文摘
磷脂酶一2(中国人民解放军2)是一个家庭的酶被认为扮演一个关键的角色在炎症通过释放花生四烯酸类花生酸的合成和lysophospholipid platelet-activating合成的因素。然而,精确的贡献不同的解放军2类型在上呼吸道炎症的形成脂质介质和不同的表达人民解放军是未知的2基因在人类鼻粘膜还没有检查。
因此本研究调查的发生酸信使核糖核酸(mrna)不同的解放军2形式(IB、活动花絮IID,国际教育协会,三世,IVA, IVB,司长委任印度河流域文明,V, VI,七世,X,酸calcium-independent (aiPLA2),解放军calcium-independent膜结合2(iPLA22)鼻粘膜的五个健康人体。
使用反向聚合酶链反应(rt - pcr)技术,发现所有这些计划2类型除了解放军2V表示在所有科目,而解放军2V中发现只有一个人在一个场合。的相对丰度不同的解放军2成绩单是aiPLA2> X≈IVA >活动花絮IIE≈≈IVB > IB≈≈六世司长委任第三IID≈≈印度河流域文明第七≈≈iPLA22。进一步量化mRNA-expression解放军2X, IVA和花絮,样品重新进行了定量PCR-technique利用竞争脱氧核糖核酸(DNA)模仿引用。计划的数量2X, IVA和花絮信使rna被估计为0.9±0.2,1.1±0.7,0.0025±0.0021阿莫勒(均值±se),分别确认这些解放军的相对丰度2成绩单和表明解放军最近描述2X相对强烈的表达形式。
这些发现表明,大量的人民解放军2类型是正常的人类鼻粘膜中表达。此外,这个调查展示了,第一次,新发现的磷脂酶的存在2IID形式,国际教育协会,三世,IVB,司长委任印度河流域文明,X和calcium-independent膜结合磷脂酶A2在人类鼻粘膜和提高的可能性,一个或多个这些可能参与炎症反应的鼻子。
这项工作得到了瑞典医学研究理事会(k99 - 27 - x - 05983 - 19 - a),瑞典工作生活研究委员会(96 - 0615)和Vardal基金会,瑞典(96/48 A96 027)。
磷脂酶一2(中国人民解放军2)是第一个酶合成的两种类型的脂质呼吸道炎症介质与强有力的影响:二十烷类和platelet-activating因子(PAF)参谋长1。因此,解放军2酰酯键的水解sn-2glycerophospholipids和释放花生四烯酸(AA),然后代谢类花生酸,1 -O-alkyl-lysophosphatidylcholine (lysoPAF)拥堵的前兆。目前,许多不同的计划2国际教育协会(IB、活动花絮IID,三世,IVA, IVB,司长委任印度河流域文明,V, VI,七世,X和解放军胞质calcium-independent膜结合2(iPLA22))已确定在人体组织2- - - - - -6。这些计划2年代属于不同类型的酶12:分泌类型(解放军2),胞质calcium-dependent类型(cPLA2),iPLA28。然而,这些不同的人民解放军的精确的贡献2类型炎症的形成脂质介质在航空公司不知道,还很可能是与解放军其他蛋白质2属性存在。是很重要的,因此,详细研究计划的多样性2年代的航空公司以及不同的解放军2年代期间可能会激活炎症。
尽管解放军一般兴趣不同2类型和他们如何参与lysoPAF的释放和AA,解放军的作用不同2年代在人类鼻粘膜已收到,而很少关注。先前的调查证明增加解放军2活动鼻灌洗液(NLF)过敏患者过敏原后挑衅10,11;虽然增加了解放军2活动没有明确归因于任何具体的计划2类型,调查强调了一个解放军2与特征类似于解放军2花絮。高浓度的解放军2花絮也已确定NLF醋甲胆碱后,从健康受试者挑衅12;然而,中国人民解放军2水平在国家低阻塞后泪流流体进入鼻腔,表明酶起源于撕裂流体。除了中国人民解放军2活动花絮,Touquiet al。11发现拥堵在NLF acetylhydrolase-like活动,七世解放军的类型2。尽管这些原始的和重要的发现,目前尚不清楚如何不同的解放军2年代参与形成和代谢的脂质介质鼻粘膜。此外,大量的小说解放军2最近被分离和克隆类型3- - - - - -6,13- - - - - -17,其中许多可能是鼻粘膜或独立操作。这些因素促使目前努力检查发生酸信使核糖核酸(mrna)不同的解放军2在健康人体的鼻腔粘膜。
材料和方法
主题
五个受试者自愿参加调查。他们都是健康的男性,25-45岁年龄,不吸烟者和不服用任何药物。所有五个受试者被用于获得鼻毛刷样品当他们三个被用来获得独立样本。刷样品从每个主题在不同场合与抽样场合之间没有不到一个星期。所有个人临床检查在每个采样时刻,视觉检查(由前rhinoscopy)鼻腔出现正常。因此,鼻粘膜没有显示任何迹象炎症或刺激鼻腔灌洗或刷牙之前。
鼻粘膜的样品
鼻粘膜的细胞获得通过鼻腔灌洗或刷子技术如前所述18。获得独立,15毫升的盐水插入通过注射器连接到一个商业弗利导管(吟游诗人,克劳利,西萨塞克斯郡,英国)袖口改编的前庭米饭。鼻腔的生理盐水是恢复后10分钟,内容是由离心收集细胞。获得鼻毛刷样品,小的,再用钢丝刷子尼龙刷毛了。之间的刷被鼻中隔和下鼻甲和旋转而被删除。收集的细胞通过刷牙就扭曲的刷1毫升的磷酸缓冲盐在pH值7.3离心紧随其后。细胞的总数鼻毛刷和独立样本2.7×105±2.1×105和2.3×104±1.5×104,分别。细胞的生存能力超过97%,在这两种制剂,由Tryptan蓝色的排斥。微分计算沾赖特染色(Accustain Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)表明,粘膜样本获得的方法主要由上皮细胞组成。平均5.6±1.8%的细胞是白细胞的总数,其中只有偶尔的嗜酸性粒细胞被检测到。
信使核糖核酸的检测反向transcriptase-polymerase连锁反应
细胞颗粒都被立即细胞溶解和总细胞核糖核酸(RNA)方法孤立的酸硫氰酸guanidium /苯酚/氯仿提取如前所述19。RNA reverse-transcribed成互补DNA(互补)Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(RT)(上标TM英国佩斯利二世,生命科技有限公司)按照生产厂家的说明书。短暂,总RNA和缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值8.3,75毫米氯化钾,MgCl 3毫米2),0.6毫米每三磷酸脱氧核苷酸(核苷酸),和0.5µg寡核苷酸(deoxythumidylate)18(低聚糖(dT)18),加热5分钟在65°C。孵化后,样本冷冻冰和RT上标TM酶II(200辆),RNAsine(20个单位)和二硫苏糖醇(DTT)(100毫米)是20µL添加在最后一卷。样本孵化60分钟40°C后跟5分钟在95°C。互补脱氧核糖核酸是储存在−20°C到用于PCR扩增。
聚合酶链反应(PCR)、cDNA从所有受试者的汇集和1µL汇集cDNA使用/中国人民解放军2形成放大。所有的PCR反应包含2µL PCR缓冲(Tris-HCl 100毫米,500毫米氯化钾,pH值8.6),MgCl 2毫米2核苷酸,0.2毫米,0.1毫米寡核苷酸引物,和0.5单位Taq在总量为20µL DNA聚合酶。对解放军的放大2花絮和IV,白金Taq使用DNA聚合酶(生命技术)。所有的引物(表1⇓)使用由发表序列,然后合成了生活的技术。PCR反应进行了ptc - 100 (MJ研究Inc .)、水城,妈,美国)可编程温度控制器,最初在94°C 2分钟变性其次是骑在94°C程序1分钟,1分钟在55 - 65°C(引物之间的不同集)和1分钟在72°C。所有PCR反应进行了40周期(无花果。1 - 5⇓⇓⇓⇓⇓)除了解放军的竞争分析2IVA和X进行了28周期(无花果。6 - 7⇓⇓)。最后7分钟的延伸在72°C的反应结束。10毫升每个PCR反应1.5%琼脂糖凝胶上分离和ethidium bromide-stained。彩色凝胶被数字化成灰度图像与DC120变焦数码相机(美国柯达数码科学,罗彻斯特,纽约)和分析柯达数码科学lD图像分析软件。PCR产品获得对应于预期的产品尺寸如表1所列⇓。PCR产物经印迹利用寡核苷酸探针互补序列在不同的解放军2PCR产品(表1中列出使用的寡核苷酸探针⇓)或限制性内切酶消化使用PVU II(隔绝变形杆菌vularisIID), IVB和aiPLA司长委任2形式,铁道我(隔绝Haemophillus haemidyticus)国际教育协会的形式,猪圈我(隔绝伤寒沙门氏菌第三)形式和后III(隔绝Haemophillus影响Rd)iPLA22形式(技术)。
让中国人民解放军的相对丰度的比较2形式,扩增效率(E)确定每个引物组。整除的cDNA受到不同数量的扩增循环和PCR产品如前所述。互补脱氧核糖核酸含量(表示为净强度)从各自的周期被绘制的日志(解放军2形式)与数量的周期。推导了线性回归后,E值对数图的斜率。E值是:中国人民解放军2IB (E = 0.68),活动花絮(E = 0.77), IID (E = 1.19),国际教育协会(E = 0.68),三世(E = 0.56), IVA (E = 0.84), IVB (E = 0.53),司长委任印度河流域文明(E = 1.13), V (E =不确定),六世(E = 0.90),七世(E = 0.67), X (E = 0.64), iPLA22 (E = 0.88), aiPLA2(E = 0.53)。
定量聚合酶链反应
为了进一步量化的信使rna,具有竞争力的DNA片段(PCR模仿)构建了中国人民解放军2形式活动花絮,IVA和x PCR模拟生成的两个连续的外源DNA的PCR扩增(pGEM®plasmide控制DNA, Promega Corp .)、麦迪逊、WI,美国)。第一聚合酶链反应,合成引物。一个包含上游引物(PLA目标2活动花絮,IVA或X;参见表1⇑)与一个底漆,外源DNA免疫印迹。另一个包含下游人民解放军2目标底漆和中国人民解放军的寡核苷酸序列2目标(表1⇑)与外源DNA链的相反。第二个PCR与解放军执行2特殊技能底漆。中国人民解放军2模仿从而为解放军生成包含目标序列2特殊技能和目标序列的引物内部寡核苷酸探针,允许确认的具体计划2产品以及模仿产品印迹。内部控制碎片(模拟)和中国人民解放军的互补脱氧核糖核酸片段2形式同时放大,以确保一个平行的积累在整个周期范围和类似的价值积累的两个片段。由于解放军互补dna之间的巨大差异创造价值2IVA及其模拟,一个新的反义给341个基点PCR引物构建了产品(图。6⇑)。E-values是:模仿解放军2花絮和cDNA解放军2花絮0.81和0.78,模仿解放军2IVA和cDNA解放军2IVA 0.71和0.72,模仿解放军2X和cDNA解放军2X 0.59和0.53,分别。生成的大量的PCR产物的coamplification cDNA与不同数量的样本模拟被用来确定具体计划的水平2信使rna在示例。两个产品的数量分开在琼脂糖凝胶(生命技术)溴化乙锭染色,数字化成灰度图像和表达为净强度绘制日志(PLA2—构成/模拟)与日志(模拟浓度)。在线性回归和表达格式y = kx + l,解放军的数量2在示例计算y = 0(无花果。5 - 7⇑⇑⇑)。intra-assay和interassay变化的决定被放大测试一系列稀释的解放军2分别模拟0.1阿莫勒,1阿莫勒的解放军2互补脱氧核糖核酸添加到每个稀释。PCR反应在三个不同的场合进行了一式三份。均值±sd值检测到大量的人民解放军2互补脱氧核糖核酸的九名决定0.1阿莫勒样本:解放军2阿莫勒花絮0.07±0.02,解放军2阿莫勒IVA 0.29±0.04,解放军2阿莫勒X 0.10±0.02, 1阿莫勒样本:解放军2阿莫勒花絮1.08±0.36,解放军2阿莫勒IVA 2.99±0.92,解放军2阿莫勒X 1.20±0.25。
结果
磷脂酶的表达2在人类鼻粘膜细胞
解放军的表达不同2形式在国家和鼻毛刷样品图1和图2中所示⇑⇑。因此出现IB,花絮,IID,国际教育协会,三世,IVA, IVB,司长委任印度河流域文明,V, VI,七世,X, iPLA22和aiPLA2粘膜细胞中表达形式都是样品,无论采样技术。不同的PCR产品使用印迹和γ-被证实32P-oligonucleotides(图2所示⇑),或者通过使用限制性内切酶的PVU II,铁道我或猪圈(图。3⇑)。重复实验显示本质上相同的模式的解放军2表情,除了解放军2V mRNA不是检测;这个特殊的解放军2因此形式是集中样本中发现,只有第一个抽样。信使rna的分析显示,中国人民解放军从五个不同的课程2V表达源自一个人。重复样本来自个人和分析;但是,没有解放军2V mRNA后来被发现在这些场合。相比之下,其他所有的人民解放军2表达形式被发现在所有科目,包括个人表达了中国人民解放军2在一个场合V形式。
调查的相对丰度不同的解放军2信使rna的形式,分析了一系列十倍稀释的汇集cDNA(图4所示⇑)。这表明aiPLA2在1:10检测4稀释,紧随其后的是解放军2IVA和X 1:103稀释、花絮、国际教育协会、IVB,司长委任和VI 1:102稀释,IB, IID三世,印度河流域文明,七世,iPLA22在1:10稀释。aiPLA的大量2信使rna检测没有由于更有效放大反应;事实上,这个解放军的PCR2价值最低的类型。
信使核糖核酸定量分析磷脂酶A2活动花絮,IVA和X
为了定量评估解放军的表达2花絮、IVA和X mRNA、竞争PCR分析使用模仿这些表格。这些模拟的应用见图5 - 7⇑⇑⇑,中国人民解放军的测量2活动花絮,IVA和X mRNA在鼻粘膜样本。线性回归分析后,大量的mRNA在这个特定的示例计算6.8×10−3阿莫勒,0.18和0.05,分别。
模拟被用来确定数量的计划2活动花絮,IVA和X mRNA在鼻粘膜样本5个科目。正常化后他们减少glyceraldehyde-phosphate-dehydrogenase解放军的数量(GAPDH)水平2活动花絮,IVA和X mRNA估计0.0025±0.0021,1.1±0.7,0.9±0.2阿莫勒(均值±se),分别为(表2所示⇓)。这些计划的相对丰度2成绩单(见图4⇑),从而证实。
讨论
目前的调查显示,解放军2IB、活动花絮IID,国际教育协会,三世,IVA, IVB,司长委任印度河流域文明,VI,七世,X, iPLA22和aiPLA2信使rna表达在人类鼻粘膜在所有科目。这项研究不仅证实了解放军的存在2花絮12和七世11但也证明了存在大量的其他成员的解放军2总科,包括描述的新计划2IID14,国际教育协会4第三,6,IVB16,印度河流域文明17,X20.,iPLA223,5。然而,应该强调,解放军的存在2的信使rna基因转录并不一定意味着翻译成蛋白质或这些蛋白质,如果存在,人民解放军所激活2酶。必须按顺序进行进一步的研究来揭示中国人民解放军2鼻粘膜酶蛋白质操作。
先前的研究已经发现了一些不同的解放军2类型在人类呼吸道的其他部分,比如解放军2IB21、活动花絮12,IID14,国际教育协会4第七,22,23,X20.。中国人民解放军2III是克隆胎儿的肺,但北部污点并没有透露任何记录在肺6。胞质解放军2IVA已被确定在人类肺泡巨噬细胞和呼吸细胞系24,25,最近发现paralogues解放军2IVB和印度河流域文明,司长委任在人类的肺部组织16,17。相比之下,胞质解放军2六世(iPLA2),目前作者的知识,而不是被证明在人类航空公司直到现在。中国人民解放军2VI mRNA对应于85 kDa小鼠解放军2在P388D1细胞已被确认26。尽管这种酶与解放军calcium-dependent共享没有同源性2IVA和拥有没有明确偏爱AA-containing磷脂,它被认为在膜磷脂的改造中发挥作用和重要性已被证明是在调节AA公司成膜2。这是有可能的,因此,这种酶中扮演一个重要的部分在整个AA新陈代谢。
如图4所示⇑,有显著差异的相对丰度不同的解放军2类型。aiPLA所表现出的强烈的表达2,提出了回收的肺表面活性剂时扮演更重要的角色,因为它有偏爱dipalmitoyl磷脂酰胆碱9,27。然而,值得怀疑的是,这种酶是一个真正的人民解放军2如果解放军2在生理博士aiPLA属性2也有谷胱甘肽过氧化物酶活性,而不是被建议作为一个抗氧化蛋白28。有趣的是,解放军2X也相对强烈的表达(图。4⇑),这表明这个解放军2类型是大量存在于鼻粘膜。获得的结果与模拟技术证实了解放军的出现顺序2X, IVA稀释系列和花絮,解放军2X和IVA被大约400倍比解放军更强烈的表达2花絮(表2⇑)。因此有理由相信,中国人民解放军2X是强烈的表达在人类鼻粘膜。
中国人民解放军2X是一个低分子量(13.6 kDa), calcium-dependent,分泌解放军2包含16个半胱氨酸残基8,29日。因为它绑定到一个解放军2肺膜受体30.,它被认为在细胞信号传导中发挥作用。中国人民解放军2X已经检测到成人的肺20.和II型肺泡上皮细胞31日但不是在人类鼻粘膜直到现在。有趣的是,国家从个人暴露于冷空气或醋甲胆碱具有较高的解放军2活动。一项研究使用fluoroimmunoassay建议这个活动是由于人民解放军2花絮”来自撕裂流体12。在相同的研究中,然而,鼻活检组织化学染色显示只有少数人民解放军2IIA-positive细胞,按照目前的发现解放军mRNA的表达2花絮是虚弱的。总之,这些研究结果表明,解放军2X,而不是解放军2花絮”,应被视为主要的解放军2在健康个体的鼻道。解放军的功能2X是未知的。值得注意的是,它已经证明了解放军2X版本明显比其他更多的AA解放军2形式(IB、活动花絮和V)时增加了体内细胞附着8,29日,31日,这表明解放军2X可能在AA解放起着重要的作用。
是解放军2类型(s)参与气道炎症和疾病,都花费了大量的精力的分泌(kDa 14日)类型(解放军2)。中国人民解放军2花絮已经连接到炎性疾病如克罗恩氏病和内毒素休克32。这种形式是内毒素诱导的大鼠14,33在豚鼠34并提出参加抵御细菌感染35。最近发现解放军2II形式,IID国际教育协会,也可能参与细菌国防,既能够水解磷脂酰乙醇胺(PE)和phosphatidylglycerol (PG)、细菌磷脂的主要组件。
除了苏丹人民解放军2集团(cPLA2也被认为是重要的炎症信号36。目前的结果显示,解放军的表达2IVA mRNA大于解放军2国际内部审计师协会的《职业健康受试者的鼻粘膜。这cPLA2的重要性是AA解放最令人信服的结果通过实验与解放军2IVA不足的老鼠。这样的研究表明,IVA形式是过敏反应的重要性和巨噬细胞炎症介质的生产36,37。这表明解放军的角色2IVA气道炎症。除了中国人民解放军2IVA,还发现两小说的mRNA IVB和印度河流域文明形式司长委任的鼻粘膜。生化特性的歌等。38表明IVA偏爱sn-2位置和IVB sn-1位置,司长委任在印度河流域文明酶能有效地坚持在两个位置。IVA和IVB都calcium-dependent酶虽然印度河流域文明不是司长委任。这表明不同的生物角色或规定这些cPLA2形式。
近年来另一个没有2(V型)与炎症信号和结果已经表明,一些关于PLA2花絮应该重新考虑在解放军的存在的光2V7。在目前研究V形式才发现五个健康人。重复的努力展示解放军2V粘膜样本中这一个人成功,表明表达式是偶尔的,这种形式被一些刺激诱导在那个特定的时间点。还需要进一步的研究来调查如果解放军2形式也许是高表达患者的气道炎症。
综上所述,解放军的问题2活动和监管是越来越复杂。新计划2与未知函数形式,影响肺癌之间不同的解放军2年代39某些人民解放军,拼接变异2年代15,大量的蛋白质可能会影响计划2活动13,40,41所有加起来是一幅巨大的复杂性。是很重要的,然而,以获得更深层次的知识的作用和监管每一个中国人民解放军2因此能够开发新的和更具体的anti-PLA2药物。本研究根据鼻粘膜为进一步的研究提供了一个位置,在大多数,如果不是所有的中国人民解放军2形式表达。
总之,人们已经发现,大量的磷脂酶a2类型是正常的人类鼻粘膜中表达。此外,首次调查表明,新发现的磷脂酶的存在2IID形式,国际教育协会,三世,IVB,司长委任印度河流域文明,X和胞质calcium-independent membranebound磷脂酶A2(iPLA22)。这些磷脂酶的确切功能2形式还不清楚。鼻粘膜经常暴露于环境因素如粒子,化工、过敏原和微生物的存在几个磷脂酶的信使核糖核酸2形式可能因此反映需要快速响应和对这些刺激的第一道防线。但是很有可能,这些计划的一个或多个2酶是重要的花生四烯酸和/ 1 -O鼻粘膜-alkyl-lysophosphatidylcholine释放。未来的研究针对识别的分子机制鼻粘膜的炎症反应或疾病因此将不得不考虑这些发现。
确认
作者希望感谢k . Irander执行临床检查。
- 收到了2000年6月19日。
- 接受2001年3月3日。
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