抽象
淋巴基荧光瘤症(LAM)是一种罕见的囊性肺病,具有逐渐增殖的脉冲引起的逐步肺功能损失。气道阻塞程度在LAM的发病机制中没有得到很好的研究。
使用组合体外采用CT、显微CT和组织学检查,比较切除肺与对照肺(各5例)气管阻塞的部位和性质。比较每代气道总数、气道总数、终末细支气管数和气道表面密度与控制。
离体CT分析显示,与对照组相比,LAM患者从第7代开始的气道数量减少(p<0.0001),而全肺显微CT分析证实气道数量减少了3至4倍。显微ct标本分析进一步显示终末细支气管数目减少4倍(p=0.0079),表面密度降低(p=0.0079)。一系列的显微和组织学图像直接显示了囊肿上的气道塌陷和渗出物填充的功能气道的丧失。
由于囊性破坏引起的(小)气道的数量,林肺的减少三到四倍,这是肺功能逐步丧失的可能罪魁祸首。
抽象
本研究表明,与匹配的对照组相比,使用CT,MicroCT和组织病理学的组合,在末期脉冲中的气道和末端支气管数减少4倍http://bit.ly/2tBTiJy
介绍
淋巴管平滑肌瘤病(LAM)是一种罕见的以肺为目标的疾病,主要发生在女性,肺部被囊性破坏,最终导致呼吸衰竭,持续10至20年。由于该病罕见,会导致与COPD或哮喘等更常见的疾病相混淆,因此诊断常常很复杂。肺功能的下降变化很大(每年3-15%)。症状包括反复出现气胸、胸腔积液及腹部肿瘤[1]。
侵犯林细胞,其是α平滑肌,被认为是疾病的主要罪魁祸首。这些细胞渗透肺并刺激基质的降解,导致细胞死亡和最终囊肿形成,尽管对所述紊乱的淋巴管发生的作用也被提出为关键机制之一。沿淋巴管的脉冲增殖使它们靠近气道和血管。血管阻塞可能导致出血的区域,而淋巴管的阻塞会导致Chylothorax。此外,林毛束对气道的收缩效果可能导致气流阻塞,导致肺检室中的空气捕获和最终囊性变化[2],证明囊性变化的严重程度与空气捕获之间的关联[3.]。
标准肺功能测试主要显示混合阻塞性和限制性肺功能缺陷。阻塞性肺功能缺陷归因于气道狭窄和基于最大流动静态反冲曲线的障碍[4.]。对三名LAM的尸检发现,由于周围的囊肿导致小气道变窄和塌陷,从而失去了对气道的支持。有趣的是,这并没有伴随着这些气道平滑肌分布的增加[5.]。在林中航空公司的一个更新的组织病理学研究发现,所有30名调查患者的林细胞和淋巴管发现了一条支气管累及,伴随着慢性炎症,高酚细胞增生,上皮的鳞状细胞元,基础薄层的增厚大多数调查案例[6.]。然而,气道炎症的程度与气流阻塞的严重程度无关[7.]。
虽然有很多证据表明,航空公司是气道阻塞的原因,可能是潮流地层的次要,气道受累程度的定量证据和气道阻塞的确切性质在林中尚未得到很好的研究。我们之前研究过障碍疾病的气道阻塞的现场和性质,如COPD,支气管炎梗塞症综合征后肺移植和囊性纤维化[8.-10.]。因此,目前研究的目的是通过与匹配的对照肺的彻底的形态学比较提供关于LAM气道阻塞发病机制的定量信息。
材料与方法
患者选择
从接受肺部移植的肺部移植患者收集肺癌,在UZ Gasthuisberg,Leuven,Belgium肺部移植。未使用的供体肺根据年龄和性别匹配,并作为对照。所有提供书面知情同意的患者均经医院委员会批准(S52174)。在比利时立法下收集供体肺,其中可以为研究提供拒绝的供体肺(S59648,S61653)。
肺加工体外计算断层扫描和整肺微图谱
如前所述加工肺部[7.]。简而言之,肺在30厘米的H时膨胀2O和后通缩至10cm H2o在恒定的气道压力下在液氮的烟雾中固定肺,并保存在-80°C并扫描体外冷冻条件下的计算机断层扫描(CT)(西门子SOMATOM,1.0毫米切片厚度,B60F窗口)。该CT用于手动计算每代的气道数[8.那11.]。此外,使用Horos (Horosproject.org上的开源软件(FOSS)项目,由美国马里兰州安纳波利斯的Nimble Co LLC d/b/a Purview赞助)测定肺体积、肺密度和肺重量。为了提高空间分辨率,从两个移植体(一个LAM和一个对照),对侧(右)肺移植体在上/中/下叶分离。两个裂片分别充气,恒压风干1周。然后使用内部开发的显微ct系统HECTOR [12.]在120μm的体素尺寸下操作,管电压为80kV,208μA,并使用章鱼重建重建(XRE,Ghent,Belgium)。将这些图像加载到ITK-SNAP中,用于AIRWAYS的半自动分割[13.]。Neuronstudio用于评估每代的气道数量和总气道计数[14.]。
microct和组织学
在CT扫描之后,使用带状锯从顶点切割肺部,并使用芯孔或电钻系统地采样,导致样品芯(2cm高度,直径为1.4cm。直径1.4cm)。我们每肺随机选择四个核心(两个顶端,两个基础),使用Microct(Skyscan 1172,Bruker,Kontich,比利时)以10μm的蒸煮条件(-30°C)扫描。该子样本MICROCT扫描进一步用于手动计数终端支气管的数量(根据最后导电气道定义),并测量每肺样品的三个无规末端支气管上的气道壁厚度(如果存在少于三个末端支气管,则剩余评估末端支气管)。测量表面密度,组织体积和组织百分比,使用CTAN(Bruker,Kontich,比利时)。
在冷冻的Microct之后,将选定的样品固定在6%多聚甲醛中,使用乙醇脱水,使用乙醇嵌入石蜡中,并在5μm切片厚度下筛分,并用Haemoxylin和eosin(H&E)染色,Elastica von Giesson和人黑色素瘤(HMB)黑色(HMB)45传统方案。
扫描电子显微镜和血管腐蚀铸造
简单地说,是用橄榄头套管插入传入血管。用生理盐水(体温)冲洗血管,然后用戊二醛固定液(2.5%,pH 7.4;德国慕尼黑。固定之后注射预聚合的PU4ii树脂(VasQtec,苏黎世,瑞士)混合硬化剂(40%溶剂)和蓝色染料作为铸造介质。树脂固化后,将肺组织置于10% KOH (Fluka, neui - ulm, Germany)中,40℃浸渍2-3天。然后用清水冲洗标本,并在蒸馏水中冷冻。铸件经过冷冻干燥,在氩气气氛下用金溅射,使用15 keV和21μa的Philips ESEM XL-30扫描电子显微镜(Philips, Eindhoven, The Netherlands)进行检查。
统计分析
结果表示为中位数和间条(IQR)或平均值±sd。终端支气管的数量,表面密度和组织的表面密度和百分比在整个肺部上平均。使用Wilcoxon签名等级测试进行比较LAM和对照组之间的差异。使用双向ANOVA与Tukey的双向Anova进行了每代航空的数量后HOC.测试(GraphPad Prism 4.0; GraphPad,CA,USA)。p值<0.05被认为是显着的。
结果
离体CT及全肺显微切片分析
首先,根据冰冻的肺,人工定量每代气道数体外CT(分辨率0.7-1 mm)。与对照组(P <0.0001)相比,这对气道数量显着减少(P <0.0001),特别是来自生成7(P = 0.070),8(P = 0.035),9(P = 0.015)的气道数量10(p = 0.065)与对照组相比(图2A)。与对照肺相比(347±202)相比,Lam Lungs(182±49)中的气道绝对数量较低(P = 0.016)。该体外CT进一步显示肺体积、肺密度和肺肿块增加,但均未达到有统计学意义(表格1)。值得注意的是,与对照组相比,这些变量在LAM肺中的标准偏差较小,在每代气道数量和总气道数量上存在更大的异质性,表明疾病在疾病标本中是均匀的。
鉴于有限的解决方案体外CT方案(0.7-1毫米),采用最先进的全肺显微CT(120µm分辨率),以增加特别是小气道的显像。气道铸型提供了一个直观和定量的印象,显示LAM的气道丧失情况(图3AB),其中在对照肺中检测到2074个气道,其在林肺的三倍降至695倍。这种气道的丧失从第7代具体显而易见,并且在整个后续的气道一代中一致(图3C.),确认我们以前的基于CT的方法。根据其直径分层呼吸道数量表明,特别小尺寸的气道丢失(图3d)。然而,考虑到具有一定直径的气道(与航空总数成比例)的百分比,很明显,无论其直径如何都有一般的气道(图3E.)。
子样品microCT分析
然后,对提取的标本进行显微ct扫描,以量化终末细支气管的数量,肺泡前的最后一条导气管(分辨率10µm)。显微ct分析显示,每毫升组织的终末细支气管数量减少了5倍(p=0.0079),每肺的终末细支气管总数减少了4倍(p=0.0079)。LAM组与对照组末级细支气管直径无差异,而末级细支气管气道壁较对照组明显增厚(p=0.0079)。表面密度作为衡量实质完整性的指标,与对照组相比,LAM显著下降(p=0.0079),这与囊肿形成和实质扩张导致肺泡之间的距离增加一致。此外,终末细支气管的数量与肺表面密度直接相关(p=0.0015, R=0.66),提示肺实质保存较多(即表面密度高)每毫升组织中有更多的终末细支气管。
在MicroCT扫描中,发现了通气道缩小和损失的直接证据。图4演示串行MicroCT图像演示母亲分支(图4A)在两个女儿分支中分叉(图4B.c)一个分支完好无损,气道管腔直径正常(白色箭头),而另一个气道(橙色)塌陷到相邻的实质囊肿上,在随后的系列显微ct图像中,管腔完全消失,没有恢复(图4D-F)。3D重建清楚地展示了气道完整的突然停止(图4G.)。将串行MicroCT图像与H&E匹配,Elastica von Giesson染色和HMB45染色证实了支气管内腔通过囊肿形成逐渐完全压缩,并且还在墙壁上进行了丰富的弹性蛋白纤维和含量的HMB45 + am型含量(洋红色染色细胞)的充分存在和渗透压缩的气道(图5.)。由于囊肿塌陷,除了气道外,气道也充满渗出物,如图所示图6克ydF4y2Ba。完整气道的管腔(图6),逐渐减少(图6 bc),直到腔内不再辨别并完全填写(图6 d)。3D重建(图6E)证实了在完全填充的气道段之后腔内的逐渐变窄和随后的气道停止。虽然,在这个气道周围存在囊肿,但Microct(图6 f)和组织学(图6克)图像显示气管腔充满水肿、纤维蛋白和血液(图6 h),渗出物也存在于相邻的肺泡实质中,与载血黄素的巨噬细胞(图4i.),暗示慢性/重复出血。
为了评估囊性破坏的特异性,我们结合扫描电子显微镜和微血管铸型进一步研究显示典型囊性破坏的LAM的结构形态和血管分布(图7-D)和窦状血管和缺失等级的不同异常的异常血管性(图7 e和f)。
讨论
本研究调查了林气道阻塞的现场和性质,并展示了CT和全肺部微克上可见的气道数量的几乎四倍。Subsample Microct进一步证实了终端支气管数量的四倍降低,其中功能呼吸道因典型的林囊肿上的气道崩溃而损失,而且由于渗出物的逐步填充,通过组织学进一步证实。
本报告确认并大大扩展了先前的工作,该工作已经在林中进行了调查气道阻塞部位。S.obonyaet al。[5.[已经提出,在LAM中观察到的空域病变在气流限制的成因中更为重要,而不是气道本身。我们延长了初步观察,因为我们观察到(小)气道的减少四倍,主要由气道崩溃或通过渗出物填充气道。压缩空气道气道壁中HMB45阳性细胞的丰富存在表明这些细胞对囊肿之间腔内的逐渐压缩的潜在贡献。我们推测,丰富的渗出物/慢性肺泡出血是由于肺泡实质囊性的囊性破坏具有突出的分泌潴留。这可能是通常在林患者中发现的血缺陷的解释。
观察到的气道丢失使人联想到COPD气道丢失的程度。mCD.面对面等。[10.研究表明,与本研究中观察到的LAM患者终末细支气管数量减少75%相比,金静脉注射组终末细支气管数量减少72 - 89%。然而,终末期细支气管丢失的潜在机制似乎是不同的。肺气肿时,终末细支气管尺寸减小,而LAM时其余终末细支气管尺寸正常。这可能可以用不同的病理生理学机制来解释,暴露于香烟烟雾导致气道上皮破裂和损伤,导致肺气肿时进行性狭窄和终末细支气管消失;在LAM中,气道丢失被解释为气道周围的进行性基质退化,气道逐渐失去其支持并最终在囊性结构上塌陷。究竟是所有的气道都消失了,还是部分气道没有增长,这个问题还有待解决。
气道炎症可能有重要作用,因为LAM患者的病情较晚期似乎有慢性炎症[6.,虽然很难区分原因和结果。炎症是一个主要的罪魁祸首还是第二个打击是未知:事实上,气道完整性受损由于囊性变形的薄壁组织可以让它更容易支气管炎症或过度渗透LAM细胞可导致慢性细支气管炎,这为以后的调查研究是一个重要的话题。炎症的可能作用也可以解释一些LAM患者观察到的气流受限的可逆性[15.]。最近发现林中维生素D蛋白轴的重要作用[16.]也可以在维生素D对气道重塑的着名作用的背景下理解[17.]。
观察到的终末细支气管数量与肺表面密度之间的关系进一步支持了这一假说,即更多外观正常的肺实质(即更高的表面密度)显示了更多的保存的肺实质相对于更多的病变区域。然而,即使是保存较好的肺实质,其表面密度也下降了近3倍。这之间的关联程度的囊性变形的薄壁组织和小型航空公司的数量符合纵向病人NHLBI LAM注册表的数据,在一个大群LAM患者1 s的用力呼气量下降更快速更缤纷薄壁囊肿患者(18.[],而扩散能力也与CT扫描上看到的疾病范围相关[19.]。如今,囊肿CT得分和图像纹理甚至用于预测疾病进展和对西罗莫司的反应[20.]。此外,使用组织学评分获得了类似的结果,其中发现具有半定量估计的囊性病变程度和脉冲浸润和患者存活的关联[21.]。
该研究的局限性包括相对低的n值。然而,LAM是一种罕见的疾病,并且大多数描述性研究是对类似数字进行的。此外,我们的CT和MicroCT测量显示出在林组的所有分析中的低标准偏差方面具有非常低的对象间可变性。其次,仅研究了终级肺部。因此,无法评估气道阻塞的早期表现。第三,在移植之前冲洗对照肺,而林肺不会冲洗;这可能解释了林肺的肺密度增加。最后,这也不是机械研究,因为我们主要旨在评估支气管气道阻塞的程度,确切的机制和抑制可能性超出了本研究的范围。
总之,从第7代气道分支开始,LAM肺的气道数量减少了3 ~ 4倍。由于囊肿上的气道塌陷和气道阻塞,所有大小的气道都消失了。肺实质异常程度与气道数目密切相关。这是首次对LAM患者气道异常程度的定量分析,表明COPD终末期气道病变程度的相似性,从而解释肺功能的持续下降。抑制气道丢失的治疗药物是迫切需要的,以改善这一罕见疾病的预后。
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脚注
利益冲突:S.E.德莱恩没有什么可以披露的。
利益冲突:A. Vanstapel无需披露。
利益冲突:L. De Sadereber无需披露。
利益冲突:B. Weynand没有什么要披露的。
利益冲突:M. Boone没有什么可披露的。
利益冲突:E.Verbeken没有什么可以披露的。
利益冲突:D. Piloni没有什么要披露的。
利益冲突:D.Van Raemdonck没有什么可披露的。
利益冲突:M. Ackermann没有什么可披露的。
利益冲突:D.D.Jonigk没有什么可披露的。
利益冲突:J. Verschakelen没有什么要披露的。
利益冲突:W.A. Wuyts无需披露。
支持声明:S.E.Verleden是FWO(12G8718N)的博士后研究员,并承认了KU Leuven的财务支持(C24 / 18/073)。W.A. Wuyts由Boehringer Ingelheim的Chrystal主席支持。根特大学(BOF-Ugent)的特殊研究基金承认了UGCT专业中心的隐秘支持(BOF.Exp.2017.0007)。D.D.欧洲研究理事会(ERC)的赠款支持JONIGK;欧洲合并仪授予,Xhale(参考号No.771883)。本文的资金信息已存入Crossref资助者注册表。
- 收到2019年10月7日。
- 公认2020年2月3日。
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