摘要
在法国哮喘遗传与环境流行病学研究(EGEA)家族中,在gene×early-life环境烟草烟雾(ETS)暴露相互作用的情况下进行的支气管高反应性(BHR)全基因组连锁扫描显示,17p11区域的相互作用最强,该区域仅在未暴露的兄弟姐妹中检测到连锁。我们的目标是对17p11进行精细规模的测绘,以确定与ETS相互作用的影响BHR的单核苷酸多态性(SNPs)。
采用两步策略对388个法国EGEA哮喘家庭进行了分析:1)在未暴露的兄弟姐妹中选择显示基于家庭的关联测试(FBAT)关联信号(p≤0.01)的snp, 2)暴露和未暴露的兄弟姐妹之间的FBAT同质性测试以及稳健的对数线性相互作用测试。
单个SNP达到阈值(p≤3×10)−3)在考虑多项测试后,使用两项交互测试与ETS进行显著交互。结果在253个法裔加拿大家庭中得到了重复,但在341个英国家庭中没有得到重复,部分原因可能是数据集之间表型特征的差异。
与ETS互作显著的SNP属于DNAH9(动力蛋白,轴突,重链9),一个有希望的候选基因参与呼吸纤毛的流动性,并与原发性纤毛运动障碍相关,一种与肺功能异常相关的疾病。
摘要
之间的相互作用DNAH9发现支气管高反应性基因和早期吸烟暴露http://ow.ly/V9qft
简介
哮喘是一种常见的呼吸道疾病,以气道炎症、可逆性气流阻塞和支气管高反应性(BHR)为特征。BHR是哮喘的一个特征,也是哮喘的一个重要危险因素[1].BHR是由于气道对物理和化学刺激物(如冷空气和香烟烟雾)和药理学制剂(如甲胆碱和组胺)的敏感性增加。哮喘和BHR都是多种遗传和环境因素相互作用的结果。许多基于定位克隆方法和全基因组关联研究(GWAS)的遗传研究已用于哮喘和BHR [2].这些研究主要集中在疾病和个体遗传多态性之间的联系,已经成功地识别了易感基因[2].然而,所有这些基因只占遗传力的一小部分[3.].为了进一步了解复杂疾病的遗传基础,目前的研究正在扩展到更复杂的分析,考虑到表型异质性和gene×gene或gene×environment相互作用。对于哮喘和BHR,环境因素的参与已被证明是实质性的,在遗传研究中包括gene×environment相互作用似乎是主要的兴趣。在与哮喘和BHR相关的环境因素中,孕妇怀孕期间吸烟和早年接触环境烟草烟雾(ETS)是重要的危险因素[4].Gene×ETS哮喘易感性和哮喘相关表型的相互作用首次在全基因组连锁扫描的背景下得到证实[5- - - - - -7]以及通过与候选基因的关联研究,包括ADRB2(β2-肾上腺素能受体)[8],GSTM1基因(谷胱甘肽年代-转移酶M1) [9],GSTT1(谷胱甘肽年代-转移酶T1) [9),问题(谷胱甘肽年代-转移酶P1) [10].儿童哮喘GWAS检测到17q21位点的遗传变异[11在法国哮喘遗传与环境流行病学研究(EGEA)中首次发现,早期接触ETS的受试者患早发性哮喘的风险增加[12]及随后在其他研究中[13- - - - - -15].PCDH1(原钙粘蛋白1)和ADAM33(ADAM金属肽酶结构域33)基因经定位克隆鉴定为BHR易感基因[16,17]也被发现与ETS暴露相互作用在子宫内和/或早年[16,18,19].最近,一项儿童哮喘全基因组相互作用研究(GWIS)的元分析表明,许多基因与ETS暴露之间存在潜在的相互作用[20.].
先前在gene×ETS暴露相互作用下进行的EGEA家族BHR全基因组连锁扫描显示,17p11区域的相互作用最强[7],在这些研究中,只有在未暴露的兄弟姐妹中发现了这种联系。我们的目标是对这一区域进行精细测绘,以确定在BHR易感性中与ETS暴露相互作用的遗传变异。采用基于家庭的关联测试(FBAT)的两步策略[21]在388个通过哮喘先证者确定的法国EGEA家庭的发现样本中进行。我们通过另一个基于对数线性模型的交互测试验证了我们的结果[22],并在另外两个哮喘确定的家庭样本中进行复制分析,其中包括253个法裔加拿大家庭和341个英国家庭。
材料与方法
发现样品
EGEA研究和纳入标准已在前面详细描述[23].EGEA家庭样本包括388个法国核心家庭,其中253个家庭的子女患有哮喘(90%的家庭有一名子女先证者,其余家庭有两名子女先证者),135个家庭的父母中有一人患有哮喘。
如前面的联动分析[7],根据乙酰胆碱支气管激发试验结果确定BHR表型。受试者服用刺激性剂量的甲胆碱后,1秒内其基线用力呼气量(FEV)下降≥20%1(PD)20.)≤4 mg·mL−1有BHR,而FEV没有下降的参与者1没有BHR。这种二元BHR表型(是/否BHR)随后将被指定为BHR。甲胆碱激发试验的方案已在其他地方详细描述[23].
本研究中儿童早期ETS暴露的定义与之前的关联分析中使用的定义相同[7],以及ETS与EGEA家族17q21变体相互作用的鉴定[12]及随后的复制研究[13- - - - - -15].ETS暴露的定义如下:1)对于成年人,通过对问题的肯定回答:“你的母亲或父亲在你童年早期吸烟吗?”2)对于孩子,通过对孩子的母亲(或父亲)提出的问题:“您或您孩子的父亲(或母亲)在您孩子不到2岁时吸烟吗?”我们没有使用信息在子宫内暴露于烟草烟雾,因为所有在怀孕期间吸烟的母亲在其后代的幼儿时期继续吸烟。
复制的研究
Saguenay-Lac-Saint-Jean (SLSJ)哮喘研究包括253个法裔加拿大多代家庭,通过两个先证者确定患有哮喘[24].先证者的纳入标准已在前面描述[24].
英国南安普顿哮喘家族队列(SOTON)之前已详细描述[25].共有341个来自南安普顿地区的白人家庭被招募,他们至少有两个兄弟姐妹(5-21岁),目前被医生诊断为哮喘,并定期服用哮喘药物[25].BHR (PD20.)表型和ETS暴露在SLSJ和SOTON研究中定义的方式与EGEA研究相同。
基因分型
EGEA受试者在Génotypage国家中心(CNG, Evry,法国)使用Illumina 610 Quad阵列(Illumina, San Diego, CA, USA)进行基因分型,该阵列是欧洲GABRIEL哮喘联盟的一部分[26].严格的质量标准,如前所述[26],用于选择个体和snp进行分析。在这项研究中,我们使用了1732个snp,它们位于距离pter 16 Mb的17p11连锁峰两侧,间隔为5 Mb。SLSJ样本也使用Illumina 610 Quad阵列在CNG中进行基因分型。与用于EGEA的个体和标记相同的质量控制标准应用于本数据集。SOTON家族样本采用LGC基因组公司(Hoddesdon, Hertfordshire, UK;www.lgcgenomics.com),使用专有的竞争性等位基因特异性PCR基因分型系统(KASPar)。
统计分析
EGEA发现样品分析
FBAT两步分析
由于17p11区域是通过连锁分析检测到的,所以采用FBAT方法进行分析[21],在存在连锁的情况下测试关联。我们假设了一个加性遗传模型,并使用了“-e”选项[27]作为方差的经验估计量,这使得关联检验对兄弟姐妹之间的依赖关系具有鲁棒性,并允许使用一个家庭中的所有兄弟姐妹。
为了限制多重测试的问题,我们采用了两步策略,包括第一步SNP选择,然后是第二步相互作用测试。这种策略目前用于基于大量标记的相互作用研究,以减少因多次测试校正而造成的功率损失[28,29].由于先前仅在未暴露的兄弟姐妹中检测到与17p11的连锁[7],在第一步中,我们使用1%的非严格阈值(通常在两步策略中推荐)在同一组未暴露的兄弟姐妹中选择表明FBAT与BHR关联信号的snp。在第二步中,我们通过使用FBAT测试暴露和未暴露兄弟姐妹之间SNP-BHR关联的同质性来搜索SNP×ETS相互作用[30.].该测试应用于第一步选择的snp。由于在未暴露的兄弟姐妹中存在关联信号并不依赖于SNP×ETS交互的存在(即。暴露和未暴露兄弟姐妹之间SNPs的影响不同),这两个步骤是独立的。因此,在第二步对多重测试的校正使用了对第一步所选snp数量的Bonferroni校正。
使用Umbach-Weinberg方法进行验证分析
为了验证在FBAT同质性检验中发现的显著相互作用,我们应用了由美国大学提出的对数线性建模方法来测试三元组(个案和亲本)的相互作用mbach和Weinberg[22].这种方法允许对每个兄弟姐妹的基因型亲本交配进行调整,从而避免由于种群分层造成的偏见。亲本基因型配种的不同分布与由于人口分层,未暴露的兄弟姐妹可能导致两组之间的传播概率不同,从而导致相互作用的错误检测。因此,FBAT比Umbach-Weinberg方法更不可靠,因为FBAT只调整了暴露和未暴露兄弟姐妹组中的基因型父母分布。然而,乌姆巴赫-温伯格方法不如FBAT方法强大,因为它只能适用于每个家庭的一个兄弟姐妹。首先使用最小的兄弟姐妹进行对数线性分析,他们接触ETS的信息与BHR发生的时间最接近,因此受潜在回忆偏差的影响最小。分析还考虑了年龄最大的兄弟姐妹,但也得到了类似的结果,因此没有提出。请注意,在EGEA中,超过三分之二的家庭只有一个兄弟姐妹患有BHR,这使得兄弟姐妹的选择无关紧要,并至少部分地解释了最小和最大兄弟姐妹的结果相似性。此外,这表明整体的家庭依赖程度并不大。
最后,为了避免由于每个家庭选择一个兄弟姐妹而造成的任何偏见,我们在考虑兄弟姐妹之间的依赖关系的同时,对所有兄弟姐妹应用了umach - weinberg -like方法。为此,我们使用了具有稳健方差估计量的对数线性(泊松回归)模型[31],在Stata版本12中实现(Stata Corporation, College Station, TX, USA)。请注意,在EGEA中进行这样的分析只是因为在估计其他数据集中的稳健标准误差时遇到了问题。
至于FBAT分析,所有这些分析都假设了一个加性遗传模型,并应用了多次测试的相同校正,即。根据第一步选择的SNPs数量进行Bonferroni校正。
SLSJ和SOTON家族的复制分析
通过FBAT同质性和umach - weinberg试验,在发现样本中显示与ETS显著相互作用的snp在复制样本中使用相同的两种相互作用试验进行了分析。为了声明在复制样本中验证的相互作用,我们再次对这些样本中测试的snp数量应用Bonferroni校正。
结果
数据描述
EGEA、SLSJ和SOTON家族中BHR基因型兄弟姐妹的特征显示在表1.
EGEA共304例(189个家庭),SLSJ共145例(120个家庭),SOTON共382例(258个家庭)。在这些兄弟姐妹中,三个数据集中特异反应对象的比例相似(在76%到86%之间),而SLSJ和SOTON组哮喘患者的比例(95%)高于EGEA组(60%)。三个数据集中患有BHR的兄弟姐妹中女性的比例相似,在43%至52%之间。相比之下,SOTON组的兄弟姐妹平均年龄为10.6岁(95% CI 8.0 ~ 13.8), EGEA组和SLSJ组的兄弟姐妹平均年龄分别为16.1岁(95% CI 15.2 ~ 17.0)和20.3岁(95% CI 18.6 ~ 22.0)。同样,SOTON组哮喘的平均发病年龄(4.4岁,95% CI 4.0-4.7)低于EGEA组(7.4岁,95% CI 6.3-8.6)和SLSJ组(9.4岁,95% CI 7.7-11.0)。最后,在SOTON中,只有29.8%的BHR兄弟姐妹暴露于ETS,而EGEA和SLSJ中这一比例分别为58%和64%。
分析gene×ETS的交互
EGEA发现样本的结果显示在表2.
在EGEA未暴露的兄弟姐妹中进行17p11区域的FBAT分析,显示16个SNPs(在去除完全连锁不平衡的SNPs后)与BHR相关(p≤0.01)。当使用FBAT之间的同质性测试暴露与未暴露的兄弟姐妹,其中一个snp在多次测试后显示出显著的相互作用(p=0.05/16=3×10)−3),即。p = 8×10−4对于rs7225157,其中一个接近重要,即。p = 4×10−3对于rs1519255 (图1).umach - weinberg方法也发现与rs7225157的相互作用显著(p=1.6×10)−3),因此被验证,而rs1519255则不是这样(p=0.04)。请注意,当使用umach - weinberg -like方法应用于EGEA中的所有兄弟姐妹时,与rs7225157的相互作用达到p=10−5,从而大大超过了显著性阈值,加强了我们的发现。
rs7225157小等位基因与未暴露ets的兄弟姐妹BHR呈负相关,与暴露ets的兄弟姐妹BHR呈正相关。
因此,在复制样本中,只有rs7225157向前移动(表3).
使用FBAT同质性检验(p=0.04)和umach - weinberg方法(p=0.03),在SLSJ中,与ETS暴露的相互作用被显著检测到,方向效应与EGEA相同。
然而,无论采用FBAT同质性检验(p=0.2)还是umach - weinberg方法(p=0.43), ETS与rs7225157的相互作用均未在SOTON家族中复制。
讨论
这项研究在17p11区域发现了一种与BHR相关的遗传变异,并与ETS暴露相互作用。在法国EGEA家族先前报道的连锁区域检测到与ETS的显著相互作用[7].这种相互作用的证据基于使用FBAT在大型EGEA发现家族样本中获得的显著结果,并通过对数线性建模方法验证,该方法对种群分层具有鲁棒性。在使用这两种方法的法裔加拿大家庭中进一步获得了这些结果的复制。因此,我们的结果在统计方法学水平上的验证和在人口水平上的复制都得到了加强。
在SOTON家族中未观察到17p11 SNP×ETS暴露相互作用的复制。这种复制的缺乏可能反映了数据集之间在遗传背景、ETS暴露、表型特征和/或确定模式方面的异质性。事实上,SOTON兄弟姐妹与EGEA和SLSJ兄弟姐妹在ETS暴露频率和表型特征方面都有所不同。与EGEA和SLSJ兄弟姐妹相比,SOTON兄弟姐妹暴露ets的比例较小(1 / 3)与三分之二)。此外,患有BHR的SOTON兄弟姐妹哮喘的发生率(95%)远高于EGEA兄弟姐妹(60%)。此外,如结果部分所述,SOTON兄弟姐妹比EGEA和SLSJ兄弟姐妹更年轻,哮喘发作的平均年龄更小。发病年龄较轻的哮喘可能确实依赖于较强的基因效应和较小的ETS效应,使得gene×ETS相互作用更难检测。年龄的遗传异质性是有据可查的。例如,17q21变异的影响根据哮喘发病年龄的不同而不同[12,26],以及与呼出分数、一氧化氮分数(F伊诺)的水平,一种与哮喘相关的表型,在儿童和成人中也有所不同[32].
在研究中复制结果的另一个困难是,显示最显著结果的SNP(这里是rs7225157与ETS的相互作用)可能不是因果SNP,而是与其连锁不平衡的SNP。然而,当我们在EGEA中重复分析hapmap2推测的snp时,观察到一些相互作用信号支持我们的初始结果,但没有这个结果显著。因此,没有迹象表明推测的SNP可能是因果变异或与之存在强烈的连锁不平衡,并且可能有更好的机会在其他样本中复制。此外,SNPs之间的连锁不平衡模式预计在法国和英国人群中不会有所不同。
然而,值得注意的是,对归算结果的解释应以遗漏了部分遗传变异的可能性为条件。
大多数先前关于遗传变异与ETS对哮喘风险的相互作用研究都难以在独立样本中显示出显著的相互作用和/或复制[14,16,20.].事实上,复制gene×ETS的相互作用比复制单个SNP关联要困难得多。已知相互作用测试的有效性较低,而且,如前所述,在研究之间有许多异质性来源,对于检测gene×ETS相互作用比单个SNP关联更重要。还应该注意的是,我们在这里应用了一种特别严格的策略,该策略仅保留了通过两次稳健相互作用测试显示显著相互作用的snp。该策略避免了由于种群分层而导致的交互错误检测,但功耗较低。
我们证实,任何已发表的GWAS均未报道17p11位点与BHR、哮喘或其他肺功能相关表型之间的关联(www.genome.gov gwastudies).尽管一些gene×ETS交互研究[16,18],但17p11位点从未被提及。SNP显示了显著的相互作用,即。Rs7225157位于基因的内含子区DNAH9SNP的小等位基因在未暴露ets的兄弟姐妹中具有保护作用,但在暴露ets的兄弟姐妹中增加风险。使用HaploReg工具检查功能注释(http://compbio.mit.edu/HaploReg)和UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu)表明rs7225157 SNP及其代理位点可映射到多种转录因子的结合位点。这些转录因子包括FAC1(胎儿alz -50反应性克隆1),被发现与肺癌和肺腺癌有关,CTCF(ccctc结合因子(锌指蛋白)),它在表观遗传调控中起着关键作用,NR4A1(核受体亚家族4组A成员1),在ets暴露的受试者中发现与肺癌相关[33),而GATA2(GATA结合蛋白2),据报道与一种免疫缺陷疾病(树突状细胞、单核细胞淋巴细胞、B和自然致死性淋巴缺陷)有关[34].
DNAH9编码轴突动力蛋白的重链亚基,鞭毛内运输的一个组成部分,负责纤毛的移动。有趣的是,小鼠气道纤毛流动性的丧失与气道反应性的增加有关[35].在哮喘患者的气道中,上皮基底膜的某些区域似乎被纤毛细胞剥蚀[36].DNAH9是人体呼吸道纤毛细胞中数量最多的轴突动力蛋白重链基因亚型[37],最近有报道称其在原发性纤毛运动障碍(PCD)患者的支气管活检中表达下调[38这是一种与支气管扩张和肺功能异常有关的疾病。BHR可能通过降低呼吸清除机制的效率,从而促进微生物定植和炎症,在PCD的主要肺部并发症支气管扩张的发病机制中发挥作用[39].最后,急性和慢性暴露于香烟烟雾与支气管肺泡灌洗液中动力蛋白浓度的增加、牛和小鼠肺部纤毛运动的改变有关[40,41],以及小气道上皮细胞的表观遗传变化[42].
所有这些观察都表明DNAH9和ETS暴露在呼吸纤毛流动性中,这与BHR有关,支持我们发现的潜在交互作用DNAH9在BHR中暴露于ETS。有趣的是,最近儿童哮喘和ETS暴露的GWIS [20.表明ETS暴露与PACRG(Parkin共调节基因),与DNAH9,在运动纤毛功能中起重要作用。此外,纤毛相关基因的通路最近已被证明与哮喘的生物标志物高度相关,即F。伊诺,通过支气管上皮细胞基因表达研究[43].在临床水平的直接实际应用不能从这一遗传流行病学研究框架中获得的结果推断出来。然而,结合最近的文献,我们的结果增加了研究纤毛相关基因的兴趣[44].这一新兴的主题已经导致了与哮喘临床亚表型相关的新基因的鉴定,这表明睫状体功能的变化可能与儿童哮喘的发展特别相关。
总之,本研究发现了一个很有前途的候选基因,与ETS暴露在BHR易感性中的相互作用。它强调了gene×environment相互作用分析,超越单SNP关联分析,可以极大地有助于基因鉴定。进一步确认的相互作用DNAH9为了更好地了解该基因在BHR中的作用,还需要进行ETS暴露和功能研究。
确认
我们感谢INSERM、法国高等教育和研究部、巴黎狄德罗大学对我们的研究和EGEA合作小组的支持。
EGEA合作小组:协调.V. Siroux(流行病学,2013年以来的首席研究员);F. Demenais(遗传学);一、Pin(临床方面);R. Nadif(生物学);F. Kauffmann(1992-2012年首席研究员)。
EGEA合作小组:呼吸流行病学.INSERM U700,巴黎:M. Korobaeff (EGEA1), F. Neukirch (EGEA1);INSERM U707,巴黎:I. Annesi-Maesano (EGEA1/2);英刊CESP/U1018, Villejuif: F. Kauffmann, N. Le Moual, R. Nadif, M.P. Oryszczyn (EGEA1/2), R. Varraso;INSERM U823, Grenoble: V. Siroux。
EGEA合作组:遗传学.INSERM U393,巴黎:J. Feingold;巴黎:E.布齐贡,F.德梅奈,M.-H。Dizier;CNG,埃弗里:I. Gut(现CNAG,巴塞罗那,西班牙),M. Lathrop(现麦吉尔大学,蒙特利尔,加拿大)。
EGEA合作小组:临床中心.格勒诺布尔:I. Pin, C. Pison;里昂:D. Ecochard (EGEA1), F. Gormand, Y. Pacheco;马赛:D. Charpin (EGEA1), D. Vervloet (EGEA1/2);蒙彼利埃:J. Bousquet;帕里斯·科钦:A.洛克哈特(EGEA1), R.马特兰(现里尔);Paris Necker: E. Paty (EGEA1/2), P. Scheinmann (EGEA1/2);巴黎-特鲁索:A. Grimfeld (EGEA1/2), J. Just。
EGEA合作组:数据和质量管理.INSERM ex-U155 (EGEA1): J. Hochez;INSERM CESP/U1018, Villejuif: N. Le Moual;INSERM ex-U780: C. Ravault (EGEA1/2);N. Chateigner (EGEA1/2);格勒诺布尔:J.昆汀-弗兰(EGEA1/2)。
作者感谢SLSJ哮喘家族收集的所有参与者。C. Laprise是加拿大哮喘遗传决定因素研究主席(www.chairs-chaires.gc.ca),法国研究基金会呼吸健康网络炎症与重塑战略小组主任Québec - Santé (http://rsr.chus.qc.ca),亦是AllerGen (www.allergen-nce.ca).
脚注
支持声明:法国EGEA研究的部分资金来自法国国家研究机构(ANR 05- sst -020-02/05-9-97, ANR 06-CEBS, ANR-11- bsv1 -027- gwis - am)。对哮喘确定样本的基因分型得到了欧盟委员会(018996)和法国高等教育和研究部的资助。我们也感谢法兰西大区(DIM-SEnT 2011)和研究基金会Médicale (FRM 2013)的支持。自2005年以来,由C. Laprise担任哮喘遗传决定因素加拿大研究主席,允许法国-加拿大研究的维持。南安普顿哮喘家族队列(SOTON)最初是与Genome Therapeutics Corp.和先灵葆雅合作招募的。基因分型得到了哮喘、过敏和炎症研究慈善机构(AAIR)的支持。本文的资助信息已存入FundRef.
利益冲突:没有声明。
- 收到了2015年3月23日。
- 接受2015年11月18日。
- 版权所有©ERS 2016