摘要
神经生长因子(NGF)最近被认为有助于哮喘的炎症和支气管高反应性。然而,在人类肺和气道中能够产生NGF的细胞类型,以及促炎细胞因子和糖皮质激素对肺细胞中NGF分泌的调节作用,尚未被描述。
人肺成纤维细胞在存在或不存在白细胞介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和/或糖皮质激素的情况下培养。用酶联免疫吸附法测定NGF分泌。
人肺成纤维细胞组成性地分泌NGF在体外.NGF分泌速率被证明是细胞密度依赖性的,因为在融合前细胞中检测到更高的NGF分泌,即。细胞间接触不明显(41.0±5.0 pg·10)−680%合流处的细胞),高于密度较高的细胞(8.2±3.4 pg·10)−6细胞100%汇合)。促炎细胞因子IL-1β刺激(0.3-30 U·mL−1)或TNF-α (0.1-30 ng·mL−1)剂量和时间依赖性(8-72 h)增加了NGF分泌(引起50%最大反应的有效浓度(EC50)=2.9 U·mL−11.0 ng·mL−1分别)。布地奈德糖皮质激素治疗(10−7M)显著减少了42%的NGF的构成性分泌,并使细胞因子刺激的NGF分泌减弱到相同水平。
总之,人肺成纤维细胞可能是肺中神经生长因子的来源,受哮喘相关和促炎细胞因子白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的正向调控,受抗炎糖皮质激素的负向调控。
该项目由INSERM资助。C. Olgart得到了瑞典MRC、T.和R. Söderberg基金会、E.和E. Fernström基金会以及Comité Départemental du Bas-Rhin Contre les diseases respiratory atoires et la结核病、UCB过敏研究所(比利时布鲁塞尔)的支持。
神经营养神经生长因子(NGF),除了其对神经生长和存活的基本活性外1,2最近已被证明是一种重要的炎症介质。动物实验证明,NGF可能促进气道高反应性的发展3.- - - - - -5以及肺部感觉和交感神经的增加4,并可能引起气道感觉神经元的表型改变4.NGF对免疫系统的细胞也有深远的影响,其中许多细胞在肺部炎症和哮喘相关症状的发展中至关重要。因此,NGF增加了外周组织中肥大细胞的数量6促进肥大细胞分化7和生存8.此外,NGF刺激淋巴细胞存活、增殖和分化,增强嗜酸性粒细胞存活和细胞毒性9.此外,NGF刺激肥大细胞脱颗粒和介质上调和释放1,2,10;它还能促进各种其他炎症细胞的介质释放,包括嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和t细胞1,2,9,10.
除了肺和气道外,还研究了多种细胞来源,并证明它们可以合成和分泌NGF。其中包括免疫系统的细胞,包括肥大细胞11、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞1,2,9,10,以及结构细胞,如成纤维细胞和各种来源的血管平滑肌细胞1,2,10.然而,关于肺和气道细胞分泌NGF的信息很少。
在本研究中,假设肺成纤维细胞可能是人体NGF的来源,并研究了促炎细胞因子和哮喘相关细胞因子白细胞介素-1β (IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)以及抗炎糖皮质激素对NGF分泌的调节。
材料与方法
人肺成纤维细胞的原代培养
如前所述,通过外植体技术获得人肺源性成纤维细胞12,13.宏观上正常的人肺组织是在支气管癌开胸时得到的。捐赠者没有诊断出过敏、肺纤维化或肺气肿。其中一人患有慢性阻塞性肺病。每个供体的肺组织被切成0.5-2毫米的碎片3..用Eagle's最小必需培养基(MEM)在37°C下洗涤3次,每次10 min,并添加10%胎牛血清(FBS)、MEM非必需氨基酸(1:100)、l-谷氨酰胺(2 mM)、青霉素(150 U·mL)−1)、链霉素(150µg·mL−1),庆大霉素(25µg·mL−1),两性霉素B (Fungizone®,1µg·mL−1)(所有产品均来自法国Cergy Pontoise的Gibco BRL)。将其镀在35mm组织培养皿(Costar, Cambridge, MA, USA)上,在室温下放置10分钟以促进外植体粘附,随后在37℃的相同培养基中,在含5%二氧化碳(CO . 2)的湿空气中培养2),每星期更换两次。2-3周后取出外植体。从外植体中生长出来的细胞在1-2周内达到合流。用汉克平衡盐溶液(HBSS;Gibco BRL),胰蛋白酶化(胰蛋白酶-乙烯二胺四乙酸(EDTA), Gibco BRL) 3分钟,离心并在由MEM补充10%胎牛血清、MEM非必需氨基酸(1:100)、l-谷氨酰胺(2 mM)、青霉素(50 U·mL)组成的培养基中重悬−1)、链霉素(50µg·mL−1),并在25厘米处重栽2水瓶(配角)。成纤维细胞随后在汇合处以1:4分裂,并在75 cm中培养2培养瓶(Costar)中的成纤维细胞生长培养基基于Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM/F12)(1:1),添加10%胎牛血清、MEM非必需氨基酸(1:100)、l-谷氨酰胺(2 mM)、青霉素(50 U·mL)−1)、链霉素(50µg·mL−1)和胰岛素(5µg·mL)−1)(莉莉,圣克鲁,法国)。细胞被用于第六或第七代实验。细胞在形态和免疫细胞化学上被表征为成纤维细胞,使用单克隆小鼠抗人成纤维细胞抗体(5B5),该抗体与脯氨酸-4-羟化酶的β亚基和二硫异构酶反应(Dako, Trappes,法国)。
试验协议
所有实验都是在生长培养基(DMEM/F12, 10% FBS)中培养的细胞,并在低FBS(0.3%),无胰岛素的DMEM/F12培养基中饥饿(24小时)25厘米2烧瓶。
在两组不同的实验中测定了细胞生长和NGF的密度依赖性分泌。首先,以不同密度(4,000、12,000或24,000 cells·cm)播种细胞−2),在生长条件下培养2天,饥饿24小时,24小时取细胞上清液。其次,以4000 cells·cm为种子,研究饥饿24小时后NGF的分泌情况−2在有或无IL-1β (10 U·mL)的条件下培养1-8天−1) (Boehringer-Mannheim GmbH,德国)。4 d后细胞汇合度达到80%,6 d后细胞汇合度达到80%。4天培养4000个种子细胞·cm−2,对应80%合流状态,选择24 h的饥饿期,进一步进行调节NGF分泌的实验。
研究了存在或不存在IL-1β (10 U·mL)时NGF的时间依赖性分泌模式−1)孵育2、8、24、48或72 h。通过增加浓度的IL-1β (0.3-30 U·mL)刺激细胞,研究了IL-1β和TNF-α的剂量依赖性效应−1), TNF-α (0.1 ~ 30 ng·mL−1) (Prepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ, USA)或两者同时进行24小时。研究糖皮质激素对IL-1β (10 U·mL)作用细胞的影响−1), TNF-α (10 ng·mL−1)或盐水24小时,在有无布地奈德(10−7M)(阿斯利康,隆德,瑞典),地塞米松(10−6M) (Sigma化学公司,圣路易斯,密苏里州,美国),或溶剂。糖皮质激素或溶剂与IL-1β、TNF-α或生理盐水同时加入。
在所有实验中,收集细胞上清液,冷藏,离心(4°C, 1200 rpm, 5分钟),并在−20°C保存,直到分析。用HBSS冲洗细胞,胰蛋白酶化,并在Neubauer室计数以确定细胞总数。细胞因子和糖皮质激素均对细胞数量无影响。用台盼蓝染料排除法评估细胞活力。在至少3-5个不同受试者的细胞材料上进行了重复实验。
酶联免疫吸附法测定神经生长因子
根据制造商(Promega, Madison, WI, USA)指示的程序,使用商业NGF特异性、高灵敏度、双位点酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对分泌到对照和处理过的成纤维细胞上清中的NGF进行定量。简单地说,96孔免疫板(MaxiSorp™,Nunc, Roskilde,丹麦)在包覆缓冲液(25 mM碳酸盐岩缓冲液,pH 9.7)中被多克隆山羊抗人NGF抗体包覆。在4°C孵育过夜后,清洗盘子(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween®-20),并在堵塞缓冲液(由制造商提供)中孵育1小时。将上清液和标准重组人NGF稀释液在低浓度(0.3%)fbs培养基中,在37°C的潮湿室中孵育到孔中至少6小时,并清洗。大鼠抗ngf单克隆抗体(0.25µg·mL−1)在4°C下孵育过夜,并清洗。加入抗大鼠辣根过氧化物酶偶联免疫球蛋白- g (IgG),孵育2.5 h。最后加入底物(0.02% 3,3 ',5,5 ' -四甲基联苯胺和0.01%过氧化氢酶)。用1 M磷酸停止比色反应10 min,在450 nm处测定光密度。所有测量一式两份。该技术允许在3.9-500 pg·mL范围内检测NGF−1.
结果表达及统计分析
数据以均数±sem表示,单位为pg NGF·mL−1培养上清液,单位为pg NGF / 106细胞,或对照分泌物(溶剂)的百分比。经Kolmogorov和Smirnov方法检验,被测群体服从高斯分布。采用未配对双尾t检验分析组间差异,或在适当时采用Tukey-Kramer后测进行单向方差分析(GraphPad InStat, GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。p<0.05为显著。
结果
与细胞密度相关的神经生长因子分泌
培养的肺成纤维细胞分泌NGF,细胞上清中NGF蛋白的测定证明了这一点。首先研究了不同播种密度(24000、12000和4000细胞·cm)下NGF的细胞密度依赖性分泌模式−2)在第二天。在24000细胞·cm处播种−22天后达到合流,每10人分泌7.0±1.0 pg NGF6细胞每24小时。在12000个(约80%合流)和4000个(近合流)细胞·厘米处播种−2每10人分泌2.7倍(p<0.001)和9.4倍(p<0.001)的基础NGF6细胞每24小时分别。播种密度4000细胞·mL−1被选作进一步实验。
培养第1 ~ 4天,上清液中NGF积累量增加(7.8±0.8 ~ 12.2±1.5 pg·mL)−1每24小时,p<0.05),正常化到细胞数量后,观察到NGF分泌显著进行性减少(p<0.001)(图1a⇓).每10个NGF的分泌量更高6在融合前细胞中检测到细胞,即。细胞间接触较少(如。41.0±5.0 pg·10−6与密度较高的细胞相比(8.2±3.4 pg / 106最大分泌量为161.3±20.2 pg / 10,最小分泌量为5.8±2.0 pg / 10,差异为27.8倍6分别在第1天和第8天每24小时培养细胞)。
白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α对神经生长因子分泌的影响
IL-1β (10 U·mL−1)诱导NGF分泌在培养第2天至第8天显著增加(图1a⇑).在第4天观察到最大的增加(2.9倍)(图1a⇑),即用作进一步实验的时间。因此,生长周期为4天,播种密度为4000细胞·mL−1所有其他研究NGF分泌调节的实验均选择24 h的饥饿期。
第4天,2 ~ 24 h细胞上清液中NGF呈显著的时间依赖性富集(6.9±0.4 ~ 13.2±1.5 pg·mL)−1(p < 0.05);图1 b⇑), 24-72 h检测到稳定的NGF分泌(图1b⇑).IL-1β (10 U·mL−1)诱导NGF分泌显著增强8 - 72 h,最大在8和24 h(2.2倍;图1 b⇑).
IL-1β (0.3-30 U·mL−1)和TNF-α (0.1 ~ 30 ng·mL−1)均诱发24小时NGF分泌的剂量依赖性增强(图2⇓), IL-1β (30 U·mL)升高幅度最大,为124%−1) (EC50=2.9 U·mL−1), TNF-α (30 ng·mL)为114%−1) (EC50=1.0 ng·mL−1).结合两种细胞因子时,IL-1β (0.1-3 U·mL−1)和TNF-α (0.1-1 ng·mL−1),观察到对NGF分泌的附加刺激作用(图3⇓).
糖皮质激素对神经生长因子分泌的影响
研究了糖皮质激素对构成性和细胞因子刺激下NGF分泌的影响。布地奈德(10−7M)显著降低NGF的构成性分泌42%,降低IL-1β (10 U·mL)−1)和TNF-α (10 ng·mL−1)刺激的NGF分泌分别增加了70%和62%(图4⇓).地塞米松也有类似的效果(10−6M),本构分泌减少39% (p<0.05), IL-1β (10 U·mL−1)刺激分泌增加72% (p<0.001;没有显示)。溶剂对NGF分泌无影响。
讨论
本研究提供的证据表明,培养的人肺成纤维细胞组成性地产生NGF,其水平因促炎和哮喘相关细胞因子IL-1β和TNF-α而升高。此外,糖皮质激素诱导肺成纤维细胞的构成性和细胞因子刺激的NGF分泌减少。
目前的研究表明,NGF可能是由培养的人类肺结构细胞分泌的,即。肺成纤维细胞。这一发现与其他来源的人类成纤维细胞的研究一致,如。皮肤,表达和分泌NGF14,15.然而,在同一类型的细胞中,NGF表达的差异调节已被报道,即。成纤维细胞,来自不同的组织,在人类发育的不同阶段15,16.例如,卡特赖特et al。15在人胚胎肺成纤维细胞中未检测到NGF信使核糖核酸(mRNA)的表达,而在胚胎后皮肤成纤维细胞中观察到表达。由此可见,在生命或分化过程中,不同的分子机制可能调控着人NGF基因的表达或转录。
有趣的是,目前的数据表明,人肺成纤维细胞分泌的NGF在培养过程中不是恒定的。在细胞培养初期较高,随着细胞数量的增加而降低,汇合后达到最低水平。研究清楚地表明,这种现象是细胞密度依赖性的,因为在增加密度的情况下,细胞的NGF分泌会减少。这表明,与细胞间接触较少的细胞相比,细胞间接触较少的细胞分泌更多的NGF。这些结果与小鼠星形胶质细胞分泌NGF的研究结果完全一致17,18,上皮细胞19以及人类皮肤成纤维细胞14,其中细胞密度依赖性分泌已被报道。
此外,研究数据还表明,当促炎细胞因子IL-1β和TNF-α刺激肺成纤维细胞时,肺成纤维细胞分泌的NGF水平升高。这种增加的分泌是时间和剂量依赖的。这些结果与从其他结构细胞(如大鼠坐骨神经源性成纤维细胞)获得的数据一致20.或者人类皮肤成纤维细胞21其中NGF分泌增强是对IL-1β和/或TNF-α的反应。此外,研究表明IL-1β和TNF-α的组合对人肺成纤维细胞NGF的分泌产生了额外的刺激作用。后一发现与观察到的两种细胞因子组合对瑞士3T3细胞NGF分泌的协同刺激作用不完全一致22.这些不同的结果可能反映了TNF-α和IL-1β刺激的信号转导通路在不同细胞类型中的不同调控和交叉作用。这与NGF分泌的调节以细胞和组织特异性的方式发生的概念是一致的,其中类似的刺激可能在不同的细胞中产生不同的影响16.因此,当描述炎症介质对NGF分泌的控制时,建议直接测试器官和组织特异性细胞。
过量的IL-1β和TNF-α与包括哮喘在内的肺部和气道炎症的发病机制有关23.此外,许多参与炎症反应的细胞,如巨噬细胞、肥大细胞或淋巴细胞,是IL-1β和TNF-α的重要来源。它们在成纤维细胞附近被发现,因此可能能够刺激NGF分泌原位.事实上,两种细胞因子的剂量都在它们在气道炎症中表达时的生物学作用范围内24,以及在其他方面在体外电池系统20.,21.因此,目前的结果支持IL-1β和TNF-α在肺部炎症中刺激成纤维细胞分泌NGF的潜在重要作用。这增加了肺中潜在的IL-1β-和TNF-α反应基因的列表。然而,还需要进一步的研究来揭示IL-1β和TNF-α是否通过刺激NGF的产生参与调节肺和气道功能。
促炎细胞因子IL-1β和TNF-α促进NGF分泌,提示肺部炎症期间NGF水平可能升高。最近的研究表明,哮喘患者血清NGF水平升高,尤其是严重过敏性哮喘患者25.与健康个体相比,哮喘患者的支气管肺泡灌洗液中NGF水平较高10,26以及哮喘过敏原挑战后27.NGF的分泌最有可能来源于肺和气道细胞,如成纤维细胞作为结构细胞和/或浸润的炎症细胞,如肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或淋巴细胞,它们是肺和气道中NGF的其他潜在来源。肺成纤维细胞被IL-1β和TNF-α激活后产生NGF水平升高的能力表明这些细胞可能参与局部炎症事件的调节。因此,成纤维细胞可能不仅是介质作用的最终靶细胞,而且是能够参与进一步启动周围炎症细胞的介质来源。
目前,NGF在人体肺和气道中的作用尚不清楚。NGF被认为是免疫/炎症细胞以及外周神经元的旁分泌生存因子1,2.事实上,最近的研究表明,炎症/免疫细胞表达NGF的高亲和力细胞表面受体,酪氨酸激酶受体A (TrkA)。1,2,9- - - - - -11外周神经元分别表达NGF、TrkA和分子量为75000 kDa的蛋白(p75)的高亲和力受体和低亲和力受体1,2,9,10.因此,炎症/免疫细胞以及神经元可能是呼吸道中释放的NGF的目标。此外,最近有报道称NGF有助于气道高反应性的发展3.,5通过神经激肽-1受体依赖机制。这种神经“敏化”可能是NGF对感觉神经的直接作用,也可能间接涉及一些炎症细胞,如肥大细胞10,11或辅助t细胞2 (Th2)3.,10.因此,越来越多的证据表明NGF可能参与肺部和气道的各种病理状况。
由于皮质类固醇已知具有强大的抗炎作用,在临床上可有效抑制肺部和气道炎症,因此还确定了布地奈德和地塞米松是否能够抑制人肺成纤维细胞分泌NGF。本研究发现,构成性NGF分泌明显减少。此外,IL-1β-和TNF-α刺激的NGF分泌也被抑制到同样低的水平。这些发现与研究表明皮质类固醇也抑制其他几种促炎因子的产生,如IL-6、IL-8、IL-11、粒细胞巨噬细胞集束刺激因子(GM-CSF),或调节纤维母细胞的活化、正常t细胞的表达和分泌(RANTES)一致28.尽管糖皮质激素对NGF表达有抑制作用,例如,小鼠成纤维细胞系L929或大鼠坐骨神经源性成纤维细胞10,29,糖皮质激素的刺激作用可能存在于其他细胞系统,如海马神经元1,2.这些数据表明,糖皮质激素可能在炎症状态下抑制过度的NGF分泌,人肺成纤维细胞可能是糖皮质激素抗炎作用的重要治疗靶点28.在大鼠成纤维细胞中报道,糖皮质激素对NGF分泌的抑制作用可能涉及NGF mRNA稳定性的降低29,或如Lindholm所提出的转录抑制et al。29.最后一种机制可能涉及糖皮质激素和转录因子激活蛋白-1 (AP-1)之间的相互作用,AP-1的结合位点存在于人类NGF基因的启动子区域30..然而,这种参与必须在人类肺成纤维细胞中得到证实。
总之,目前的研究结果表明,人肺成纤维细胞可能是神经生长因子的重要来源,促炎和哮喘相关细胞因子白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α可能促进神经生长因子的分泌。考虑到新发现的神经生长因子对动物哮喘相关症状的影响3.,5,成纤维细胞可能通过刺激神经生长因子分泌,在气道炎症中起积极作用。此外,抗炎糖皮质激素减少神经生长因子的增强生产。因此,这项研究在抗炎糖皮质激素的作用机制中添加了一些新的元素,抑制肺成纤维细胞过度分泌神经生长因子。
致谢
作者感谢G. Massard (Hôpitaux斯特拉斯堡大学,法国)和B. Gasser (Institut d'Anatomie Pathologique, Hôpitaux斯特拉斯堡大学,法国)为我们提供了肺样本,M-E。感谢Behra, C. Duvernelle和E. Mathieu对初始实验和原代细胞培养的慷慨帮助。作者还希望感谢R. Brattsand,阿斯利康,隆德,瑞典,布地奈德的友好礼物。
- 收到了2000年8月8日。
- 接受2001年1月25日。
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