文摘gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症是最广泛认可的遗传性疾病导致慢性阻塞性肺病(COPD)。突变ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶表达式之前也被证明与胞内蛋白酶抑制剂的积累和聚合。随后,这被描述成为一个夸张的内质网应激反应和增强核factor-κB信号。然而,是否monocyte-derived巨噬细胞显示相同的特性仍然未知。gydF4y2Ba
单核细胞从纯合子拨弦αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症患者和皮姆控制培养6天的granulocyte-macrophage或巨噬细胞集落刺激因子获得支持和抗炎巨噬细胞(分别mφ-1和mφ-2)。gydF4y2Ba
我们第一次表明,单核细胞相比,预应力mφ-1和mφ-2健康献血者显示一个增强内质网应激反应在脂多糖触发(gydF4y2BaXBP1gydF4y2Ba拼接,gydF4y2Ba切gydF4y2Ba,gydF4y2BaGADD34gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRP78gydF4y2Ba信使rna)。然而,这内质网应激反应之间没有差别monocyte-derived ZZ患者巨噬细胞和单核细胞相比,MM控制。此外,这些ZZ细胞分泌细胞因子水平较高,而αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物并非由ELISA检测。gydF4y2Ba
这些数据表明,monocyte-derived巨噬细胞不是Zα的当地来源gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物中发现肺癌和内质网应激和炎性细胞因子释放不改变。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
没有证据表明聚合物的形成和单核吞噬细胞的过度炎症反应AATD患者gydF4y2Bahttp://ow.ly/A0vTYgydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶是一个重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,保护肺组织破坏作用的丝氨酸蛋白酶,如中性粒细胞弹性蛋白酶,蛋白酶3和组织蛋白酶G,布满中性粒细胞释放。此外,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶被认为显示抗炎活动包括细胞因子抑制(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),抑制细胞外signal-regulated蛋白激酶(ERK) 1/2gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和CD14表达的调控gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。虽然αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶主要是在肝脏合成,先前的研究表明,它也可以产生局部肺上皮细胞,肺泡巨噬细胞和树突细胞(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
α的Z突变(E342K)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶包括α> 95%的突变导致严重gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症。由于这种突变,ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶不正确折叠,导致聚合物的形成,积累周期acid-Schiff阳性的夹杂物在肝细胞的内质网(ER) (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。这种有毒的功能在肝脏引起肝硬化和随之而来的等离子体不足会导致肺癌和protease-antiprotease失衡,因此,早发性肺肺气肿(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。聚合物的ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶已确定在肺灌洗gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)和显示炎性属性可能会加剧炎症和肺损伤(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),特别是在吸烟ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶纯合体。米gydF4y2BaulgrewgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)表明,ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物仍然可以发现在肝移植后肺灌洗10年,建议当地分泌和Zα的聚合gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶在肺内。然而,即使是十年之后,这些聚合物的来源尚不清楚。gydF4y2Ba
ER是分泌和膜蛋白质折叠和其质量控制系统确保只有正确折叠的蛋白质退出分泌或集成到细胞的细胞器膜。ER展开或错误折叠蛋白质的积累导致“ER应激”,从而激活细胞内信号转导途径统称为展开的蛋白质反应(UPR) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。这个复杂的细胞反应的目的是维持体内平衡,最初通过减少新合成蛋白质的涌入到内质网腔,随后通过提高蛋白质折叠的能力。细胞也会增加表达的蛋白质ER-associated蛋白质降解(ERAD)途径消除晚期错误折叠的蛋白质(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。此外,UPR不仅协调ER内稳态,它也被证明参与ER应激抑制核转录因子(NF) -κB激活(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。例如,x - box结合蛋白1 (XBP1)的一个关键调制器UPR可以控制生产白介素(IL) 6和interferon-β在b细胞和巨噬细胞,分别为(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
错误折叠单体的ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶降解主要是ERAD同时聚合物是通过自噬gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。有趣的是,这并不是细胞内激活UPR overexpressing ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。然而,它主要细胞夸张ER应激反应在“第二次打击”,可能由于受损的蛋白质内流动造成的ERαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。除了加强对ER应激的敏感性,Zα细胞表达gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶还显示一个增广NF-κB响应与随后的细胞因子分泌增加(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。在第二次打击,如暴露在脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子(TNF) -α,这种炎症反应进一步增加(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
外周血单核细胞的前体是不同子集的肺巨噬细胞,包括肺泡巨噬细胞,增加的慢性肺部疾病,如慢性阻塞性肺疾病(COPD) (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)和相关的发病机制和疾病严重程度的条件(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。在健康的肺,肺泡巨噬细胞是免疫抑制抗原递呈能力较差,但是不同的巨噬细胞表型可以开发当单核细胞暴露于不同的环境信号(微)(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。主要基于gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba人类monocyte-derived巨噬细胞的研究开发,已确定不同的巨噬细胞的细胞亚群。例如,人类单核细胞集落刺激因子暴露的经典途径激活巨噬细胞分化,导致炎性I型(mφ-1)巨噬细胞释放促炎细胞因子,促进辅助1响应(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。另一方面,抗炎II型(mφ-2)巨噬细胞(也称为或者激活巨噬细胞)可以从人类单核细胞巨噬细胞集落刺激因子,il - 10的特点是生产,t调节细胞的诱导和凋亡细胞的吞噬作用gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。然而,最近的研究表明改变肺泡巨噬细胞分化与一个“中间表型”和慢性阻塞性肺病患者受损的吞噬作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
CgydF4y2BaarrollgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba之前显示细胞内积累的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶和随后的激活UPR在单核细胞从纯合子ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症患者。因为我们以前所示微分αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba由不同的巨噬细胞抗胰蛋白酶生产子集(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),我们来测试假设mφ-1巨噬细胞能够产生ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物。此外,我们假设这个子集有助于增强炎症由于UPR和增加NF-κB激活的激活。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
主题gydF4y2Ba
ZZ的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症患者稳定没有任何恶化的迹象。这些患者的特点可以在表中找到gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。控制MM受试者无症状没有任何疾病的证据或呼吸道疾病的(家庭)历史和/或过敏。他们aged-matched ZZ的病人,都是不吸烟者和有一个MM基因型所证实的逆转录酶聚合酶链反应(RT) (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。个人给书面知情同意参加本研究,医学伦理委员会批准的莱顿大学医学中心(荷兰莱顿)。gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
从新鲜血液单核细胞和分化成mφ-1或mφ-2如前所述[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba单核细胞)或直接使用。单核细胞和monocyte-derived巨噬细胞与100 nM pre-incubated thapsigargin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h和刺激100 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba有限合伙人(Sigma-Aldrich) 4小时或24小时表示。24小时后没有观察到细胞的减少可行性thapsigargin治疗相比control-treated细胞通过台盼蓝排斥(数据没有显示)。gydF4y2Ba
ELISAgydF4y2Ba
道达尔和聚合生成αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶测定细胞上清液通过ELISA如前所述[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),表示每毫克的完整的细胞溶解产物在细胞数量和/或纠正差异溶解产物。细胞内水平测定使用完整的细胞溶解产物。聚合物检测极限为3.0 ng·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba总溶解产物。引发、il - 10和IL12p40测量如前所述[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
免疫印迹分析如前所述[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。简单、样品分离丙烯酰胺重量/体积10% sds - page凝胶。蛋白质检测与特定主要抗体phosphorylated-ERK1/2,总ERK1/2和GAPDH(所有细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。GRP78、GRP94在观想通过使用单克隆抗体对KDEL-sequence(恩佐生命科学、Raamsdonksveer、荷兰)。虽然单核细胞被播种在同一密度monocyte-derived巨噬细胞、单核细胞的蛋白质含量过低进行免疫印迹分析。gydF4y2Ba
定量rt - pcrgydF4y2Ba
使用麦克斯韦RNA提取RNA分离(WI Promega,麦迪逊,美国)根据制造商的指示。如前所述(执行定量聚合酶链反应gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)与引物对如表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
结果表示为个人捐助者(每个点是一个捐助者),除非另有说明。数据分析使用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)并与双向重复测量方差分析和BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba分析。被认为具有统计显著性差异p < 0.05。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
单核细胞和巨噬细胞monocyte-derived经历ER应激显示一个夸张的反应在有限合伙人gydF4y2Ba
Thapsigargin抑制sarcoendoplasmic网钙atp酶,从而释放出CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba商店从ER和诱导NF-κB UPR和激活的gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。确认低级ER应激会导致夸张UPR在第二个打击在单核细胞和monocytes-derived巨噬细胞,我们从MM捐助者与预处理的这些细胞隔离thapsigargin 1 h,以及随后与LPS刺激4 h或24 h。正如所料,thapsigargin显著增加gydF4y2Ba切gydF4y2Ba,gydF4y2BaGRP78gydF4y2Ba信使rna的拼接gydF4y2BaXBP1gydF4y2Ba信使rna,在所有类型的细胞在4 h和24小时(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。相比之下,gydF4y2BaGADD34gydF4y2Ba信使rna水平保持不变。这种反应慢于单核细胞mφ-1和mφ-2相比,因为的水平gydF4y2Ba切gydF4y2Ba和gydF4y2Ba拼接XBP1gydF4y2Ba信使rna在显著降低4 h,明显高于在24 h (p < 0.01) (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba)。LPS诱导显著更高水平的所有四个UPR基因mφ-1和mφ-2 4 h (gydF4y2Ba拼接XBP1gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRP78gydF4y2Ba信使rna)或24小时(gydF4y2Ba切gydF4y2Ba和gydF4y2BaGADD34gydF4y2Ba信使rna)。gydF4y2Ba
内质网应激反应后脂多糖(LPS)治疗4 h (a、c、e, g)或24小时(b、d、f、h)毫米单核细胞和毫米monocyte-derived巨噬细胞内质网应激。a、b)单核细胞(Mono)和巨噬细胞I型(mφ-1)和II型(mφ-2)与thapsigargin pre-incubated (Tg)治疗1后面h有限合伙人表示。的拼接gydF4y2BaXBP1gydF4y2Ba信使rna与定量测量反向transcriptase-PCR,正常化gydF4y2BaATP5BgydF4y2Ba和gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba信使rna。碳氢键)细胞被视为前和c, d)gydF4y2Ba切gydF4y2Ba、e、f)gydF4y2BaGADD34gydF4y2Bah和g)gydF4y2BaGRP78gydF4y2Ba信使rna进行了测量。所有值正常化看家基因gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaATP5BgydF4y2Ba。* *:*:p < 0.05, p < 0.01, * * *: p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba未经处理的双向重复测量方差分析(BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
接下来,我们验证这是否增加ER应激反应伴随着NF-κB反应的增加。基础的水平gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba和gydF4y2BaIL8gydF4y2Ba信使rna在单核细胞显著高于mφ-1和mφ-2(相比gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)。有限合伙人显著增加gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba和gydF4y2BaIL8gydF4y2Ba信使rna在单核细胞4 h,但不是在mφ-1或mφ-2。值得注意的是,mφ-1 mφ-2经历ER应激并显示增强gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba4 h后mRNA水平有限合伙人治疗(p < 0.001),而在单核细胞实际上这个水平降低(p < 0.05) (gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba)。24小时后没有观察到的差异了。gydF4y2Ba
炎症反应后,c, e) 4 h或b, d, f) 24小时脂多糖(LPS)治疗MM单核细胞和MM monocyte-derived巨噬细胞内质网应激。被视为图f)细胞gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba德国产业投资银行gydF4y2Ba,gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba和gydF4y2Ba引发gydF4y2Ba信使rna进行了测量。胃肠道)Pre-incubated细胞thapsigargin (Tg;1 h)受到24小时有限合伙人治疗和g)白介素(IL) -10年,h) IL-12p40和我)引发细胞因子释放由ELISA测定细胞上清液。所有看家基因mRNA值正常化gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaATP5BgydF4y2Ba。Mono:单核细胞;mφ-1:巨噬细胞I型;mφ-2:巨噬细胞II型*:p < 0.05, * *: p < 0.01, * * *: p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba未经处理的双向重复测量方差分析(BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
最后,这些数据表明monocyte-derived巨噬细胞显示一个夸张的ER应激反应和NF-κB响应在第二个打击经历ER应激时,这种现象不是单核细胞中观察到。gydF4y2Ba
单核细胞和巨噬细胞monocyte-derived ZZ患者缺乏探测聚合物的生产gydF4y2Ba
已经知道了很长一段时间,单核细胞(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)和(monocyte-derived)巨噬细胞产生αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。然而,它仍然未知是否巨噬细胞从ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶病人(ZZ细胞)Zα的来源gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物中发现的肺和经验夸张ER应激反应。因此,我们首先证实了我们之前的发现(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba],促炎mφ-1巨噬细胞分泌更多的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶相比,抗炎mφ-2巨噬细胞在毫米和ZZ细胞(p < 0.001) (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。正如所料,α的水平gydF4y2Ba1gydF4y2Ba细胞上清液的抗胰蛋白酶MM细胞相比高出五倍ZZ的浮在表面的细胞。在某种程度上,这可能只有Zα细胞内保留的解释gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba),并非由于缺乏gydF4y2BaSERPINA1gydF4y2Ba信使rna编码αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。生产的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶mφ-1和mφ-2增加24小时有限合伙人治疗后(分别p < 0.05和p < 0.01) (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)。当我们使用了2 c1单克隆抗体专门检测天然αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物,我们无法探测到ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物在任何细胞类型(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba),而肝匀浆从肝硬化肝脏ZZ透露积累Z聚合物(数据未显示)。来验证这是否由于其分化,我们评估总αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶和聚合物生产的单核细胞来自同一个捐赠者。如果单核细胞释放等量的总αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶以mφ-2相比细胞上清液(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba),没有明显上调总αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶LPS处理后生产。有趣的是,细胞内的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶水平显著高于在毫米和ZZ单核细胞相比,赞成或抗炎巨噬细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。然而,聚合物含量检测细胞上清液和完整的细胞溶解产物ZZ单核细胞(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶(AAT)生产monocyte-derived ZZ患者巨噬细胞和MM控制。总AAT)和AAT聚合物生产用细胞上清液单核细胞(Mono)和巨噬细胞I型(mφ-1)和II型(mφ-2)24 h后的脂多糖(LPS)治疗。b)总AAT和AAT聚合物水平在整个细胞溶解产物以细胞单核细胞的上清液,和mφ-1 mφ-2 24 h后的有限合伙人的待遇。c)细胞(a)和治疗gydF4y2BaSERPINA1gydF4y2Ba信使rna进行了测量。所有看家基因mRNA值正常化gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaATP5BgydF4y2Ba。gydF4y2BansgydF4y2Ba:不重要的;* *:*:p < 0.05, p < 0.01, * * *: p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba未经处理的双向重复测量方差分析(BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
没有证据的激活的蛋白质反应ZZ monocyte-derived巨噬细胞和单核细胞gydF4y2Ba
它已经表明,Zα的过度gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶水平,导致其聚合导致夸张ER应激反应在第二次打击(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),而单体的Zα的存在gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶还不足以触发UPR在主支气管上皮细胞(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。CgydF4y2BaarrollgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]显示略有提高UPR在休息ZZ单核细胞在细胞内积累ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶。然而,这个保留Zα的构象gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶仍不清楚。因此,要检查是否我们的ZZ单核细胞和ZZ monocyte-derived巨噬细胞ER应激增加经验,我们调查了几个UPR目标基因的表达;gydF4y2Ba切gydF4y2Ba,gydF4y2BaGADD34gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRP78gydF4y2Ba的拼接gydF4y2BaXBP1gydF4y2Ba信使rna。在休眠细胞,没有证据表明增加ZZ细胞ER应激反应相比,MM细胞(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba)。此外,在基底的旁边gydF4y2BaGADD34gydF4y2BamRNA水平,升高在单核细胞,没有显著差异的基础表达最UPR单核细胞之间的基因,mφ-1 mφ-2,表明单核细胞分化成巨噬细胞并不改变应力状态(无花果gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)。接下来,一个增强的α的影响进行调查gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶生产这些细胞与LPS刺激。24小时后,从Z mφ-2αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶患者有显著提高GADD34 mRNA (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BadgydF4y2Ba)。然而,这种差异不能被发现在单核细胞(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BahgydF4y2Ba)。与先前的研究[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba),有限合伙人显著增加gydF4y2Ba切gydF4y2Ba和gydF4y2BaGADD34gydF4y2Ba信使rna水平的拼接gydF4y2BaXBP1gydF4y2Ba信使rna。gydF4y2Ba
没有夸张的内质网应激反应在单核细胞和monocyte-derived ZZ患者巨噬细胞相比,MM控制。模拟)的mRNA水平巨噬细胞I型(mφ-1)和II型(mφ-2)内质网应激基因拼接gydF4y2BaXBP1gydF4y2Ba,b)gydF4y2BaGRP78gydF4y2Bac)gydF4y2Ba切gydF4y2Ba和d)gydF4y2BaGADD34gydF4y2Ba经过24小时的脂多糖(LPS)治疗定量衡量反向transcriptase-PCR。超高频)单核细胞(Mono)治疗和接受分析(模拟)。i, j)代表免疫印迹GRP94和GRP78使用anti-KDEL抗体。Monocyte-derived巨噬细胞被视为(模拟)。为微n = 4。所有看家基因mRNA值正常化gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaATP5BgydF4y2Ba。兵:细胞外signal-regulated蛋白激酶。* *:*:p < 0.05, p < 0.01gydF4y2Ba与gydF4y2Ba未经处理的双向重复测量方差分析(BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
当我们评估GRP78蛋白水平通过免疫印迹,我们无法检测其mφ-2增加(gydF4y2Ba图4我gydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba)。事实上,这些水平似乎低ZZ巨噬细胞(巨噬细胞相比,毫米gydF4y2Ba图4我gydF4y2Ba和gydF4y2BajgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
生产ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶monocyte-derived巨噬细胞并不改变NF-κB信号gydF4y2Ba
之前有研究表明,单节的Zα的存在gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶与增强NF-κB反应在上皮细胞,即使没有聚合物和夸张ER应激反应(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。然而,目前,单核细胞的数据不一致(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba巨噬细胞)和数据是缺乏。因此,我们首先测量IL-12p40的释放,il - 10和引发有限合伙人有或没有治疗。如图所示之前,确认适当的分化macrophage-subsets [gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba],mφ-1产生更多IL-12p40相比mφ-2后24 h(有限合伙人,而mφ-2产生il - 10 (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba)。引发释放没有差别。然而,与我们的预期相反,MM巨噬细胞产生增强这三种细胞因子水平与ZZ巨噬细胞后24 h有限合伙人(p < 0.01) (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba)。没有明显差异观察休息毫米和ZZ细胞之间的细胞因子。gydF4y2Ba
没有增加单核细胞炎症反应和monocyte-derived ZZ患者巨噬细胞相比,MM控制。白介素(IL) -10, b) IL-12p40和c)引发释放巨噬细胞I型(mφ-1)和II型(mφ-2)24 h后的脂多糖(LPS)治疗用ELISA。信使rna水平d)gydF4y2Ba德国产业投资银行gydF4y2Ba和e)gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Bamφ-1和mφ-2视为(a - c)。f, g)代表免疫印迹的活化增殖蛋白激酶细胞外signal-regulated蛋白激酶(ERK) 1/2的完整的细胞溶解产物mφ-1和mφ-2视为(a - c)。为微n = 4。h)引发,我)gydF4y2Ba德国产业投资银行gydF4y2Ba信使rna和j)gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba信使rna释放单核细胞(Mono)视为(a - c)。所有看家基因mRNA值正常化gydF4y2BaACTBgydF4y2Ba和gydF4y2BaATP5BgydF4y2Ba。p:磷酸化。* *:*:p < 0.05, p < 0.01, * * *: p < 0.001gydF4y2Ba与gydF4y2Ba未经处理的双向重复测量方差分析(BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
来验证这是否不同细胞因子释放是由于增加NF-κB或ERK1/2信号,我们测量gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba信使rna (gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba和gydF4y2BaegydF4y2Ba)和磷酸化ERK1/2 (gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba和gydF4y2BaggydF4y2Ba)。我们无法发现任何差异,基底或之后24 h(有限合伙人)gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba信使rna或磷酸化ERK1/2毫米和ZZ巨噬细胞之间。然而,mφ-2显示更高水平的ERK1/2相比,休眠细胞磷酸化mφ-1 (gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba和gydF4y2BaggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
再一次,以确保单核细胞分化成巨噬细胞没有影响我们的结果,我们决定gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba和gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba信使rna和引发的释放(gydF4y2Ba图5 hgydF4y2Ba和gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。gydF4y2BaIκBgydF4y2Ba信使rna在毫米ZZ相比,单核细胞单核细胞高。虽然不重要,这也是观察引发的细胞上清液(gydF4y2Ba图5 hgydF4y2Ba和gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。这些结果表明,单核细胞分化成巨噬细胞不会改变行为的MM或ZZ细胞有关的参数测量。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
被发现后ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合物肺灌洗的ZZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症患者接受了肝脏移植10年前(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),寻找负责任的细胞类型出现。它最近表明,主支气管上皮细胞的ZZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症患者不太可能的来源聚合物(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。在这项研究中,聚合物也没有检测到的单核细胞和巨噬细胞monocyte-derived ZZ的病人。此外,结果表明,这些细胞没有表现出夸大的ER应激或增加NF-κB应对第二次触发,如有限合伙人。gydF4y2Ba
有趣的是,我们最近发现,休息ZZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶主支气管上皮细胞显示增加NF-κB激活即使没有检测到聚合物,没有夸张的ER应激反应(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。这种增强NF-κB反应这些细胞被这些无法解释产生大量的ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba由这些细胞抗胰蛋白酶抑制ERK1/2磷酸化gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba表皮生长因子受体(EGFR) [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。据报道,单核细胞缺乏实质性的表皮生长因子受体(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),这或许可以解释为什么我们无法检测到增加NF-κB反应ZZ monocyte-derived巨噬细胞和单核细胞。这是符合的结果gydF4y2BaldonytegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),显示低TNF-α释放ZZ的单核细胞。然而,CgydF4y2BaarrollgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)进行了类似的研究比较从外周血单核细胞分离MM和ZZ的个人,他们确实发现不同的释放il - 6,引发和il - 10。我们不能排除不同处理之间的单核细胞和隔离我们的研究和CgydF4y2BaarrollgydF4y2Ba等gydF4y2Ba。(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba解释了不同的结果。细胞因子释放的增加发现CgydF4y2BaarrollgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)是伴随着Zα的积累gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶的ER内未知的构象,并夸张ER应激反应。gydF4y2Ba
我们也发现了细胞内保留Z a1-antitrypsin (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba),因为的比率gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶以整个细胞溶解产物gydF4y2Ba与gydF4y2BaZZ的上层清液较高(3.5:1的比例)相比,MM细胞(比例1:1)。需要指出的是,这些比率可能并不准确尤其是ZZ细胞,因为αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶水平测量接近的ELISA检测极限。虽然我们获得初步的证据增加α的保留gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶ZZ细胞,这并不完全解释分泌α的差异gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶毫米和ZZ细胞之间。这个结论是基于观察α的总量gydF4y2Ba1gydF4y2Ba产生抗胰蛋白酶(笔完整的细胞溶解产物和上层清液)是在ZZ低于MM细胞(数据未显示)。这将是有趣的调查是否剩余的MM和ZZ细胞之间的区别可以解释Zα的退化gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶gydF4y2Ba通过gydF4y2BaERAD把这些细胞的蛋白酶体抑制剂。gydF4y2Ba
以前,我们已经确定的临界浓度Z ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶可能形成聚合物,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba300 ng·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba总溶解产物蛋白(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。在这项研究中,单核细胞和巨噬细胞monocyte-derived没有达到这个浓度(最多30 ng·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba总由MM细胞溶解产物蛋白质),这可以解释为什么我们无法检测2 c1-positive聚合物细胞内或细胞上清液。值得注意的是这个关键Z浓度在不同的上皮细胞系建立了。目前,我们不能排除这种可能性,这个浓度可能会降低在单核细胞谱系。我们考虑的可能性2 c1单克隆抗体用于本研究不太敏感的比其他使用的多克隆抗体ATZ11 [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba),这就可以解释我们不能检测Z聚合物。然而,当我们评估绑定两个抗体的特点,我们发现这两个抗体同样绑定到Z聚合物,但是多克隆抗体ATZ11也绑定到Z单体(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。即使很低水平的Zα1-antitrypsin聚合物是由单核细胞内,它不太可能影响细胞功能,因为我们无法检测ER应激反应改变作为polymer-expressing细胞(我们之前所做的gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
据我们所知,这是第一个研究直接比较单核细胞和monocyte-derived ZZ患者巨噬细胞ER应激反应和MM控制和二次引发像有限合伙人。在我们看来,重要的是,我们有这些子集相比,因为它不仅排除了可能性,我们的发现在monocyte-derived巨噬细胞可能是改变他们的行为而区分,但也揭示了未知的差异这些子集炎症标记物的表达gydF4y2Ba首席财务官gydF4y2Ba和gydF4y2BaIL8gydF4y2Ba信使rna,引发的分泌il - 10和IL-12p40。这些差异背后的细胞机制及其生物学意义是很重要的问题需要解决,但超出了本研究的范围。gydF4y2Ba
尽管monocyte-derived巨噬细胞一般来说是一个好的模型来研究巨噬细胞行为,之前的研究表明,这些细胞的子集gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba可能并不总是代表肺泡巨噬细胞gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。因此,理论上仍有可能肺泡巨噬细胞的肺内的聚合物gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,虽然由毫米肺泡巨噬细胞分泌水平比得上monocyte-derived巨噬细胞和单核细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。然而,需要指出的是,之间的显著差异存在于肺泡巨噬细胞的特点没有慢性阻塞性肺病患者gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。例如,慢性阻塞性肺病患者肺泡巨噬细胞已被证明无法有效地摄取微生物和细胞凋亡。有趣的是,这种无能的慢性阻塞性肺病细胞已经出现在monocyte-derived巨噬细胞从慢性阻塞性肺病患者的外周血中获得。这不仅验证这些细胞的使用gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba但也说明了定义的复杂性最终的肺泡巨噬细胞表型。未来的研究与肺泡巨噬细胞从支气管肺泡灌洗的ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症患者将有助于更好地理解在Zα巨噬细胞的作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶缺乏症gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
综上所述,本研究扩展了我们理解当前视图的ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶聚合、夸张的ER应激反应和NF-κB信号由所有细胞类型表达ZαgydF4y2Ba1gydF4y2Ba抗胰蛋白酶。然而,需要做更多的研究来完全理解这些现象的潜在机制。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
支持的支持声明:本研究从荷兰哮喘基金会的资助(批准号3.2.08.0032)。E.F.A.范不Wout是一个欧洲Alpha-1-Antitrypsin Laurell受奖者的培训(由Grifols,巴塞罗那,西班牙)。D.A. Lomas由英国医学研究理事会(英国伦敦)和NIHR UCLH生物医学研究中心(伦敦)。是中华民国Marciniak博士审查临床医学研究委员会高级研究员(批准号G1002610)。gydF4y2Ba
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2014年3月10日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2014年7月21日。gydF4y2Ba
- 版权©2015人队gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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