摘要
有限的文献资料表明肥大细胞中介物糜酶与肺动脉高压和肺纤维化的病理有关。然而,没有证据表明乳糜酶对肺纤维化相关的肺动脉高压的发展有贡献,肺纤维化是一种重要的疾病,与已经患有危及生命的肺间质疾病的患者的死亡率增加有关。
本研究的目的是通过使用博莱霉素诱导的肺动脉高压模型,研究乳糜酶在这种特殊的肺动脉高压形式中的作用。
凝乳酶抑制导致肺动脉高压和肺纤维化的衰减,从改善的血流动力学可以明显看出,右室重塑/肥厚减少,肺血管重塑和肺纤维化。这些有益作用与肥大细胞数量和活性的强烈下降趋势有关,并显著降低糜酶的表达水平。从机理上讲,抑制乳糜酶可导致肺内转化生长因子β1和基质金属蛋白酶2含量的降低。此外,乳糜酶抑制可防止内皮素1诱导的肺动脉大血管收缩。
因此,ChyMase在与肺纤维化相关的肺动脉高压发病机制中起作用,并且可以代表有前途的治疗靶标。此外,本研究可以提供有价值的见解,这是对肺动脉高血压背景下的冠酶的贡献,通常是无论肺动脉高血压形式。
摘要
ChyMase在与肺纤维化相关的肺动脉高血压病理学中起重要作用http:///wly/mvyw6.
介绍
与肺纤维化相关的肺动脉高压(PH)是与已经患有严重间质性肺疾病的患者死亡率增加相关的重要因素[1].pH是具有特发性肺纤维化(IPF)患者的相对频繁的医疗状况,因此,它应该得到相当大的关注[1].IPF中PH发展的潜在病理机制仍然知之甚少,对于这种特殊形式的PH可用的治疗选择有限[1].
我们之前已经证明肥大细胞(MCs)可能在PH和肺纤维化的发病和进展中发挥作用[2,3.].在IPF和特发性肺动脉高压(IPAH)患者的肺中,它们的数量和激活显著增加[2,3.].MCs产生参与炎症反应的不同介质[4].在MC介质中,chymase可能特别感兴趣的PH值和IPF的背景下,由于其功能的激活和加工转化生长因子(TGF) -β,内皮素1 (ET),血管紧张素ⅱ,白细胞介素(IL) 1和地震,基质金属蛋白酶(MMP) 2和9,和潜在的参与胶原蛋白合成(5- - - - - -16].基于这一认识,值得注意的是,上述大多数分子介质/信号通路被认为是PH和IPF病理的重要罪魁祸首,从而表明了糜酶和这些疾病之间的潜在联系[5,17- - - - - -27].此外,已有研究表明,表达糜酶的MCs确实在PH值下发生了改变[28- - - - - -30.].此外,我们最近回顾了这种MC介质在IPF中的作用,得出结论,糜酶也可能参与肺纤维化[5].本研究的目的是通过使用仓鼠中的毛霉素诱导的肺纤维化的良好模型来分析和评估胶酶在与肺纤维化相关的pHa开发中的潜在作用。我们选择了仓鼠模型,因为有证据表明仓鼠冠酶显示出类似的基质特异性作为人冠酶[31].相比之下,小鼠和大鼠的糜酶在结构和底物特异性上与人糜酶不同[13,14].虽然这些物种被广泛用于肺纤维化研究,但我们使用了一个模型,它表达的酶谱更接近于人类,因为我们意识到,对于仓鼠的分子工具有局限性。为了探讨乳糜酶在PH与肺纤维化(PF)相关的作用,我们研究了乳糜酶抑制对以下方面的影响:1)血流动力学、右心室(RV)肥大和重构以及肺血管重构;2)肺纤维化;3) MC在肺中的激活和表达;4) TGF-β1、MMP-2、ET-1信号。
方法
研究设计和生理测量
用博莱霉素气管内灌注诱导成年叙利亚仓鼠PH。健康对照组只给予NaCl。将博莱霉素灌注的仓鼠随机分为两组,分别给予乳糜酶抑制剂BCEAB(4-[1-([双-(4-甲基-苯基)-甲基]氨甲酰)3-(2-乙氧基-苯基)-4-氧-azetidine-2-yloxy]苯甲酸)(Bleo-BCEAB)或安慰剂(bleo -安慰剂)口服。血流动力学和右心肥大(RHH)测量方法与前面描述的类似[32].
ET-1分析
分离出肺动脉环中的胶酶抑制对大肠杆菌诱导的血管收缩的影响。此外,通过放射免疫测定和酶联免疫测定法测量ET-1和BIG-ET-1的血浆和肺组织水平。
TGF-β1和MMP-2分析
对TGF-β1和MMP-2具有随后定量的免疫组织化学进行对肺组织切片进行。
人肺组织中ChyMase和TGF-β1的免疫组化学
从接受肺移植的IPAH和IPF患者中获得人肺组织。肺组织经福尔马林固定和石蜡包埋,如先前报道[2].用抗糜酶和抗tgf -β1抗体进行双免疫染色,显微照片三维效果如前所述[30.].
更多细节可在在线补充材料中找到。
统计数据
稿件中的所有数值数据都显示为平均值±SEM..采用单因素方差分析和Newman-Keuls多重比较检验对不同实验组的结果进行统计学比较。
研究批准
动物研究由当地政府批准(Regierungspraesidium Gießen)。人类肺组织捐献的研究方案得到了吉森大学医院(吉森,德国)伦理委员会的批准。每位患者或患者的近亲都被要求获得书面知情同意[2].
结果
抑制乳糜酶可降低PH和RHH
博莱霉素灌注于仓鼠体内导致PH的变化,安慰剂组右心室收缩压(RVSP)显著升高(40.4±3.2 mmHg),而健康对照组为(22.4±2.6 mmHg) (图1a).凝乳酶抑制剂BCEAB显著降低RVSP(23.7±1.5)与安慰剂组为40.4±3.2 mmHg)。两组间系统动脉压无差异(图1b)。pH的肺血管血管血管血管血管血管动力学改变与RV肥大的发育有关,与健康对照组相比,富尔顿集团中的富尔顿指数显着增加(0.35±0.01)(0.27±0.01)(图1c).抑制乳糜酶使富尔顿指数显著降低(0.28±0.02)与0.35±0.01,BLEO-BCEAB与Bleo-placebo)。
抑制糜酶可减少肺血管重构和肺纤维化
与健康对照组相比,注射博来霉素的动物肺部的肌肉化程度显示非肌肉化的肺血管明显减少,全肌肉化的肺血管明显增加(图2A-C)。与安慰剂相比,用ChyMase抑制剂BCeAb处理完全肌肉大小的肺血管和非肌肉大小的肺血管的增加。此外,与健康对照相比,安慰剂组中的内侧壁厚度明显高(22.6±1.1%)(16.8±1.0%)(图2e).抑制乳糜酶导致中壁厚度显著减少(Bleo-BCEAB)与Bleo-placebo, 19.9±0.6%与22.6±1.1%)。在安慰剂组中,博莱霉素可导致肺纤维化的发展,Ashcroft评分(3.63±0.36)(图2一世)。用BCEAB治疗降低了肺纤维化水平(BLEO-BCEAB与Bleo-placebo, 1.98±0.24与3.63±0.36)(图2一世)。
肺部mcs和chymase
MC数在健康对照组和安慰剂组之间无变化(图3一种)。有趣的是,有强烈的倾向于减少用冠酶抑制剂治疗的动物的MCS数量。虽然MC号没有改变,但与健康对照相比,安慰剂组中的MCS更加激活,因为肉芽指数显着降低(图3b).乳糜酶抑制剂BCEAB增加了肉芽化指数,表明MC活化降低,但未达到统计学意义。最后,我们分析了乳糜酶表达(图3C),并发现在安慰剂组中糜酶显著增加(每毫米807±285糜酶阳性免疫反应2%),与健康动物相比(100±42)2%)。BCEAB抑制乳糜酶显著降低博莱霉素模型(Bleo-BCEAB)中乳糜酶阳性信号与Bleo-placebo 226±93与807±285糜酶阳性免疫反应率/ mm2%)。
乳糜酶抑制降低右心室重构
我们分析了心肌细胞的大小,发现安慰剂组心肌细胞的横截面积显著增加(270.70±8.94 μm)2),健康状态(179.20±10.68 μm)2) (图4米).抑制乳糜酶可显著降低心肌细胞肥厚(217.80±14.79)与270.70±8.94μm2在安慰剂组中)。此外,我们还分析了毛细管长度,该参数在实验组之间没有差异(图4n)。此外,右心室肥厚与右心室纤维化的发展相关,表现为安慰剂组右心室胶原蛋白含量显著增加(3.14±0.16%),而健康动物(1.11±0.17%)(图4o).乳糜酶抑制导致胶原蛋白含量显著降低(Bleo-BCEAB)与Bleo-placebo, 1.54±0.04%与3.14±0.16%)。
凝乳酶抑制和ET-1/big-ET-1含量
各组间血浆ET-1浓度无显著差异(图5 b).试验组肺ET-1/big-ET-1比值变化虽无统计学意义,但安慰剂组(0.78±0.29)较健康对照组(0.37±0.15)有明显升高趋势(图5度).凝乳酶抑制剂BCEAB有明显的降低ET-1/big-ET-1比值(Bleo-BCEAB)的趋势与bleo-placebo,0.44±0.13与0.78±0.29)。
酶抑制降低了MMP-2的含量
对不同实验组仓鼠肺进行免疫染色,检测MMP-2 (图6eg)。对MMP-2进行量化(图6小时),结果显示博莱霉素灌注后MMP-2信号明显升高(0.70±0.08评分%),而健康对照组(0.05±0.02评分%)。凝乳酶抑制导致MMP-2含量显著降低(Bleo-BCEAB)与Bleo-placebo, 0.18±0.05与0.70±0.08分数%)。
讨论
本研究发现,抑制博莱霉素诱导的PH可改善血流动力学,减轻肺血管重构和肺纤维化;2)右心室肥厚减少,胶原蛋白含量和心肌细胞大小减少;3)高趋势阻止MCs的存在,更重要的是阻止MCs的激活,并显著降低肺中糜酶的表达。
近年来,我们证明了MC数量的增加及其活性是IPAH和IPF病理的特征[2,3.].活化的MCs释放多种介质,其中糜酶可能在PH和肺纤维化发展的背景下具有重要作用[5,28- - - - - -30.].在博莱霉素小鼠和仓鼠模型中,尽管数量有限,但有证据表明,乳糜酶抑制导致肺纤维化减弱,并抑制二氧化硅诱导的小鼠肺纤维化[16,35- - - - - -37].值得一提的是,MC糜酶在调节胶原合成方面具有潜在的作用,提示可能参与纤维化的病理[7].根据文献,我们发现,从组织学评分分析可知,乳糜酶抑制剂BCEAB能显著降低肺纤维化。重要的是,在这两项研究关注的角色chymase博来霉素模型的PF chymase抑制剂的治疗是预防方法的方式完成的,而我们的研究显示,chymase抑制减少肺纤维化甚至在治疗方法,其实更多的临床相关的16,35].这方面的证据有限在活的有机体内Chymase抑制在pH的领域中的影响是系统地研究这一重要科学问题的罕见之一[38,39].抑制冠酶抑制导致RVSP和RV肥大的显着降低,对系统循环没有任何影响。重要的是,血液动力学和RV肥大有益效果与肺血管重塑减少有关。降低的RV肥大与用冠血酶抑制剂处理的动物的心脏中显着降低的胶原含量和心肌细胞大小相关。这些新发现清楚地表明ChyMase的潜在参与在与肺纤维化相关的pH的病理学中,甚至更多,我们可以将这些知识扩大到pH领域一般,因为增强炎症,特别增加的MCS积累确实是公认的病理特征其他pH形式,如肺动脉高压(PAH)。因此,需要关注该MC调解员在不同熟悉的pH型号中作用的研究。
激活/脱粒后,由不同刺激引起的,MCS释放出各种介质,包括胶酶[4].博莱霉素灌注后,动物肺中的糜酶活性显著增加,如前所述[16,35].符合文献,我们证明了MC激活/脱粒的显着增强,尽管数量没有改变,与健康对照相比,脑膜霉素肺肺肺中脑蛋白酶显着表达。与安慰剂组相比,ChyMase抑制导致降低MC次数和脱粒的强度倾向,并且甚至更多地,胶酶表达的显着降低了。因此,我们的研究结果表明,ChyMase抑制可能干扰通用MC功能,影响MC计数,激活和冠酶表达,并提出了在岩土霉素诱导的发病机制期间的自我延期事件的潜在存在。我们以前观察到同样的现象,在六洛奇林诱导的PAH的背景下,MC稳定剂保留了在严重肺血管疾病的发育过程中进行了进展MC积累和增强的脱粒[2].一种可能的解释可能是,事实上,乳糜酶也能够增加干细胞因子的水平,该因子被认为参与了与一般MC生物学相关的不同细胞过程,如成熟和激活、迁移、生存和增殖[40- - - - - -42].
为了解开负责与肺纤维化相关的pH的潜在机制(图S1),我们专注于ChyMase和三种不同信号传导途径之间的链接,该途径可以涉及pH和PF病理,例如ET-1,TGF-β和MMP-2 [18- - - - - -23,25,26,43].MC ChyMase将Big-ET-1转化为31个氨基酸ET-1(1-31),其可以通过中性NEP进一步加工成ET-1(1-21),表明该MC介质在成熟中的作用ET-1 [5,8- - - - - -10].在这种情况下,ET-1系统确实被认为是PH和肺纤维化的重要罪魁祸首[19- - - - - -21].与安慰剂相比,BCEAB治疗的仓鼠血浆中ET-1浓度略有升高。在非选择性ET拮抗剂治疗的患者中也观察到类似的循环ET-1水平增加的现象,这可以解释为ET- b介导的肺清除率改变[44].因此,人们可以期望在我们的研究中实现了类似的效果,其中干扰ChyMase-et-1轴也可能影响ET-1间隙。但是,应进行进一步的研究以解决这个问题。与健康对照和BCEAB处理的动物相比,肺et-1 / Big-et-1比率趋于增加疾病病症,这表明更多的大肠杆菌将更多的大肠杆菌用于生物活性形式的可能性。此外,我们证明了ChyMase抑制阻止了Big-ET-1诱导的肺动脉血管收缩离体.然而,未来通过在实验模型中使用选择性的糜酶抑制和ET-1拮抗剂进行研究,对于最终了解糜酶-ET-1轴是否参与疾病是至关重要的。有争议的是,必须考虑到糜酶甚至可以发挥ET-1的降解活性[10,45].TGF-β信号改变在PH和PF的发展中发挥作用[5,18,24,25,39,43,46].在这条线中,证明了ChyMase能够通过处理潜伏的TGF-β结合蛋白来潜伏的TGF-β的TGF-β1活化和成熟,并进一步这种非活性形式至生物活性TGF-β形式[5,15,16].我们的结果显示,乳糜酶抑制导致来自博来霉素PH模型仓鼠肺中TGF-β1的表达显著降低,这一发现与文献一致[15,16,39].因此,我们可以推断,chyase - tgf -β1轴可能参与了PH与肺纤维化的发病机制。此外,正如最近的综述所述,MMP系统功能受损也与PH和肺纤维化有关[22,23].Tchougounova等.[6]表明,乳糜酶在激活非活性的前mmp -2和-9中起关键作用。在此基础上,我们成功地证明了乳糜酶抑制导致动物肺中MMP-2含量显著下降,这表明乳糜酶-MMP-2轴在与PF相关的PH发育中发挥作用。
结论
最后,我们的研究表明,抑制与肺纤维化博来霉素动物模型相关的ChyMase抑制pH。有益的生理和形态学作用与TGF-β1和MMP-2的水平减少有关,降低ET-1 / BIG-ET-1比例,并预防大肠杆菌诱导的肺动脉血管收缩。最后,IPAH和IPF肺中的胶酶表达肥大细胞的突出积累,它们的存在与具有标记的TGF-β1表达的区域紧密相连,表明动物模型结果对人类情况的相关性。作为结论,ChyMase在pH与肺纤维化相关的pH中起作用,因此可能代表未来有前途的治疗选择。虽然许多年前在肺血管疾病中描述了MCS和增加的冠血酶表达增加,但我们的研究提供了有用和新的关于该调解员对发病机制的贡献,而不仅是与肺纤维化的pH值,而且是pH值通常,由于许多病理特征确实在不同的pH类型之间共享[47,48].
致谢
我们感谢Christina Vroom和Ewa Bieniek提供的宝贵技术援助,我们感谢Andreas Günther教授小组的Stefanie Hezel和Ingrid Henneke在博莱霉素应用方面提供的不可或缺的技术援助(所有人:吉森和马尔堡大学肺中心(UGMLC),德国肺研究中心成员,吉森,德国)。我们还感谢维也纳大学(奥地利维也纳)的Walter Klepetko提供的人体肺组织,以及Actelion制药有限公司(瑞士Allschwill)的Pauline Loriette-Steiner提供的宝贵技术援助离体研究。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com.
支持声明:本研究由TI Pharma Grant提供资金。本文的资助信息已存入乐趣.
利益冲突:无声明。
- 收到了2015年2月2日。
- 接受2015年4月9日。
- 版权©2015人队