2000年7月14日。
- 公认2001年3月12日。
- ©ers Journals Ltd