摘要
哮喘患者先天免疫反应受损,上皮释放的C-X-C基序趋化因子配体(CXCL)8、白介素(IL)-33和胸腺基质淋巴生成素(TSLP)增加。我们假设树突细胞可能在严重哮喘中调节高反应上皮。
为此,我们研究了正常和患病情况下的上皮细胞-树突串扰,因为超微颗粒物质可能影响哮喘气道,我们研究了它对这种串扰的影响。将对照组(cHBEC)或严重哮喘患者(saHBEC)的人支气管上皮细胞(HBEC)与单核细胞来源的树突状细胞(moDC)进行气液界面培养。
saHBEC释放CXCL8、TSLP和IL-33的增加与cHBEC产生CXCL10和CCL2形成对比。在moDC激活方面,saHBEC共培养仅诱导CD86表达上调,而cHBEC可在HLA-DR、CD80、CD86和CD40上调的情况下使moDC完全成熟。颗粒物质刺激HBEC对cHBEC无影响,但刺激了saHBEC中CXCL8和IL-33的释放。尽管C-C趋化因子配体2诱导,但颗粒物质在saHBEC共培养中受损上皮信号(TSLP, IL-33和CXCL8)。
HBEC与moDC之间可以建立串扰在体外cHBEC驱动t1型反应,saHBEC驱动t2型反应。HBEC的正常或哮喘状态不同地形成上皮-树突反应。我们的结论是,对照组moDC不能挽救严重哮喘患者气道上皮的高反应性。
摘要
支气管上皮的正常或哮喘状态决定了上皮-树突状细胞营养单元的功能http://ow.ly/teQ43085KRf
简介
哮喘的免疫发病机制依赖于先天和适应性免疫反应。我们目前的观点认为上皮细胞是免疫反应的主要协调者。事实上,气道上皮细胞与邻近的免疫细胞网络合作,提供物理和化学保护,以抵御有害的环境因子[1,2],通过白细胞介素(IL)-25、IL-33和胸腺间质淋巴生成素(TSLP)释放诱导先天途径,可能由特异性抗原刺激放大[3.].树突状细胞、中性粒细胞和2型先天淋巴样细胞(ILC2)已被证明是所有这些细胞因子的靶点[4–7].此外,中性粒细胞参与重度哮喘的证据支持C-X-C基序趋化因子配体(CXCL)8作为另一个重要的重度哮喘伙伴的考虑[8,9].
支气管上皮细胞和前哨树突状细胞处于对抗吸入药物的第一线。它们必须一起检测潜在的有害物质,并“决定”是否启动和定向免疫反应[10–13].在哮喘中,气道上皮完整性的破坏、局部炎症环境和活化免疫细胞的大量涌入为急性加重和持续不良的治疗控制铺平了道路[14,15].此外,与哮喘加重相关的细胞因子,以及IL-4、IL-13和1型干扰素(IFN),已被证明作用于C-C趋化因子受体(CCR)2的骨髓释放+肺髓细胞前体,包括树突状细胞,导致替代活化和T2极化免疫[16,17].有趣的是,在某些情况下,气道上皮细胞可能作为抗原呈递细胞(APC)在气道炎症和免疫反应的发展过程中发挥作用通过程序性死亡配体(PD-L)1 (B7H1)和PD-L2 (B7DC)表达[18].这两种蛋白质是t淋巴细胞受体的配体,并已被证明参与哮喘、过敏和自身免疫性疾病的发病机制[19].
过敏性哮喘的起始和加重均与空气污染水平有关[20.,21],而环境因素如环境颗粒物可能会影响上皮细胞-免疫细胞的串扰。直径小于10 μm的颗粒进入下气道,影响局部稳态,并可能引起免疫反应。树突状细胞在采样气道颗粒和局部启动免疫反应或耐受方面起着至关重要的作用[1,12,22].微粒物质在气道上皮细胞间的转运可能导致气道树突细胞通过一个强制性的上皮激活步骤成熟[23,24].在哮喘中,肺树突细胞在局部进行抗原呈递,因此在局部炎症爆发时发挥重要作用[12].树突状细胞成熟需要TSLP受体的激活。然而,这些数据大多来自哮喘的小鼠模型,主要使用卵清蛋白和病毒刺激。对于上皮细胞-树突状细胞串扰在人类中受损的情况知之甚少,对于严重哮喘患者则更甚。
在本研究中,通过共培养系统模拟了气道上皮细胞和免疫细胞的复杂相互作用,从而研究了细胞间通信,并密切监测了严重哮喘患者对颗粒物暴露的细胞反应。为此,我们将单核细胞来源的树突状细胞(moDC)与在气液界面(ALI)培养的对照组或严重哮喘患者的完全分化的气道上皮共同培养[25].我们发现,来自严重哮喘患者和对照组的支气管上皮细胞驱动了不同的趋化因子和moDC表型谱,而颗粒物暴露进一步调节了这些不同的反应。此外,这些结果表明,我们的人类共培养模型可能对进一步研究上皮-树突单位的哮喘相关异常和吸入化合物的影响特别感兴趣。
材料与方法
补充材料中提供了更多细节。
研究对象
哮喘患者(n=15)和对照组(n=6)在法国马赛市公共援助中心(assist Publique Hôpitaux de Marseille)肺科进行支气管活检。该研究方案得到了当地伦理委员会的批准,并且是由法国国家健康和医学研究所(IDRGB 2008-A00284-51, Afssaps 2008-0113)赞助的支气管阻塞和哮喘队列(COBRA (Cohorte梗阻支气管和哮喘))的一部分。所有受试者均被告知研究的性质和目的,并在入组前获得书面同意。人口统计特征报告在表1.
从13名对照组志愿者和8名严重哮喘患者中提取外周血单核细胞,这些患者的性别和年龄与支气管活检患者相匹配。该研究方案得到了当地伦理委员会的批准,并作为临床试验的一部分www.clinicaltrials.gov标识符编号NCT00793676.这些受试者的人口学特征报告于表2.
人支气管上皮细胞在ALI中的原代培养
对照或严重哮喘人支气管上皮细胞(分别为cHBEC和saHBEC)从支气管活检中获得,并在如上所述的ALI条件下培养[25].
单核细胞来源的树突状细胞
moDC是通过在体外前文所述的外周血单核细胞分化[26].
可吸入颗粒物
微粒物质由在航空发动机台架上试验起飞/降落循环期间收集的无内毒素喷射废气组成,如前所述[22].
支气管上皮细胞和树突状细胞的共培养
第6天,收获moDC,计数,离心,重悬于HBEC培养基中。cHBEC与对照组moDC共培养,saHBEC与对照组或重度哮喘moDC共培养。实验设计如图S1所示。
上皮细胞和树突状细胞标记物的免疫测定
基础上清液中细胞因子和趋化因子的测定
使用流式细胞仪珠阵列Flex Sets (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France)按照制造商说明测量CCL2、CXCL10和CXCL8水平。采用ELISA法检测TSLP、IL-33和IL25水平(R&D Systems, Lille, France)。
moDC表型
共培养实验后,用特异性抗体对参与抗原提呈和共刺激信号传递的质膜分子进行染色(即.HLA-DR, CD40, CD80和CD86或对照同型匹配抗体(Beckman Coulter, Villepinte, France))在室温(18-25°C)黑暗中30分钟。然后将moDC漂洗,在含1%甲醛的PBS中重悬,用Epics XL (Beckman Coulter)流式细胞仪分析。数据以同型对照减除后整个moDC群体的中位数荧光强度表示。
实时定量PCR分析
从上皮细胞中纯化总RNA (RNeasy;Qiagen, Valencia, CA, USA)和cDNA合成(Ready-to-Go RT-PCR珠;Amersham,皮斯卡塔韦,新泽西州,美国)。采用实时定量PCR检测人IL-25、PD-L1和PD-L2基因的表达(LightCycler480;Roche,巴塞尔,瑞士)使用SybrGreen,特异性引物(Eurofins MWG Operon, Ebersberg,德国)和18S rRNA作为内部控制。
结果
HBEC - moDC共培养对HBEC介质释放及moDC表型的影响
对照和哮喘源性HBEC建立了黏液纤毛表型的融合层,如前所述[25],黏蛋白5AC、β-微管蛋白IV和带膜闭塞蛋白-1染色呈阳性(图S2A和B)。HBEC与moDC共培养24 h后不改变两种细胞的存活率(台锥蓝排除后>98%)。通过CD3和CD19染色,我们排除了淋巴细胞,尤其是t细胞在moDC人群中的持久性(图S2)。
在没有HBEC共培养的情况下,moDC上清中除CCL2外,未检测到细胞因子或趋化因子的分泌(图1一个- e)。
与HBEC单独培养相比,cHBEC与对照moDC共培养时CXCL10和CCL2产量显著上调(n=6)。相反,与基线相比,与对照组(n=7)或哮喘型(n=8) moDC共培养的saHBEC中CXCL8、TSLP和IL-33的产生显著上调(图1一个-e和表S1)。IL-25分泌未检测到。然而,研究了IL-25 mRNA的表达,没有发现差异(图1 f).
与moDC共培养导致PD-L1 mRNA水平仅在saHBEC中升高,而PD-L2 mRNA在cHBEC和saHBEC中均升高(图1 g和h)。
CD11c和CD83的表达与任何一种上皮细胞共培养均未改变(图2一个而且b分别)。而与cHBEC共培养的对照组中,HLA-DR、CD40、CD80和CD86的表达均上调(图2 c- f)。在对照组和哮喘moDC与saHBEC共培养中发现CD86的单独上调(图2 f).
比较了不同临床组之间的变化率(表S1)。只有CD80调制在对照组moDC/cHBEC组和对照组moDC/saHBEC组和严重哮喘moDC/saHBEC组之间有显著差异。
颗粒物对HBEC介质释放的影响
透过透射电子显微镜(TEM)观察的微粒由平均直径为10纳米的球形初级粒子组成,这些粒子形成小的聚集体(图3一).30分钟至2小时后,位于HBEC层上的颗粒物质被上皮细胞内化(图3 b而且c),并在24小时后在HBEC细胞质中发现(图3 d).
cHBEC (n=6)和saHBEC (n=15)培养在基线和有颗粒物质存在的情况下,测量CXCL8、CXCL10、CCL2、TSLP、IL-33和IL-25的基外侧生成。与基线水平相比,颗粒物质的添加并没有改变cHBEC的反应,但它导致了saHBEC中CXCL8和IL-33的释放增加(图3 e我)。与之前一样,IL-25分泌检测不到;因此,我们研究了IL-25 mRNA的表达,发现颗粒物诱导的cHBEC降低(图3 j).与saHBEC组相比,这种变化有显著差异(表S2)。共刺激分子PD-L1和PD-L2的转录物在cHBEC和saHBEC中检测到的水平较低,但相似,在HBEC的根尖表面添加颗粒物质24小时后没有引起任何变化(图3 k).
颗粒物对hbc - modc共培养的影响
cHBEC与moDC共培养的颗粒物暴露(n=6)不会改变HBEC反应或先前在该共培养系统中描述的感兴趣分子的moDC质膜表达。saHBEC与对照组moDC共培养(n=7)的颗粒物暴露诱导了基底外侧CCL2产量的额外增加,这在与严重moDC共培养的saHBEC中没有发现。但moDC质膜表达未见进一步变化(图4表S3)。
讨论
利用重构的人ALI上皮模型[25,我们开始进一步研究严重哮喘患者的上皮细胞-树突细胞串扰。因为超细颗粒物可能会影响哮喘呼吸道,我们质疑它对这种串扰的影响。首先,我们发现上皮细胞-树突状细胞共培养上调TSLP, IL-33和CXCL8的产生,上皮PD-L1和PD-L2转录,以及moDC CD86的上调,当上皮细胞来自严重哮喘患者时,与moDC的起源无关。此外,仅暴露于上皮细胞的颗粒物导致哮喘源性上皮细胞CXCL8和IL-33的产生升高,而非哮喘源性上皮细胞CXCL8和IL-33的产生保持不变,除了IL-25 mRNA表达下降外。这一发现与HBEC - moDC共培养的反应形成对比,后者的HBEC来自对照供体,其中CCL2和CXCL10分泌上调,HBEC选择性PD-L2 mRNA增加,并且观察到更广泛的moDC表现和共刺激分子上调(MHC II类,CD40, CD80和CD86)。相比之下,在严重哮喘患者中,除了CCL2增加外,添加PM不能改变先前对hbc - modc串扰的反应。综上所述,我们的结果支持HBEC作为气道界面反应的关键协调者的作用。哮喘或非哮喘状态影响hbec -树突状细胞功能单元与空气(特定物质)和/或组织(树突状细胞)玩家的相互作用。
大多数已发表的研究使用浸泡培养的细胞系来研究与其他细胞类型的相互作用或颗粒物质的影响[27–30.].我们的研究最重要的优势是独家使用了从患者身上获得的人原代细胞,ALI培养模型允许重建完全分化的上皮细胞,保留了供体的上皮分泌特征[25],以及人类moDC。血液单核细胞和未成熟树突状细胞被招募到肺,主要是在促炎条件下,但也用于肺树突状细胞的稳态周转[1,16,31].在体外来源的moDC在表型和功能上与炎症气道中发现的常规(髓系)树突状细胞相关[31–33].
趋化因子和细胞因子的分泌模式对hbec -树突状细胞的串扰至关重要,并由上皮细胞和免疫细胞的环境和内在特性进行精细调节。我们在本研究中发现,在颗粒物质存在时,saHBEC更容易改变其细胞因子和趋化因子模式,其变化包括CXCL8和IL-33的增加。CXCL8在慢性呼吸道疾病中的作用已得到很好的描述,气道壁上皮和上皮下CXCL8表达的增加与肺功能的下降有关[34].在CXCL8长期升高的情况下,过多的气道CXCL8可能通过上皮识别脱敏来阻止正常的上皮对细菌病原体的反应[35].IL-33是ST2受体的配体,与其他IL-1家族成员不同的是,它能够促进th2型反应[36,37].表达IL-33及其受体ST2的上皮细胞通过CXCL8上调对IL-33作出反应[38].此外,其他细胞,如CD4+t淋巴细胞或ILC2也表达ST2并对IL-33作出反应,与适应性免疫直接联系。一项全基因组关联研究确定IL-33/ST2轴是哮喘的潜在关键参与者,并通过ILC2招募和激活成为关键的T2驱动因素,与过敏原特异性刺激无关。我们的结果表明,尽管存在对照或哮喘moDC,但在稳态和颗粒物刺激后,这种激活途径在哮喘中的持久性。
此外,我们还证明了cHBEC与对照moDC共培养可增加CCL2和CXCL10的产量。HBEC释放的CCL2是单核细胞的强趋化剂通过其受体CCR2 [39].它作用于活化的t细胞、自然杀伤细胞和嗜碱性粒细胞[40,41类似CXCL10。CCL2和CXCL10被认为是th1型反应的一部分,包括呼吸道病毒引起的反应[16,42].相反,在sahbeck - modc共培养中,观察到CXCL8和IL-33以及TSLP分泌的增加。TSLP是造血细胞因子家族的一员,作用于树突状细胞、单核细胞和t细胞[43].TSLP在哮喘患者气道中的表达增强,并与症状评分相关[44].TSLP作用于未成熟的传统树突状细胞,引导它们走向促炎T2反应[45].CXCL8已被证明降低树突细胞启动naïve t细胞的能力,这种影响与树突细胞共刺激分子的不完全上调有关[46].
有趣的是,在某些情况下,气道上皮细胞可以在气道炎症和免疫反应的发展过程中发挥APC的作用通过PD-L1和PD-L2的表达[18].这些分子起着完全相反的作用[47],其中PD-L1参与有利于气道高反应性和t2型反应的发展,而PD-L2启动t1型反应并发挥保护作用。同时表达PD-L1和PD-L2可中和它们各自的作用,且不会立即导致t细胞的极化[19].在我们的研究中,moDC共培养与saHBEC中PD-L1和PD-L2表达同时增加有关,而单独PD-L2在cHBEC中表达增加。综上所述,这些结果表明hbec -树突状细胞功能单位在非哮喘患者中促进了防御性t1型反应,但在哮喘患者中显示了不适当的混合反应,因此强调了上皮状态在进一步免疫决策中的重要性。
暴露于颗粒物质的moDC-HBEC共培养结果显示,cHBEC没有进一步的修饰,但saHBEC显示出CCL2产量的增加。在chbc - modc共培养中,颗粒物质添加后CXCL10或CCL2没有进一步上调,这表明其本身具有强大的pro-T1信号。相比之下,在sahbeck - modc共培养中,CCL2的上调表明了单核细胞趋化效应,以及炎症树突状细胞前体的自我维持招募和激活。
树突状细胞的表型调节与HBEC作为树突状细胞的指导员,通过伴随的HLA-DR、CD40和CD80的上调,以及过敏原诱导的IL-13、IL-5和IL-9的选择性衰减,实现T1极化反应的观点一致[32,48].cHBEC诱导HLA-DR、CD40、CD80和CD86在moDC上的表达上调,saHBEC导致CD86的孤立性表达上调。因此,树突状细胞的差异表型调节是由哮喘-与nonasthmatic-derived上皮细胞;基本上,树突状细胞在哮喘中表现出不完全成熟和抗原处理和呈递的信号,尽管通过CCL2表达表现出活跃的串音。
在我们的研究中,HBEC和树突状细胞来源于不同的供体,这种异体相互作用可能影响了这两种细胞类型的功能反应。因此,我们检查了自体共培养的行为,发现尽管异体培养和自体培养之间存在细胞因子分泌水平的差异,但变化趋势是相同的(图S3和S4以及表S4和S5)。HBEC与树突状细胞之间的接触需求,特别是通过假设的树突状细胞指状突起作为上皮细胞内的哨兵,在我们的模型中无法解决,因为插入孔直径为0.4µm。因此,我们的研究强调,与健康受试者相比,可溶性介质本身能够诱导哮喘患者的不同反应模式,指出接触并不总是不可或缺的。可能有直接和间接的相互作用通过可溶性介质是诱导完全反应所必需的。在我们的模型中,我们假设微粒物质可能被动或主动地穿过上皮细胞。我们还试图用透射电镜检查基底侧培养基中是否存在颗粒物质,但培养基诱导的人为物阻碍了显微镜检查。
皮质类固醇治疗的途径、剂量和持续时间可能会影响上皮细胞的行为,特别是通过Fukakusa等.[49].然而,使用ALI培养系统,分化的HBEC在最后一次接触皮质类固醇后不早于8周使用。虽然我们在本研究中没有直接评估糖皮质激素的影响,但HBEC的特征被认为是内在的,而不是由于他们之前可能接触过糖皮质激素。
我们的数据支持这一观点,即非哮喘上皮细胞鼓励有效的t1极化反应,这在哮喘中由于上皮和上皮诱导的异常而受损。为了支持这一观点,我们进行了一些(n=3)与hbec条件下的树突状细胞和淋巴细胞共培养的实验。sahbeck调节的树突状细胞/淋巴细胞的细胞因子分泌谱随着t2相关反应的增加呈现显著差异趋势,即.IL-4和IL-6, th1相关反应降低,即。干扰素γ.此外,我们还发现了t调节相关的反应下调(IL-10下降)和自我维持的t辅助生成(IL2增加)。
总之,我们发现人类重建支气管上皮细胞和人类moDC之间的相互作用导致saHBEC中的t1极化反应,在哮喘患者中切换到t2型反应,从而表明上皮表型改变了树突状细胞反应。我们在这里提出了一个支气管上皮-树突单位的人类共培养模型,可以进一步解剖哮喘患者与非哮喘性上皮反应。
补充材料
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补充材料erj - 02399 - 2016 - _supplement
图S1erj - 02399 - 2016 - _figure_s1
图S2erj - 02399 - 2016 - _figure_s2
披露的信息
确认
作者感谢Daniel Ferry (CINaM, Marseille, France)提供颗粒物质,Fabrice Richard和Jean-Paul Chauvin (IBDM, Marseille, France)提供透射电镜和数据分析技术援助,Aurelie Fort (MedBioMed, Montpellier, France)在上皮细胞照片获取方面提供技术援助,Matthew Loza, Patrick Branigan和Frederic Baribaud (Johnson & Johnson, Philadelphia, PA, USA)对手稿进行英文评审。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com
临床试验:本研究中使用的血液样本是注册于www.clinicaltrials.gov标识符编号NCT00793676.
支持声明:这项工作得到Société Française d'Allergologie, Fond de Recherche en Santé respiratory atoire, ARARD和ANR的支持。本文的资助信息已存入交叉参考基金注册.
利益冲突:可以在本文旁边的网站上找到信息披露www.qdcxjkg.com
- 收到了2016年5月23日。
- 接受2017年1月3日。
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