摘要
临床研究提示p16与预后相关INK4A而在非小细胞肺癌(NSCLC)中,p53的研究结果却相互矛盾。然而,凋亡调节基因BAX (p53的下游调节因子)在NSCLC预后中的重要性尚不清楚。本研究调查了BAX与p53和p16状态的预后相关性INK4A61例晚期NSCLC患者。
BAX、p53、p16蛋白表达INK4A采用免疫组化法进行回顾性研究。采用单链构象多态性聚合酶链反应(PCR)检测肿瘤脱氧核糖核酸(DNA)中p53突变,采用片段长度分析检测BAX移码突变。
BAX蛋白表达阳性的患者中位生存期(14个月)明显长于未表达BAX的患者(6个月,p=0.0004)。相反,p53状态不影响预后。p16患者INK4A阴性肿瘤的生存期明显短于p16阳性肿瘤的生存期(4个月)INK4A蛋白表达(15个月,p=0.0001)。此外,p16的丢失INK4A蛋白质表达与远处和晚期淋巴结转移的压力密切相关。在p16阳性的20名患者亚组中,生存率最高INK4A表达和完整的BAX (p=0.0002)。
本研究结果提示BAX和p16的丢失INK4A表达是非小细胞肺癌预后不良的独立标志物。该研究表明,细胞凋亡相关基因的多标记分析可能有助于确定个体化治疗和确定基因替代治疗的靶点。这应该在一个有更大队列患者的前瞻性研究中进行评估。
肺癌是西方世界最普遍和最致命的癌症,其发病率的增加主要归因于吸烟1,2.尽管新的化疗药物和多模式治疗策略不断发展,但非小细胞肺癌(NSCLC)的生存率仍然保持不变且较低。肺癌生物学特征的新预后标志物的鉴定可能是有帮助的,因为它们可以作为分子水平上预测放疗和化疗反应的基础3..
调节细胞凋亡和细胞周期进展的基因是预后标志物的候选者,如。P16和p53,已经是研究的目标。P16是调节细胞周期进程的基因。肿瘤抑制特性首次被描述为p16INK4A由Okamotoet al。4,其预后相关性已被证明与各种癌症。p16的失活INK4A与胰腺腺癌不良预后相关5,恶性黑色素瘤6,并切除了NSCLC7.实验数据也显示了p16的合作INK4Ap53在细胞凋亡诱导中的作用8,9.p53与预后相关性的研究显示了相互矛盾的结果10.p53突变的NSCLC对放疗和顺铂的影响表现出耐药性11由于完整的p53缺乏促凋亡功能。
BAX是一种促凋亡基因,受p53调控,因此可能是预后标志物的候选者。该基因产物是肿瘤抑制基因p53的下游效应子,并通过转录激活上调。此外,有强有力的证据表明BAX在恶性肿瘤中的预后相关性。Sturmet al。12发现BAX低表达是结直肠癌切除肝转移患者的负面预后因素。此外,有证据表明BAX或p16基因受损INK4A基因在肿瘤发生过程中对细胞凋亡产生抗性,但也对抗肿瘤治疗产生抗性。在乳腺癌患者中,BAX表达降低与化疗反应差和总生存期短相关13.乳腺癌细胞系BAX表达的恢复增加了对细胞毒性药物治疗的敏感性14同时也抑制了肿瘤的发生15.
p16的预后相关性INK4A研究了晚期NSCLC中BAX状态与p53的关系。基于其他癌症的预后相关性数据和p16的合作INK4ABAX和p16可能与BAX和p16的预后相关INK4A假设蛋白在晚期NSCLC肿瘤中的表达。
患者与方法
病人
具有代表性的肿瘤样本(2个)来自连续61例非小细胞肺癌患者的尸检原发肿瘤(47名男性,14名女性,中位年龄65岁,46-83岁),并进行回顾性分析。1992-1996年期间,所有患者都在莱比锡大学医疗中心和相关学术医院接受治疗。肿瘤组织学分类由两名病理学家根据世界卫生组织指南进行16.在诊断时根据修订的肺癌肿瘤、淋巴结、转移(TNM)分期系统确定肿瘤分期17.在患者医生的帮助下,对患者的生存时间和临床数据进行回顾性评估(表1)⇓).
BAX、p53、p16免疫组化分析INK4A
p53、p16蛋白表达INK4A, BAX用2µm福尔马林固定的石蜡包埋组织切片免疫组化分析。切片在0.01 mol·L的柠檬酸缓冲液中脱蜡10 min后煮沸−1pH 6.0)用于抗原掩膜。用鱼血清阻断后(SEA BLOCKTM, Pierce, Rockford, IL, USA),切片与一抗抗p53抗体(DO-1, pharingen, Hamburg, Germany;稀释1:50),抗bax单克隆抗体(YTH-2D2, Trevigen, Gaithersburg, MD, USA;稀释1:500),抗p16INK4A抗体(G175-405, pharingen,汉堡,德国;稀释1:50)。结合的一抗通过生物素偶联的二抗体和过氧化物酶偶联的链霉亲和素(Jackson免疫研究实验室,西格罗夫,PA,美国),使用金属增强的即3,3 ' -二氨基胺(无空格和3)3 ' -二氨基联苯胺(DAB)作为底物(Pierce, Rockford, IL, USA)来观察。切片用苏木精反染。
切片由两名不了解临床和组织学数据的观察者以盲法进行分析。4个高功率场(400×)评估定位和阳性细胞百分比(0-100%,5%步长)。如果>10%的肿瘤细胞显示中度或强烈的核染色,则认为样品为阳性。
p53突变分析
从30 μ m石蜡包埋组织切片中提取脱氧核糖核酸(DNA)。用InViSorb分离脱腥和复水后的基因组DNATM基因组DNA试剂盒II (InViTek,柏林,德国)。
为检测p53 DNA结合区突变,采用单链构象多态性聚合酶链反应(PCR)分析。模板DNA采用寡核苷酸引物对PCR扩增外显子5-8。扩增片段在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分析,使用DNA银染色试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)根据制造商规范进行银染色。
BAX移码突变检测
按照前面描述的引物序列和循环条件,通过PCR扩增了包在G(8)区BAX外显子3的94 bp片段12,18,使用荧光染料HEX标记的反向引物(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。使用ABI 310测序仪(Perkin Elmer, Weiterstadt, Germany)分析PCR片段长度。以BAX等位基因均突变(1个插入(G(9))和1个缺失(G(7))的人结肠癌细胞株LoVo为阳性对照,以人结肠癌细胞株SW620为野生型对照。在稀释实验中,片段长度分析的敏感性(截止值:10%突变细胞)和在盲法实验中,特异性(100%)得到了证实。
统计分析
用Kaplan-Meier积限法估计总生存期。统计学比较采用Logrank Mantel-Cox检验。大多数生物和病理变量被用作二分(分类)变量。患者被分为阳性(p53pos,伯灵顿pos,和p16INK4Apos)与负(p53负的,伯灵顿负的,和p16INK4A负的).P53基因状态细分为P53野生型(wt)与P53突变(无足轻重的人).BAX、p53、p16免疫组化数据的截止值INK4A设置为10%阳性染色细胞,即。肿瘤中染色细胞≥10%为阳性,<10%为阴性12.
BAX, p53, p16的相关性INK4A根据肿瘤分类及临床参数,采用Pearson卡方检验。
对于生存分析,BAX, p53和p16阳性和阴性亚组中不同治疗方法的患者分布相等INK4A考虑使用费雪精确测试。
结果
后续
在诊断时,61例患者中的大多数为IV期肿瘤(61例中的33例),而只有28例(46%)为I期至III期。16例因晚期才接受最佳支持治疗,23例手术切除,18例化疗,17例放疗。5例患者接受手术+辅助化疗,4例患者接受手术+放疗,4例患者接受化疗+放疗。这些患者在BAX阳性和阴性亚组中分布均匀(Fisher's Exact test p>0.15), p53 (Fisher's Exact test p>0.99)和p16INK4A(Fisher’s Exact test p>0.99)以及p53突变状态亚组(Fisher’s Exact test p>0.39)。
中位生存期为9个月。1年和2年的总生存率(包括手术治疗患者的30天围手术期死亡率)分别为38%和10%。
p53表达的免疫组化分析
p53蛋白过表达31例,p53表达细胞平均63±4% (mean±sem)。23个肿瘤的p53阳性染色率为0%,1个样本为5%,6个样本的p53阳性染色率为10%。
将p53蛋白表达状态与肿瘤及临床参数进行相关性分析。肿瘤参数(大小、淋巴结转移状态、远处转移状态、肿瘤分期、分级、组织学分级)和临床参数(年龄、性别、治疗状态)均与p53表达无显著相关性。
BAX表达的免疫组化分析
31例患者未发现BAX表达细胞。在其余30例病例中,BAX表达在所有评估细胞的65±4%中观察到。BAX表达与远处转移、分级类型有显著相关性。有远处转移的肿瘤中有64% BAX阴性,而没有远处转移的肿瘤中只有36% BAX阴性(p<0.03)。
G2型患者中BAX表达缺失的比例为37%,G3型患者中BAX表达缺失的比例为66% (p<0.03),这表明BAX表达缺失可能与肿瘤组织的组织学分化减少有关。肿瘤样本中未见G1和G4分级型。
p16免疫组化分析INK4A表达式
p16INK4A35例有表达细胞,平均表达54±4%,25例无表达,1例有5%的阳性细胞。
组织学分类和临床参数均未显示与p16有显著相关性INK4A表达式。肿瘤大小或分期与p16之间也没有相关性INK4A表达式。
与BAX和p53分析相比,p16缺失INK4A在淋巴结转移患者中表达更为频繁。在N2期79%和N3期53%的样本p16阴性INK4A而在N0期和N1期p16缺失INK4A分别在16%和31%的病例中发现了表达(p<0.002)。此外,p16缺失INK4A在58%的远处转移患者肿瘤中观察到表达,但在没有远处转移的患者中只有25% (p<0.01)。
p16丢失INK4A2级(G2)有28%的病例表达,3级(G3)有59%的病例表达(p<0.016),这与BAX表达的结果相似。
p53和BAX突变分析
在32个原发肿瘤中(53%)发现p53基因突变。共检测到37个突变:外显子5 7个,外显子6 5个,外显子7 17个,外显子8 8个。5个原发肿瘤在两个外显子中显示突变。p53突变的肿瘤蛋白表达没有显著增加。53%的p53突变病例与在没有p53突变的病例中,50%的人p53染色呈阳性。
BAX在37±7%的p53突变肿瘤中表达与在p53野生型肿瘤中(Fisher’s Exact test p>0.99),这表明p53并不是这些样本中BAX蛋白表达的唯一决定因素。
61个肿瘤中没有一例BAX基因出现移码突变。
p53, BAX, p16的相关性INK4A与生存
确定p53蛋白表达和突变状态(外显子5-8)以及BAX和p16的表达对预后的影响INK4A,单因素生存分析。
p53蛋白表达对预后无影响pos中位生存期7个月;p53负的中位生存期9个月;P =0.79)或p53突变状态(p53wt中位生存期10个月;p53无足轻重的人中位生存期6个月;p = 0.64)。
肿瘤中BAX表达的患者与未表达BAX的患者相比(中位生存期6个月;p = 0.0004;图1⇓).此外,通过比较I-III期、IV期和治疗干预等亚组的生存时间和BAX表达,排除了异质组患者的稀释效应(表2)⇓).
基于之前关于转移性结直肠癌的研究数据12,在生存分析中纳入p53突变状态证实了BAX作为预后标志物的作用,对p53进行了进一步的生存分析wt/ p53无足轻重的人和p53pos/ p53负的子组和BAX表达,也列于表2⇑.结果最好的是p53wt/伯灵顿pos组(中位生存期18个月),在p53pos/伯灵顿pos组中位生存期16个月。
p16生存时间分析INK4A包括亚群的蛋白表达也见表2⇑.这里是p16的病人INK4A与没有p16的患者相比,他们的肿瘤表达表现出最好的结果INK4A表达式(p = 0.0001;图2⇓).此外,对p16组合的生存率进行了分析INK4Ap53的状态wt/ p53无足轻重的人, p53pos/ p53负的和伯灵顿pos/伯灵顿负的,如表2所示⇑.p16组的结果最差INK4A负的/伯灵顿负的组患者(中位生存期2个月),p16最佳INK4Apos/伯灵顿pos患者组(中位生存期16个月,图3⇓).
讨论
分析显示BAX和p16有预后价值INK4A.P53过表达或P53突变对生存无显著影响。尽管许多研究已经调查了p53在非小细胞肺癌发生中的意义,但p53改变在肺癌中的预后意义似乎相当微弱10,19.与p53相比,BAX表达的患者在总生存期分析中预后明显更好(生存期延长8个月)。这些数据与之前的一项研究结果一致,在该研究中,BAX表达降低是结直肠腺癌患者的不良预后因素12.BAX高表达对卵巢癌也有积极的预后影响20.,乳腺癌21,22,以及胰腺癌23.相反,在另一项研究中,BAX表达与更好的结果无关,该研究使用肿瘤细胞中50%的蛋白质表达水平作为将BAX表达分为“阳性”或“阴性”的临界值。24.在本研究中,如Sturm先前报道的那样,将截断值设置为10%的阳性染色细胞为“阳性”et al。12.
BAX缺乏表达的一个可能原因是BAX基因的移码突变,这在结直肠癌中经常发现12,18这就导致了一种不被表达的被截断的蛋白质。与其他小组的研究结果一致25,26本研究队列中未发现BAX基因的移码突变,提示BAX基因的体细胞移码突变并不是肺癌发生中BAX失活的重要机制。
当添加p53突变状态、p53蛋白表达和BAX蛋白表达的信息时,BAX阳性预后相关性的二分法变得更加引人注目。这一结果与结直肠癌的研究结果一致12.BAX缺失的后果是BAX不能作为p53的效应因子诱导凋亡,导致肿瘤细胞在p53完好的情况下仍具有生长优势。有趣的是,在一些携带突变p53的患者中可以检测到BAX的表达。然而,BAX表达和p53过表达的患者比p53未过表达的患者预后更好。这一意外发现的一个可能原因可能是p53突变状态和p53过表达之间缺乏相关性。
本研究还包括对p16的影响的调查INK4A非小细胞肺癌的预后免疫组化法分析p16INK4A由于遗传(纯合和杂合缺失,以及外显子1和2的点突变或缺失)和表观遗传(启动子区域CpG岛的高甲基化)改变导致无功能蛋白或p16的部分或完全丢失INK4A表达式27,28.40%的肿瘤没有p16INK4A在蛋白质表达方面,这与其他的结果相似7,29.研究了来自原发肿瘤的两个代表性样本,它们在每个病例中都具有可比性。未分析淋巴结转移或远处转移的探针,但Marchettiet al。29显示p16的一致性INK4A淋巴结阳性NSCLC的原发肿瘤和淋巴结转移情况。
肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况和远处转移状况是常规预后指标。p16基因缺失与此无关INK4A本研究根据Taga的结果观察蛋白表达和肿瘤分期et al。30.和黄et al。31.然而,其他研究小组确实发现了这种相关性7,29,32.此外,与川渊一致et al。32肿瘤分级与p16缺失之间的相关性INK4A观察蛋白表达,与Taga的结果相反et al。30.,马et al。29,黄et al。31.肿瘤分级与BAX蛋白表达的缺失有进一步的相关性。在一些分析中p16INK4A在早期NSCLC中,失活与淋巴结转移密切相关29,32而在其他报道中,情况并非如此30.,31.在本研究中,发现p16之间存在相关性INK4A蛋白表达与淋巴结转移情况。远处转移情况与BAX和p16相关INK4A蛋白表达。虽然大多数作者研究了早期肿瘤阶段,但在本报告中主要研究了晚期肿瘤,这可能导致了前面描述的相互矛盾的结果。
此外,NSCLC患者表达p16INK4A在肿瘤组织中有明显的预后优于p16INK4A阴性肿瘤(图2⇑).本研究的结果支持来自其他组描述p16缺失的数据INK4A蛋白表达是NSCLC早期预后的一个阴性指标29- - - - - -32.相比之下,本村et al。33未发现p16对预后有益处INK4A蛋白在早期NSCLC中的表达。然而,当肿瘤期为IV期的NSCLC纳入本研究时,p16对预后的积极影响INK4A存活的蛋白质表达变得更加明显。
为了评估在异质患者组的统计分析中可能的稀释效应,对反映阶段和治疗状态的亚组进行了分析。这里是BAX和p16的独立预后影响INK4A也可以显示。然而,接受最佳支持治疗的患者组的BAX状态没有显示出对预后的影响。虽然这些结果不排除其他参数的任何影响,但亚组生存时间的差异表明了不同预后参数的联合作用,如治疗状态(手术、放疗和化疗)和蛋白质表达。结合p53、BAX、p16蛋白表达分析INK4A本研究中的表达似乎可以识别预后良好的患者亚组。
考虑到本研究的病例数量相对较少,需要进一步的调查和更大的研究来评估亚组患者的新的或改进的治疗策略,例如更积极的辅助治疗可能与手术相结合,或包括基因治疗在内的联合治疗来替换丢失的基因。
致谢
作者要感谢A. Schumacher和H. Wirtz在写作和编辑本手稿时的协助。
- 收到了2001年2月28日。
- 接受2001年8月7日。
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