摘要
部分COVID-19患者发展为严重的疾病表现,伴有呼吸衰竭,需要机械通气。识别有风险的患者对于优化护理和早期治疗干预至关重要。我们研究了SARS-CoV-2相对于疾病严重程度的释放动态。
我们分析了92例诊断为COVID-19的患者鼻咽和气管中SARS-CoV-2的脱落情况。入院时采集标准化鼻咽拭子或痰。如果患者是机械通气,则需要额外的气管吸入器。采用实时PCR检测SARS-CoV-2 RNA,定量检测病毒脱落情况。
45%(92例中41例)的COVID-19患者病程严重,需要机械通气(严重组)。在第1周,从鼻咽拭子测定的初始病毒脱落在非严重病例和严重病例之间没有显着差异。在第2周,可以观察到差异,因为重症患者的病毒脱落仍然升高。c反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6 (Il-6)和降钙素原(PCT)的时间过程显示,在重症患者中,随着病毒脱落负荷的延迟下降,炎症反应甚至更持久。显著比例(47.8%)的患者表现出延长的病毒脱落(bbb17天),这与严重的病程(73.2%)相关。
我们报告病毒脱落在入院时严重和非严重病例之间没有显着差异。在住院的第二周,SARS-CoV-2的释放量升高,在第二周至第三周之间全身性炎症反应达到峰值,以及病毒释放时间延长,与更严重的病程有关。
摘要
我们报告,住院第二周时SARS-CoV-2脱落升高,第二周至第三周期间全身性炎症反应达到峰值,病毒脱落延长与更严重的病程相关。
介绍
在COVID-19中,在最初的症状稳定期后,经常观察到肺部迅速恶化。SARS-CoV-2感染或COVID-19的临床特征已有报道[1- - - - - -3.].有几份报告描述了病毒脱落会持续很长时间[4,5].对病毒脱落的全面评估可以对潜在的免疫机制提供有价值的见解[6].通过PCR检测病毒RNA并不一定与传染性病毒相关,因为尽管存在SARS-CoV-2 RNA,但在较晚的时间点,传染性显著降低[7- - - - - -10].
肺炎是COVID-19感染最重要的临床表现,是重症患者预后的主要决定因素。个体病程和病情严重程度存在显著的异质性。因此,肺部清除病毒是特别重要的[10].部分患者反应过度或免疫依赖性病毒清除率降低可加重肺部表现[11].病毒趋向性、病毒脱落量、病毒脱落持续时间和病毒组织分布的个体差异可能在其中发挥作用。关于组织分布和病毒脱落的时间动态的数据很少,进一步的临床特征是必要的。最近的调查揭示了与Covid-19相关的纵向炎症反应[11],将临床可行的炎症参数与病毒脱落联系起来仍然是人们高度关注的问题。
在我院,诊断为COVID-19的患者反复检测呼吸道物质中SARS-CoV-2 RNA的证据,包括反复气管内吸入物(ETA)、痰液和鼻咽拭子(NPS)。
在这里,我们报告了临床和病毒学结果,描述了2020年2月29日至5月17日期间因COVID-19连续入院的92例患者的病毒脱落动态。
方法
研究设计
本研究是对2020年2月29日至2020年5月17日在慕尼黑大学医院连续收治的所有实验室确诊的COVID-19患者进行回顾性队列研究。
病人
所有疑似COVID-19的连续患者要么被转诊到我们大学医院(德国南部的一个主要学术中心)的急诊病房,要么被送进急诊室。这些患者经SARS-CoV-2 PCR阳性回顾性鉴定为COVID-19确诊病例。仅纳入成人(年龄≥18岁)。我们对疾病严重程度进行了简单的分类:重症病例被定义为需要像以前一样使用机械通气的患者[12].在我们的患者中,中度疾病被定义为没有机械通气和需要充氧,而没有这两种定义的轻度疾病病程。非严重疾病包括轻度至中度疾病。
样品
入院时常规获取NPS、痰液或ETA(入院时插管的7例患者),并根据当地指南进行。NPS样本是根据临床疑似COVID-19采集的。此外,当CT扫描显示COVID-19典型浸润且NPS阴性或用于临床监测时采集痰液。入院时,采集最多两个NPS样本(至少12小时距离)和一个痰样本(如有必要)。
重复采集任一样本(NPS、痰液和ETA)进行临床监测。当COVID-19症状消退,连续两次(至少一天的距离)的NPS结果为阴性时,停止检测。
病毒载量分析
病毒载量表示为每毫升痰液、ETA或拭子样本的运输介质中的sars - cov -2 rna拷贝数。我院使用的标准拭子含有1ml液体Amies运输介质(eSwab™,COPAN Diagnostics)。
以下PCR检测方法在Max von pettenkofer研究所认可的常规诊断实验室中用于定量核衣壳(N1) CDC方案反应[13),信封《慈善议定书》的扩大[14,15),核衣壳Seegene Allplex 2019-nCoV检测和Roche Cobas SARS-CoV-2的扩增核衣壳反应。
在多次稀释的重复中生成标准曲线核衣壳基因(2019-nCoV-N-PositiveControl, IDT)或具有基于前面所述数字液滴PCR结果的拷贝数的临床样本[16].每种PCR检测都推导出不同的公式,将Ct/Cp值转换为拷贝数估计值:CDC (N1)为80*1,95^(40,29-Cp), charit
“病毒脱落”一词是通过聚合酶链反应在呼吸道物质中检测SARS-CoV-2 RNA的同义词。然而,我们量化的这一参数也可能包括来自死亡细胞的亚病毒颗粒或RNA,而不等同于完整病毒粒子的排泄,甚至不等同于感染性。
血清炎症参数
降钙素原在Cobas 8000平台(罗氏诊断公司,巴塞尔,瑞士)检测,白细胞介素-6在Cobas e801平台(罗氏诊断公司,巴塞尔,瑞士)检测。c -反应蛋白(CRP)水平在Cobas c702平台上使用Tina-quant c -反应蛋白测定法(Roche Diagnostics,瑞士)进行测量。
统计分析
参数连续变量(如病毒载量)的差异采用学生t检验或方差分析进行检查。临床特征的分布采用Mann-Whitney U检验或χ检验2适当地进行测试。采用4节光滑样条进行曲线拟合。采用cox回归分析探讨病毒脱落时间与临床特征(如性别、年龄、动脉高血压、糖尿病、冠状动脉疾病和Charlson合并症评分)的关系[17].没有重复阴性结果的患者在阳性的最后一天被删除。p<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 25或Graphpad Prism 8.0.1进行统计学分析。
道德声明
当地伦理委员会批准了慕尼黑路德维希·马克西米利安大学的这项研究(项目编号:20 - 454)。
结果
入院时,所有患者要么进行NPS采样,要么进行ETA采样,要么两者都进行。所有92例病例均通过实时荧光定量PCR在呼吸道样本中确认了SARS-CoV-2感染。患者特征描述于表1a和b.回顾性确定2020年2月29日至5月17日收治的新冠肺炎确诊病例。入院时,大多数病例(85/92)自发呼吸,病情不严重。7例患者转至我院,已接受机械通气。入院时85名非重症患者中,34名患者在住院期间出现重症病程。在其余51例(非重症)患者中,20例患者发展为中度病程。中位年龄为62岁(四分位数范围51-75)。相当比例的患者有多种合并症,平均Charlson合并症评分为2,5(四分位数范围为1至4),其中动脉高血压(49%)和糖尿病(17%)是最常见的合并症。其他患者特征见表S1。共检测呼吸道样本473份(NPS 245份,气管吸痰228份,痰液9份)。平均每例患者采集5.3份样本,两组检测频率相近表S2。
SARS-CoV-2病毒脱落和疾病严重程度
病毒脱落,根据疾病严重程度,如图图2。初始病毒脱落在严重疾病和非严重疾病之间没有差异图2一个。我们排除了首次测试时间对病毒脱落负荷的影响图2 b。对于后续的测试,我们计算了每周患者的平均病毒脱落量,以减少采样时间和采样偏差的影响。根据疾病严重程度,病毒脱落的直接比较显示,重症患者在第2周时病毒脱落明显升高图2 c+表S2。
在非重症患者的鼻咽拭子中,与第1周相比,SARS-CoV-2病毒脱落在第2周(p=0.0098)、第3周(p=0.0003)和第4周(p=0.0004)均显著下降图2 d。在病情严重的患者中,病毒脱落在第2周没有差异(p=0.3089),但在第3周(p=0.0056)和第4周(p<0.0001)下降图2 d。
在严重疾病患者的ETA中,与第1周相比,病毒脱落在第3周(p=0.0358)和第4周(p=0.0022)显著下降图2 e。
SARS-CoV-2病毒脱落和全身炎症
为了进一步表征对病毒脱落和疾病严重程度的纵向炎症反应,我们表征了白细胞介素-6、降钙素原和CRP的时间过程。我们计算了白细胞介素-6、降钙素原和CRP的周平均值,以防止抽样偏差。接受托珠单抗治疗的患者被排除在CRP和Il-6的分析之外(n=4)。统计分析显示,除降钙素原外,重症组患者白细胞介素-6、CRP在早期时间点均升高,在后期时间点(3-4周)均下降。初始病毒脱落量与PCT峰值、Il-6峰值或CRP峰值无关图3 b。曲线拟合显示,白细胞介素-6和降钙素原在第2 - 3周达到峰值,而CRP在第1 - 2周达到峰值,在第2 - 3周下降图3。重症患者入院时降钙素原水平(入院后<48 h测PCT)显著升高图S2a,根据合并感染或继发感染进一步分层(表S4),图开通附在补充资料中。
SARS-CoV-2病毒脱落持续时间
病毒脱落持续时间能够区分是否需要机械通气图S2约登指数为0.467;17的临界值被确定为最佳。在报告的92例患者中,有34%的患者观察到持续的病毒脱落(bbb17天)。病毒脱落的持续时间根据疾病的严重程度有显著差异表1;这在图4。
为了纠正其他变量的影响,通过单变量和多变量cox -回归分析研究了长时间的病毒脱落。为了验证“病毒脱落持续时间”的定义,还进行了cox -回归分析,将“病毒脱落持续时间”定义为从出现症状到首次检测结果为阴性的时间。结果的意义和解释在两种定义之间基本没有变化(见补充图S1)。多变量分析证实了病毒长期脱落与严重疾病的关联。此外,没有发现病毒脱落和免疫抑制之间的相关性表2。
讨论
我们的研究表明,COVID-19重症患者的病毒脱落在前两周仍然很高,而在NPS的非重症患者组中,病毒脱落较早下降。此外,我们显示了持续病毒脱落与疾病严重程度的关联。在一组欧洲患者中,尚未研究SARS-CoV-2的时间过程和病毒脱落。表征病毒脱落动力学是高度感兴趣的,因为它可能表明潜在的免疫过程。
先前对SARS-CoV-2在呼吸道样本中病毒脱落的调查显示,在较深的呼吸道样本中病毒脱落较高[10,18].黄等。研究SARS-CoV-2在不同呼吸道样本类型(支气管和鼻咽)中的病毒脱落情况,发现重症患者在深层呼吸道样本中病毒脱落升高[19].这些发现与我们的研究一致,其中ETA和NPS测试在直接比较两种样本类型时显示出很高的变异性。因此,在随后的测试中,对它们分别进行了分析图1。这种差异可能是由SARS-CoV-2病毒的趋向性差异来解释的,但鼻咽标本NPS的技术限制可能会增加这种差异[20.].
一些调查SARS-CoV-2病毒脱落和疾病严重程度的研究将支气管和鼻咽部样本纳入呼吸道样本[8,21,22].如前所述,单独分析下呼吸道样本和上呼吸道样本可以防止抽样偏差。当单独分析时,我们发现重症患者组在第2周时SARS-CoV-2鼻咽病毒脱落仍然很高,而非重症患者组在第2周时下降。当比较入院时的绝对病毒脱落时,我们没有发现疾病严重程度的显著差异。严重组在第2周持续升高表明缺乏病毒清除是肺部恶化的致病机制。初始病毒载量没有因疾病严重程度而不同,这可能进一步表明由于ACE-II受体结合饱和,存在复制上限[23].最近发表的关于郑的研究等。重症患者呼吸道样本中SARS-CoV-2病毒的脱落量高于轻症患者[21].在本研究中,呼吸道样本没有区分痰和唾液,这可能解释了观察到的病毒脱落的差异,因为在严重组中包含更多的痰样本也可能导致病毒水平升高。
在分析全身炎症标志物时,我们观察到在初始CRP升高和降低(第2周)后的第2 - 3周,Il-6和降钙素原的持续全身炎症反应。这些结果支持先前发表的关于严重疾病患者免疫反应特征的数据[11,24,25].有趣的是,一小部分相关的COVID-19患者出现了严重的高炎症性疾病病程,而初始病毒载量在严重和非严重患病患者之间没有差异,但在严重疾病患者中,病毒载量在第2周保持升高。这些发现与RECOVERY试验报告的疗效一致,该试验显示类固醇治疗的免疫抑制导致28天死亡率的显著降低[26].其他不平衡的高炎症综合征也有类似的情况,如。,只有一小部分患者感染eb病毒后出现噬血细胞性淋巴组织细胞增多症[27].托珠单抗阻断IL-6受体在中度疾病COVID-19患者中无效表明该炎症过程涉及其他潜在途径[28].
Il-6和CRP的不协调运动提示先天因素主导了早期免疫反应。最近的研究表明,Il-6并不完全对应于CRP(通常由肝细胞响应Il-6产生),尽管Il-6是CRP产生所必需的一定(低)阈值[29- - - - - -31].两项较大的研究表明,血清IL-6在预测COVID-19临床结局(如呼吸衰竭和死亡)方面优于CRP、铁蛋白、肝酶和其他简单的临床实验室标志物,最佳临界值分别为80和86 pg/L [32,33].
降钙素原值0.2-0.5 ng·mL−1对有下呼吸道症状、肺部浸润的细菌性肺炎患者具有敏感性和特异性[34,35].有趣的是,我们观察到在有或没有合并感染或合并感染的组中PCT水平高度升高,这可能表明存在亚临床细菌合并感染(图开通)。需要强调的是,痰液/ETA培养的时机可能在抗菌治疗之前,因此痰液阳性患者的比例可能被低估。有必要进一步研究COVID-19患者中细菌共感染、亚临床共感染和定植的重要性[36- - - - - -38].
到目前为止,已经在几个选定的患者组中研究了SARS-CoV-2病毒脱落的持续时间。在对我国191例新冠肺炎住院患者临床特征的早期综合研究中,病毒的长期释放是明显的。然而,没有绝对拷贝数或采样点(痰、NPS或ENTA)的数据[4].另一项研究调查了病毒的脱落和传播性,并根据患者亚组对病毒脱落的时间模式进行了分层[7].在任何被调查的亚组中都没有显示出病毒脱落持续时间的增加。然而,在本分析中,仅包括非严重和严重亚组的少数患者,并且这些亚组的定义不可用。我们的研究表明,在我们的住院患者中,病毒脱落持续存在(n=44;44.8%的患者在出现症状后至少17天出现病毒脱落)在病情严重的患者中更为常见表2。
呼吸道标本中持续升高的SARS-CoV-2病毒脱落表明重症患者的免疫清除率下降。然而,在年轻和很少合并症的个体中,病毒清除迅速,但在少数无症状患者中观察到长时间的病毒脱落[11].造成这种现象的重要潜在因素可能是宿主因素或免疫反应的差异。有趣的是,男性与病毒在体内的长期释放有关表2。男性患者的病毒清除延迟可能与免疫学和流行病学的性别差异有关[39,40].
此外,在症状出现后超过50天,病毒RNA的存在可能提示正在进行的病毒复制,从而引起慢性局部炎症反应。这些发现可以解释为什么COVID-19患者的康复往往困难而漫长,并伴有持续的局部免疫反应,对呼吸系统和其他器官产生有害影响[41,42].在SARS中,观察到类似的病毒脱落模式[43].与SARS一样,尽管血清转化,但SARS- cov -2病毒脱落的缓慢下降表明,在COVID-19中,细胞清除正在进行,抗体介导的清除无效[10,43].进一步调查应重点关注免疫因素对COVID-19病程和结局的影响。
本研究的局限性
我们的研究有一些局限性。首先,这是一项回顾性的单中心队列研究,样本量适中。这可能导致亚组分析中混杂因素分布不平衡。由于非重症患者住院时间较短,随后检测的患者数量减少,而在进行我们的分析时,其他患者仍在进行通气;当比较病毒脱落时,收集的样本可能不太具有代表性。PCR检测病毒脱落主要依赖于样品采集和分析前因素,这些因素会影响检测到的病毒脱落。宿主因素,如支气管易感性增加和坏死/凋亡细胞的增加,也可能影响病毒脱落的测量。
结论
我们的研究结果表明,在最初几周的严重疾病病程中,病毒脱落仍然升高,并可能持续更长时间。长期和不平衡的炎症反应可能最终导致疾病的严重程度。进一步的研究应探讨与这些现象相关的个体宿主因素,以阐明潜在的机制。
脚注
本文的补充资料来自www.qdcxjkg.com
- 收到了2020年7月10日。
- 接受2020年12月13日。
- ©作者2021。
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