摘要
哮喘中的气道重塑仍然知之甚少。本研究旨在确定支气管活检测量的气道重塑与1)肺功能损害和2)胸部定量计算机断层扫描(QCT)衍生的近端气道重塑和空气滞留的形态测量和密度测量之间的关系。
研究对象是从一个中心招募的。支气管活检重塑特征是肺功能损害的最强预测因素,qct衍生的近端气道形态测量和空气捕获标记物通过逐步多元回归确定。空气滞留的最佳预测因子在一个独立的复制组中得到验证。
气道平滑肌%是支气管扩张剂后1 s用力呼气量(FEV)的唯一预测指标1) % pred,而气道平滑肌%和血管量均为FEV的预测因子1/强制肺活量。上皮细胞厚度和气道平滑肌百分比是平均节段支气管腔面积(R2= 0.12;p=0.02, R2= 0.12;p=0.015),而上皮厚度是壁面积% (R2= 0.13;p = 0.018)。血运是空气滞留的唯一重要预测因素(R2= 0.24;p=0.001),这在复制组中得到验证(R2= 0.19;p = 0.031)。
在哮喘中,气道平滑肌含量和血管密度都与气流阻塞有关。来自qct的近端气道形态测量与上皮厚度和气道平滑肌含量密切相关,而空气捕获与血管有关。
摘要
哮喘活检中的气道重塑与近端气道qct衍生的形态测量和空气捕获有关http://ow.ly/ucoA308Jv9F
简介
哮喘仍然是一个重要的健康问题,具有很高的发病率、死亡率和经济负担[1,2].除症状外,哮喘的特点还包括不同程度的气流阻塞、气道炎症和气道重塑[2,3.].气道重塑是指气道壁结构变化的统称,包括上皮厚度和完整性、气道平滑肌质量增加、新血管生成和上皮下纤维化[2- - - - - -4],并与持续的气流限制及气流阻塞有关[4- - - - - -6].这是哮喘的一个特征,即使是儿童也是如此[7],表明它可以发生在疾病病程的早期;它影响大小呼吸道,从事后剖析哮喘死亡个案研究[8,9].
宏观气道重塑可以通过定量计算机断层扫描(QCT)进行无创评估。这已成为一种确定哮喘患者气道形态测量和肺密度测量的既定技术[10- - - - - -19].这种方法允许通过评估气道几何形状和空气滞留作为小气道疾病的间接测量来量化近端气道重塑。哮喘的QCT显示,气道重塑的主要特征包括管腔狭窄、管壁增厚以及空气滞留是气流阻塞的重要决定因素。一些研究已经开始探索近端气道几何形状与气道重塑组织学特征之间的关系[10- - - - - -12].然而,哮喘是一种异质性疾病,气道生理紊乱的程度、气道壁组成和QCT参数的相对变化有相当大的变异性。因此,这些哮喘的结构-功能关系仍然知之甚少。
我们的假设是,在支气管活检中确定的气道重塑与1)肺功能损害(支气管扩张剂后1 s用力呼气量(FEV)1) % pred)和2)近端气道重塑和空气滞留的QCT形态测量和密度测量。共同主要的QCT结果变量为:1)近端气道重塑:平均气道管腔面积/体表面积和气道壁面积%;2)空气滞留:平均肺密度呼气/吸气比(MLD E/I)。为了验证我们的假设,我们对疾病严重程度进行了单中心观察性研究,以确定与肺功能和气道重塑QCT参数相关的支气管活检中最强的独立组织学特征。空气滞留的最佳免疫组织学预测因子在来自另一个中心的哮喘受试者的独立复制组中得到验证。
方法
主题
受试者分别被招募到两个独立中心的测试组(n=70)或复制组(n=24):格伦菲尔德医院(英国莱斯特)和华盛顿大学医学院(美国密苏里州圣路易斯)。所有受试者均为<10包年的非吸烟者。所有纳入的受试者都符合哮喘的诊断标准,其定义为:医生诊断为哮喘,并有客观证据表明存在可变气流阻塞,表现为以下一项或多项:1)乙酰胆碱激发试验阳性,定义为雾化乙酰胆碱浓度导致FEV下降20%1<8 mg·mL−1, 2) >在2周内的日最大峰值流量变化率为20%,3)>在FEV中改善15%1支气管扩张剂治疗后15分钟。受试者接受支气管扩张剂前和后的肺活量测定(沙丁胺醇400 μg)、皮肤点刺试验或过敏原特异性IgE来评估过敏性反应,试验组还进行了痰诱导和处理。持续性气流受限被定义为支气管扩张剂治疗后FEV1% pred <80%。获得所有参与者的书面知情同意。所有受试者在纳入研究前均接受最佳哮喘治疗,且至少6周无哮喘加重。本研究中包括的所有评估和测试都得到了当地研究伦理委员会(莱斯特郡、北安普敦郡和拉特兰研究伦理委员会以及华盛顿大学医学院机构审查委员会)的批准。
计算机断层扫描
所有受试者在服用沙丁胺醇后,按照之前描述的标准化采集方案进行了有限或完整的肺部CT扫描[11,16].14名哮喘患者在全吸气时(接近肺活量)进行了从主动脉弓到隆突的有限扫描[13,14].所有其他受试者都进行了全肺吸气和呼气(接近功能剩余容量)CT扫描。扫描使用半自动软件进行分析:试验组使用Apollo,复制组使用Pulmonary Workstation 2.0版本(VIDA Diagnostics, Coralville, IA, USA)。
试验组所有吸气扫描均分析右上肺叶顶端节段支气管(RB1)形态,而全肺扫描仅获得平均节段支气管形态。使用分析软件对第一代至第五代气道进行标记和测量。沿着垂直于每个气道长轴的腔腔中心线体素获得节段气道(第三代气道)的形态学测量,并在气道节段的中间三分之一处取平均值。流明面积和总面积直接测量,壁面面积通过以下计算得到:壁面面积=总面积-流明面积。总、管腔和壁面积均以毫米为单位测量2,并对体表面积进行校正,体表面积采用Mosteller公式计算,以mm表示2·米−2体表面积[20.].墙体面积百分比计算公式为:墙体面积%=100×wall面积/总面积。通过呼气/吸气扫描上的MLD E/I和呼气扫描上密度低于-856 HU (VI-856 HU)的肺体素百分比,确定了测试组和复制组的空气捕获估计值(补充图S1)。共同主要的QCT结果变量为:近端气道重塑的平均节段气道管腔面积/体表面积和管壁面积%,以及空气滞留MLD E/I。
支气管活检
纤维支气管镜检查是根据英国胸科学会指南进行的[21].所有患者术前均接受沙丁胺醇治疗。支气管活检取自节段和亚节段隆突,如前所述,试验组用甲基丙烯酸乙二醇包埋,复制组用石蜡包埋[6,11,22,23].
从乙二醇甲基丙烯酸酯包埋的活检中切下2µm切片,用苏木精/伊红染色。用以下单克隆抗体进行免疫组化染色:抗肥大细胞胰酶克隆AA1 (Dako, High Wycombe, UK),抗-α-平滑肌肌动蛋白克隆1A4 (Dako),抗嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白克隆BMK-13 (Monosan, Uden, Netherlands),抗中性粒细胞弹性酶克隆NP57 (Dako)和抗内皮克隆EN4 (Monosan)或适当的同型对照。
支气管活检由一名不了解临床特征的观察者进行评估(ZEN 2012光学显微镜图像分析软件;卡尔蔡司,耶拿,德国),并表示为从至少两个切片(来自独立活组织切片或与同一活组织切片相距至少20微米的不连续组织切片)进行测量的平均值。通过测量完整上皮和剥落上皮的长度来评估上皮完整性。这些都表示为百分比的所有网状基底膜(RBM)长度存在的切片。RBM和上皮厚度的测量如前所述[24,25].使用Chalkley计数来测量血管密度和血管面积。如前所述,Chalkley目镜光栅(NG52 Chalkley Point Array;使用Pyser-SGI, Edenbridge, UK)在×200测量四个不重叠血管热点的Chalkley计数(每个切片一个或两个)(补充图S2) [6].平均Chalkley计数从四次测量中计算出来。在24例活检中,我们比较了Chalkley计数与固有层计算机像素计数,发现这些测量值强相关(r=0.83;p < 0.0001)。气道平滑肌含量按面积的比例测定。炎症细胞以有核细胞数/固有层面积表示。
由单盲观察者进行的供体内测量的组内相关系数为:气道平滑肌%面积0.87,上皮厚度0.85,血管密度0.65。
在试验组中发现的与qct衍生的空气捕获标记相关的最强的气道重塑独立免疫组织学特征在复制组中得到验证。从石蜡包埋活检中切取4µm切片,用合适的单抗或相应的同型对照进行染色。
统计分析
使用Prism版本6.00 for Windows (GraphPad, La Jolla, CA, USA)和SPSS Statistics for Windows版本22.0 (IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。参数资料以均数±表示sd非参数数据为中位数(四分位范围)。各组间比较分别采用参数资料和非参数资料的非配对t检验和Mann-Whitney u检验。比例比较采用卡方检验。变量之间的相关性用皮尔逊相关表示。采用逐步多元回归分析来确定支气管活检特征,这些特征是支气管扩张剂后FEV的最强预测因素1, FEV1/强迫肺活量(FVC)和qct衍生的平均节段支气管形态测量和空气捕获。回归数据以模型调整R表示2Pearson相关性与建模自变量的标准化回归系数(β)。p值<0.05为有统计学意义。
结果
有(n=30)和没有(n=40)持续气流受限(支气管扩张剂后FEV)受试者的基线人口统计学和临床特征1% pred分别<80%和≥80%)表示表1.两组在性别、年龄、哮喘病程、发病年龄、吸烟状况、吸烟包年、体重指数、痰中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞方面无差异。
气道炎症、重塑与肺功能的单因素相关性研究
主题与与无持续气流受限者气道平滑肌%(33.5±15.6%)显著高于对照组与20.1±12.6%;p<0.001)和增加的血管(平均Chalkley计数)(6.2±1.6与5.0±1.9;P =0.017)(表1和图1).然而,两组之间在其他测量的气道重塑或炎症标志物上没有差异。气道平滑肌%与支气管扩张剂后FEV呈负相关1% pred (r=−0.49;p<0.001)和支气管扩张剂后FEV1/FVC (r=−0.44;p < 0.001) (图2).血管密度与支气管扩张剂后FEV呈负相关1% pred (r=−0.3;p=0.026)和支气管扩张剂后FEV1/FVC (r= - 0.35;p = 0.008)。支气管活检中气道炎症或其他气道重塑标志物与肺活量测量之间无显著相关性(补充表S1)。吸烟史(包括包年)与支气管活检中任何重塑或炎症特征无关。
ct衍生的定量形态测量和密度测量与肺功能的单变量相关性
主题与与无持续气流受限者平均节段支气管管腔面积显著变窄(9.7±2.2)与11.0±2.3毫米2·米−2;P =0.047),平均节段支气管壁面积%(63.6±2.0%)较大与62.5±2.1%;p = 0.039) (表2).这些差异在低处更为明显与上肺叶支气管(补充表S2)。有明显更多的空气滞留与MLD E/I(0.89±0.05)测量无持续气流限制与0.83±0.05;p<0.001)和VI-856HU(32.2±19.8%)与15.5±10.1%;p < 0.001) (表2).
支气管活检、气道重塑与QCT形态测量和空气滞留之间的单变量相关性
上皮细胞厚度与平均节段支气管腔面积显著相关(r= - 0.35;P =0.02),平均节段支气管壁面积(r= - 0.31;P =0.039)和平均节段支气管壁面积% (r=0.35;p = 0.018) (图3).同样,气道平滑肌%与平均节段支气管腔面积显著相关(r= - 0.35;P =0.008),平均节段支气管壁面积(r=−0.32;P =0.015)和平均节段支气管壁面积% (r=0.27;p = 0.045)。所有其他重塑和炎症标志物,包括固有层的血管、RBM和炎症细胞计数,与形态测量指标没有任何显著相关性(表S1)。
血运与空气滞留MLD E/I的测量值密切相关(r=0.49;p<0.001)和VI-856HU (r=0.53;p < 0.001)。气道平滑肌%与MLD E/I相关(r=0.3;p=0.03)和VI-856HU (r=0.55;p < 0.001) (图4).
支气管活检免疫组织学、肺功能和QCT参数之间的多变量分析
所有气道重塑和炎症变量被纳入逐步多元回归分析,以检查持续气流限制、QCT分段形态测量和空气滞留的预测因素。只有气道平滑肌%是支气管扩张剂后FEV的独立预测因子1% pred (R2=0.24, β=−0.49;p=0.001),而气道平滑肌%和血管量是支气管扩张剂后FEV的显著预测因素1/ FVC(右2=0.19, β=−0.40;p=0.003, R2=0.09, β=−0.31;分别为p = 0.026)。上皮细胞厚度和气道平滑肌百分比是平均节段支气管腔面积(R2=0.12, β=−0.35;p=0.02, R2=0.12, β=−0.35;p=0.015)和壁面积(R2=0.10, β=−0.32;p=0.033, R2= 0.10,β= 0.31;分别为p = 0.032)。上皮细胞厚度是平均节段支气管壁面积% (R2= 0.13,β= 0.35;p = 0.018)。血运是MLD E/I (R2= 0.24,β= 0.49;p=0.001),而气道平滑肌%,血管和上皮厚度都显著有助于预测VI-856HU (R2= 0.31,β= 0.49;p < 0.001;R2= 0.22,β= 0.54;p<0.001, R2= 0.05,β= 0.24;分别为p = 0.045)。
验证组:复制血管和空气滞留之间的相关性
支气管活检中的血管是MLD E/I的唯一独立预测因素。因此,在一个独立的哮喘受试者组(n=24)中测量了血管和MLD E/I之间的关系。验证组受试者的基线人口统计数据和临床特征描述在补充表S3中。与主要研究组相似,血流量与MLD E/I呈正相关(r=0.44;p=0.031)和VI-856HU (r=0.50;p = 0.014) (图5).
讨论
我们在此报道哮喘中支气管活检的气道炎症和重塑特征与肺功能和近端气道形态测量和空气滞留的QCT参数之间的关系。我们发现气道炎症和RBM增厚均与肺功能和QCT参数无关。然而,气道平滑肌百分比和血管密度均与气流阻塞有关。近端气道形态测量与上皮厚度和气道平滑肌百分比密切相关,而空气滞留与血管有关。这是第一个提出气道血管和空气滞留之间关系的研究。然而,我们相信这一观察结果是可靠的,因为我们能够在一个独立的复制组中证实这一发现。
以往的研究探讨了支气管活检重构特征与两种FEV之间的关系1% pred和FEV1/FVC(在[4])。如本文所述,气道平滑肌块通常是[4,5],但并不总是[22],是肺功能损害的主要决定因素。气道平滑肌量增加是严重儿童哮喘的一个特征[7],在哮喘死亡的研究中,大气道和小气道都有描述[8,9].事实上,大气道和小气道平滑肌质量的增加比大气道或小气道单独增加更常见[9].本研究中用于评估血管的Chalkley计数方法是癌症研究中常用的一种立体学方法,在观察者之间和观察者内部的变异性、疾病进展和死亡率方面得到了很好的验证[26,27].此外,该方法以前曾被用于测量哮喘患者的血管重塑,研究表明哮喘患者的平均Chalkley计数高于对照组,且与哮喘严重程度相关[6].与健康对照组相比,哮喘患者的支气管活检和哮喘患者肺结节切除术后的小气道中,气道血管和新血管生成的增加一直被报道[6,28- - - - - -32].然而,在致死性哮喘中并没有观察到血供增加的特征[33].我们和其他研究人员已经报道了血供增加与肺功能损害有关[6],并在当前的研究中证实了这一发现。气道炎症与肺功能损害之间的关系更有争议,一些报告表明两者存在关联,而另一些报告则无法揭示两者之间的关联(Berair和Brightling[4])。有趣的是,在我们的研究中,重塑的其他特征,即。上皮增厚、RBM增厚和气道炎症与肺功能指标无相关性。
气道近端形态测量术在哮喘管腔狭窄、气道壁增厚中的异常[16].这些变化与肺功能损害有弱相关性。我们发现上皮增厚和气道平滑肌%与之前描述的QCT气道重塑形态测量特征相关[10- - - - - -12],但没有其他支气管活检方法的重塑或炎症。有趣的是,尽管气道血管与肺功能损害相关,但与近端气道形态测量无关。
我们扩展了之前关于支气管内重建特征与QCT参数之间关系的研究,包括了空气滞留的测量。在单变量分析中,我们发现气道平滑肌%和血管密度均与空气滞留有关,但在逐步线性回归中,血管密度本身是MLD E/I的独立且显著的预测因子。在哮喘和慢性阻塞性肺病的比较研究中,我们发现QCT测量的空气滞留比近端气道形态测量的变化更能预测肺功能损害[19].因此,有趣的是,在近端气道中测量到的血管增加与空气滞留有关,这是一种小气道功能障碍的测量方法。以往的研究表明,近端气道的血管丰富程度与小气道的发现一致[28,33],但值得注意的是,我们没有直接测量小气道样本的重塑。由于我们发现的新颖性,我们试图在一个独立的复制组中验证我们的发现。尽管在支气管内活检的处理过程中存在差异,但与我们最初的分析相比,我们发现复制组的气道血管和qct衍生的空气滞留之间存在显著相似的关系。
综上所述,这些数据支持气道平滑肌在近端气道重塑中发挥重要作用,在小气道重塑中可能作用较小,两者都可能导致肺功能损害。上皮细胞厚度在近端气道重塑中起作用,但与气道功能障碍无关。气道血管增生与近端气道重塑无关,但与空气滞留和肺功能损害有关。血管增加是否促进继发于水肿的小气道闭合或直接影响气道壁厚尚不清楚。有趣的是,目前尚无糖皮质激素对气道平滑肌质量影响的报道,而大多数(尽管不是所有)糖皮质激素对气道血管影响的研究表明,在肺功能改善的同时,糖皮质激素对气道血管的影响会降低[29- - - - - -32].我们的研究对象都接受吸入性皮质类固醇治疗,这表明剩余的血管对皮质类固醇治疗有耐药性。皮质类固醇或其他治疗对气道血管的改善是否与空气滞留的改善有关,还需要进一步研究。
这项研究有一些潜在的局限性。虽然这是迄今为止比较免疫组织学与气道重塑QCT参数的最大研究,但它仍然是一个相对较小的研究。它也是横断面的,因此未来对哮喘自然史和治疗反应的纵向研究应考虑包括支气管活检和成像参数,以进一步确定结构-功能关系。重要的是,我们没有将支气管活检的取样位置与QCT确定的相应气道进行标准化,这对于确定个体内的异质性是否重要,将在未来的研究中进行探讨。然而,通过使用来自多个气道的平均气道形态测量法,我们确实减少了个体内QCT参数的可变性,并证明了支气管活检中关键结构壁组件在供体内的良好重复性。重要的是,我们对QCT空气捕获的比较是近端气道样本而不是远端气道样本。如前所述,这些近端气道样本很可能反映了小气道的类似变化,但尽管存在这种可能性,仍需要进一步研究来比较小气道的QCT参数与远端取样(如经支气管活检)。相对于Kasaharaet al。[10],我们的研究表明RBM与qct衍生的形态测量参数之间没有相关性。然而,类似于我们的观察,Saglaniet al。[34]也未能证明这种相关性。本研究的另一个局限性涉及使用支气管活检来测量气道重塑。这些活检很小,仅对气道浅层进行取样,因此不能确定气道结构与气道壁整体深度的关系。然而,尽管有这个缺点,支气管活检仍然是最好的在活的有机体内评估有助于气道重塑的气道壁结构变化的工具[35].
总之,我们发现了支气管活检与气道重塑与肺功能的QCT测量之间的重要联系。我们发现气道平滑肌质量和气道血管密度与气流阻塞有关,气道平滑肌质量可能对大气道重构的贡献大于小气道重构,而血管密度增加似乎与小气道重构引起的空气滞留有关。
补充材料
补充材料
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补充表erj - 01507 - 2016 - _supplement
图S1。哮喘患者的典型吸气和呼气CT扫描显示低衰减簇A)吸气<950 HU,呼气<856 HU。erj - 01507 - 2016 - _figure_s1
图S2。支气管内活检切片实例;a)高Chalkley计数切片的反内皮(EN4)染色,b)低Chalkley计数切片的EN4染色,c)阴性同型对照,d) EN4染色切片上血管热点的例子,该EN4染色切片上有来自Chalkley网格的叠加点阵列,通常固定在显微镜目镜上。在每个热点中,在旋转光栅和移动切片后,通过计算接触染色血管的最大点数来获得Chalkley计数。erj - 01507 - 2016 - _figure_s2
披露的信息
补充材料
p .布拉德erj - 01507 - 2016 - _bradding
石球Brightlingerj - 01507 - 2016 - _brightling
m·卡斯特罗erj - 01507 - 2016 - _castro
美国Gonemerj - 01507 - 2016 - _gonem
美国古普塔erj - 01507 - 2016 - _gupta
r。马歇尔erj - 01507 - 2016 - _marshall
美国西迪基erj - 01507 - 2016 - _siddiqui
境苏萨erj - 01507 - 2016 - _sousa
答:Wardlawerj - 01507 - 2016 - _wardlaw
确认
作者贡献:R. Berair, R. Hartley和C.E. Brightling对研究概念和设计,数据获取,分析和解释做出了贡献。V. Mistry, A. Sheshadri, A. Shikotra, A. Singapuri和S. Gonem对数据采集和分析做出了贡献。S. Gupta, R.P. Marshall, A.R. Sousa, R. Kay, A. Wardlaw, P. Bradding, S. Siddiqui和M. Castro对数据的获取和解释做出了贡献。所有作者都对最终的手稿进行了严格的评估和批准,并对工作负责。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com
支持声明:这项工作部分由威康信托基金高级奖学金(C.E. Brightling),通过患者特定计算建模(AirPROM)项目(通过FP7欧盟拨款资助),莱斯特国家卫生研究所(NIHR)呼吸生物医学研究部门,诺华和葛兰素史克(GSK)资助。这里提到的一些活检和计算机断层扫描数据是诺华制药赞助的II期随机对照试验(QAW039A2208)纳入的一部分患者的基线数据。S. Gupta是NIHR临床讲师,由研究和职业发展培训计划资助。本文介绍了由国家卫生研究院资助的独立研究。所表达的观点是作者的观点,不一定是NHS、NIHR或卫生部的观点。本文的资助信息已存入公开出资人注册处.
利益冲突:可以在本文旁边的网站上找到信息披露www.qdcxjkg.com
- 收到了2016年7月27日。
- 接受2017年1月20日。
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