文摘
肺动脉高压与高死亡率仍然是一个严重的临床问题。雌激素是一个潜在的肺循环血管舒张,本研究调查了17β-oestradiol机制提高了野百合碱(MCT)全身的肺动脉高压。
女性Sprague-Dawley老鼠进行了双边卵巢切除术或虚假的操作。老鼠收到MCT (50 mg·公斤−1),治疗17β-oestradiol·(1毫克公斤−1每天)5周或只从周4周5。等离子体17β-oestradiol sham-operated浓度降低,MCT-treated老鼠相比,sham-operated老鼠(17.7±4.7与50.3±15.4 pg·毫升−1;p = 0.029)。17β-oestradiol合成代谢酶细胞色素P450 (CYP) -19年减少了MCT治疗,而降解酶CYP-1A1和1 b1增加。和MCT-treated老鼠的骨质有更严重的肺动脉高压。17β-oestradiol抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和巨噬细胞浸润,和增强细胞凋亡增加一氧化氮(NO)和内皮(前列腺素(PG)我2),减少内皮素(ET)水平1的水平。Phosphoinositide-3-kinase (PI3K)和一种蛋白激酶磷酸化明显增加,但都被17β-oestradiol治疗大鼠肺动脉高压。
雌激素缺乏可能加重肺动脉高压的发展。17β-oestradiol改善肺动脉高压通过PI3K / Akt通路的激活规范不,PGI2和ET-1表达式。
肺动脉高压(PH)是一个进步的障碍,预后很差。它的特点是提高肺动脉压(PAP)和右心室肥大(RVH) [1]。PH值包括内皮损伤的病理变化,肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和炎症细胞的迁移。目前,没有理想药理代理人逆向先进的PH值。
性激素,特别是(17β-oestradiol雌二醇(E2PH值),似乎改善实验(2,3]。E2转换从睾丸激素的细胞色素P450 (CYP) -19酶,芳香化酶。E2随后被转化为多个代谢产物通过几个途径,CYP-1A1和CYP-1B1分解代谢的关键酶(3]。实验研究使用一种慢性缺氧或野百合碱(MCT)全身的PH值模型一直证明管理E2发挥保护作用对PH值的发展(2,3]。一氧化氮(NO)、内皮(前列腺素(PG)我2)和endothelin-1 (ET-1)是关键血管活性的介质和PH患者的治疗目标4]。在肺动脉内皮细胞,雌激素强烈刺激没有并没有合酶(NOS)发布5,6]。雌激素上调PGI2在绵羊的胎儿肺动脉内皮细胞和人类脐静脉内皮细胞,和雌激素受体(ER) -β已被证明调解环氧合酶(COX) 2表达在人类胎盘绒毛状内皮细胞(7- - - - - -9]。最近的一项研究表明,雌激素变弱诱导肺ET-1基因表达在成年雌性大鼠的肺组织2]。然而,血浆E2的浓度,E的变化2新陈代谢酶和E的机制2提高了PH值尚未阐明。
在目前的研究中,我们检测血浆E2的浓度,E的变化2新陈代谢酶和雌激素受体,E的影响2在不,内皮NOS(以挪士),PGI2cox - 2, ET-1 endothelin-converting酶(ECE)表达式,在肺细胞增殖,凋亡和炎症。我们也调查了是否E2PH值的发展缺乏是一个有影响力的因素。
方法
动物模型
女性Sprague-Dawley老鼠(180 - 200克)是上海实验动物委员会提供的实验动物中心(上海,中国)。所有程序都是根据协议执行机构委员会批准使用和护理实验室动物的同济大学(中国上海)和指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版8523年修订1996年)。老鼠被随机分为以下八个组每组(n = 12) (图1):1)sham-operated saline-treated车辆(植物油)组(S);2)sham-operated MCT-treated汽车集团(S + M);3)sham-operated MCT-treated、慢性E2预处理(预防性治疗)组(S + M + E (P));4)sham-operated MCT-treated、急性E2治疗组(S + M + E (T));5)实施,saline-treated汽车集团(O);6)骨质,MCT-treated汽车集团(O + M);7)骨质、MCT-treated、慢性E2预处理(预防性治疗)组(O + M + E (P));8)骨质,MCT-treated急性E2治疗组(O + M + E (T))。
老鼠犀牛有60 mg·公斤−1戊巴比妥钠(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)由于腹腔内,和双边卵巢切除术或虚假的操作执行。1周后恢复期,老鼠收到一个皮下注射MCT(50毫克公斤−1;σ,成都,中国)或0.9%生理盐水在同一卷的MCT注入。在S + M + E (P)和O + M + E (P)组,动物治疗5周与E2(1毫克公斤−1每天;σ),开始的那天MCT注入。在S + M + E (T)和O + M + E (T)组,老鼠收到车辆直到MCT注射后4周,然后被处理E2(1毫克公斤−1在周5每天)。其他组收到特定车辆5周后或生理盐水注入。在星期5,老鼠牺牲和血浆和肺组织收获和储存在-80°C到使用。
血液动力学的分析
老鼠犀牛和气管切开术后执行,聚乙烯导管连接到压力传感器是正确插入到颈外静脉和线程进入右心室及肺动脉测量右心室收缩压(RVSP)和平均PAP(肺动脉平均)通过测谎仪系统(电力实验室8/30;广告工具,悉尼,澳大利亚)。另一个测谎仪导管插入左侧颈动脉测量心输出量(CO)热稀释法。肺血管阻力(PVR)是使用以下公式计算:PVR =肺动脉平均/ CO。
右心室肥大的评估
右心室(RV)自由墙从左心室解剖隔(LV + S),体重分别。RVH的程度是由重量比率RV / (LV + S)和房车(mg) /体重(BW) (g)。
测量血浆E2浓度
血浆样本收集后血液动力学的分析。等离子体电子2在重复使用浓度测定雌二醇环评工具包(开曼化学公司,安阿伯市,美国)(10]。
组织学分析和形态测量学
血液动力学的测量后,肺组织形态学分析准备使用钡注入方法(11]。的形态学分析与外部肺动脉直径50 - 100μm。内侧壁厚是由以下公式计算:内侧厚度(%)=内侧壁厚/外部直径×100。定量分析,30船只从每个鼠数和平均计算。在80×400放大,肺小血管的每只动物从10到50μm外径进行评估muscularisation [12]。
增殖细胞评估细胞增殖核抗原(PCNA)染色(Dako)和终端原位凋亡细胞的脱氧尿苷三磷酸尼克end-labelling (TUNEL)方法(细胞凋亡检测设备;Wako)。炎症细胞被ED-1评估(CD68的模拟)染色(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。PCNA和TUNEL-positive细胞的数量在10个领域,对于每一个部分,是定量评价细胞总数的百分比,在放大×400,盲目的方式(13]。ED-1-positive细胞的数量在30场数(14]。
试验生产的肺
格里斯没有生产细胞测量的方法,指出在没有分析工具包(Beyotime生物技术有限公司、江苏、中国)。亚硝酸盐水平纠正了蛋白质测量和数据显示的比例控制的水平。
测量肺PGI2浓度
肺PGI的数量2生产、计算稳定的浓度水解产品6-keto-prostaglandin (6 - pg) F1α内皮决心在重复使用环评工具包(美国纽约恩佐生命科学,法明岱尔)(8]。
测量肺ET-1浓度
肺ET-1浓度测定在重复Endothelin-1环评工具包(恩佐生命科学)15]。
免疫印迹分析
肺细胞溶解在×1钠十二烷基硫酸盐(SDS)补充蛋白酶抑制剂在1:25的稀释。30μg蛋白质的溶解产物在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和transblotted到聚偏二氟乙烯膜90分钟的270毫安。5%脱脂奶的膜被封锁Tris-buffered盐水(TBS)和0.1%渐变(TBS /渐变)1 h与温柔的摇摆,在室温下然后孵化主要抗体在一夜之间在4°C。后三个洗TBS /渐变,膜与二次孵化anti-mouse /山羊抗体(1:20 00)1 h在室温下。蛋白质的水平被β-actin强度正常化。
统计分析
来自多个实验的数据表示为±手段扫描电镜。数据被t分析或方差分析。显著差异检测时,个人的平均值进行比较事后测试(Bonferroni调整),允许多个比较。在适当的地方,克鲁斯卡尔-沃利斯排名进行方差分析的非参数数据。的假定值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
改善血流动力学参数和RVH MCT-induced PH值由E2
MCT-treated组肺血液动力学的评估表明,发达国家严重的PH值,与RVSP增加,肺动脉平均,PVR, RV / (LV + S)重量比和RV / BW比率,和减少公司与sham-operated或骨质组(图2 f)。的骨质,有趣的是,MCT-treated (O + M)大鼠表现出更高的RVSP PVR和更低的公司与sham-operated相比,MCT-treated (S + M)大鼠(图2 a, c和d)。
慢性预处理组,E2显著减毒的海拔RVSP、肺动脉平均PVR, RV / (LV + S)重量比和RV / BW sham-operated比率,MCT-treated和E2(预处理)(S + M + E (P))老鼠,也减少了PVR的骨质,MCT-treated和E2(预处理)(O + M + E (P))的老鼠相比,MCT-treated老鼠没有E2(图2 a、b d-f)。在这些组,E2也显著增强公司在S + M + E (P)老鼠和O + M + E (P)大鼠(图2 c)。
在急性治疗组,E2减少PVR和增加CO sham-operated MCT-treated和E2(治疗)大鼠(S + M + E (T))和骨质,MCT-treated和E2(治疗)(O + M + E (T))的老鼠相比,MCT-treated老鼠没有E2(图2 c和d)。
等离子体电子2浓度,雌激素受体和CYP19表达式,CYP1A1和CYP1B1肺
等离子体电子2浓度显著降低在S + M的老鼠相比,老鼠(图4)。几乎没有E2在O + M O老鼠或老鼠。后长期E2曝光,血浆E2浓度在S + M + E显著增加(P)老鼠和O + M + E (P)组,和老鼠都类似于S水平。后短期E2曝光,血浆E2浓度显著增加在S + M + E (T)老鼠,和类似于S老鼠水平;E2浓度也增加了O + M + E (T)组与O的老鼠相比,但却大大低于水平年代老鼠。
MCT-treated鼠肺ER-α蛋白质水平降低(图4 b和c)但ER-β蛋白质含量没有改变(图4 b和d)。肺部CYP-19蛋白质的表达明显减少了未经中华人民共和国交通部。相反,肺CYP-1A1和1 b1蛋白的表达在MCT-treated显著增加大鼠(图4 b和eg)。
逆转肺不,PGI2并通过E ET-1浓度2
在没有和PGI变化2浓度在肺所示图5 a和b。没有和PGI有明显减少2浓度MCT-treated PH老鼠与控制。值得注意的是,实施MCT-treated (O + M)大鼠显示没有和PGI的浓度要低得多2比sham-operated MCT-treated (S + M)动物。没有和PGI2水平明显增加了E2预处理和急性治疗(无花果5 a和5 b)。
MCT-treated组、肺ET-1浓度增加与控件(相比图5度)。此外,O + M的老鼠表现出更高水平的比S + M老鼠ET-1 (图5度)。预处理与E2抑制肺ET-1浓度的海拔sham-operated和骨质,MCT-treated老鼠(S + M + E (P)和O + M + E (P)组)(图5度)。急性治疗E2也显著抑制肺的表达ET-1 sham-operated和骨质,MCT-treated老鼠(S + M + E (T)和O + M + E (T)组)与MCT-treated动物(图5度)。
以挪士的逆转,cox - 2和ECE浓度由E2
以挪士和cox - 2浓度的变化在肺所示图5 d-f。以挪士和cox - 2蛋白在MCT-treated显著降低大鼠,以挪士和cox - 2蛋白水平明显增加了E2预处理(图5 d-f)。
phosphoinositide-3-kinase表达式和一种蛋白激酶磷酸化的肺
phosphoinositide-3-kinase的表达(PI3K)和一种蛋白激酶磷酸化MCT-treated组显著增加,同时明显抑制由E2治疗(图6 a - c)。
讨论
这部小说研究的发现是E2治疗改善PH值通过多种不同的途径。抑制新陈代谢enzyme-mediated E2肺部可能发挥重要作用的发病机制博士研究表明:1)血浆E2在MCT-treated老鼠浓度明显下降;2)雌激素受体和一些新陈代谢酶改变了MCT治疗;3)E2阻止了PH值和RVH的发展,抑制PASMC增殖和巨噬细胞浸润,增强PASMC凋亡,减少肺ET-1表达和增强肺没有和PGI2的表情;和4)E2可以减少PI3K / Akt激活,以起到保护作用。这些发现表明,内生雌激素缺乏可能的发病机制中扮演重要角色MCT-induced PH值,E2可能改善的进展PH值结合ER-β抑制PI3K / Akt激活规范生产ET-1, PGI吗2也没有和他们的酶。
尽管肺动脉高血压(PAH)是一种疾病,主要发生在女性(16- - - - - -17),年代hapiroet al。(16)报道,男性多环芳烃在诊断肺动脉平均和平均右心房压力较高,男性,年龄≥60岁存活率更低与女性年龄≥60岁。类似的女性优势和生存数据被报道在法国注册表(17,18]。这些数据表明,雌激素可能是保护因素。然而,雌激素暴露与多环芳烃(有关19),雌激素可能产生有害的前导和促炎效应在肺血管组织20.]。不过,有明显的证据表明,性爱是一种深刻的修饰符PAH的发病机理和生存和雌激素的潜在作用需要进一步探索。我们调查是否E2PH值的发展缺乏是一个有影响力的因素,以及其替代是否会扭转这些影响。我们评估的影响2E2缺乏和E2替换在发展MCT-treated雌性老鼠的PH值,以确定这可能提供新思路探索PH患者的治疗。
雌激素和PH值之间的关系最近文献中受到足够的关注。实验研究已经证明,E2改善PH值,但没有报告血浆E的变化2浓度MCT-treated老鼠。在这项研究中,我们发现,血浆E2浓度下降了其特定的治疗,可能会导致更少的保护作用的E2在肺动脉。可能的解释包括E的变化2新陈代谢的酶。有趣的是,我们的研究表明,CYP-19却降低了CYP-1A1和CYP-1B1增加MCT-induced博士这些代谢酶的变化是否导致异常E2浓度需要进一步确认。最近,一位贾斯廷et al。(21]表明,通过改变雌激素代谢多态性在CYP-1B1可能修改的风险家族女性的PH值BMPR2突变携带者。
E2对它的影响主要通过ER-αER-β。这两种受体亚型存在于肺。雌激素的ER-β-mediated行动最近被报道在雄性老鼠MCT-induced PH值(22]。这项研究表明,选择性ER-β受体激动剂能够拯救PH值E一样有效2,E2未能改善PH值在ER-β-selective拮抗剂。本研究的数据强烈支持E的救援行动的概念2主要是通过ER-β介导MCT-induced PH值(22]。l阿et al。(23)报道,ER抑制剂和奉献ER-αER-β-specific拮抗剂反对E的影响2;然而,他们认为的重要影响2在低氧功能的终端主要是由ER-αPH值。因此,评价ER表达PH值被认为是重要的。L的数据阿等。(23)表明,缺氧ER-β增加,但不是ER-α,肺血管表达。相反,我们的结果表明,MCT抑制ER-α,但没有影响ER-β蛋白在肺。有趣的是,MCT-regulated ER蛋白质表达并不符合缺氧。这种差异可能反映了不同的机制2信号在MCT-induced PH值较低氧诱导博士未来的研究将需要探索改变PH值的ER水平的机制。
先前的研究已经表明,E2变弱的发展实验PH值通过调查存活率和血液动力学的参数,如肺动脉平均RVSP和RV / (LV + S)重量比22,24]。然而,这些参数不全面评估的临床严重性博士RVSP和肺动脉平均不持续增加与疾病的进展和可能减少严重博士有限公司和PVR是重要的参数和更精确地反映疾病的严重程度和预后。因此,我们也评估公司和PVR在这项研究。骨质,MCT-treated老鼠更严重的PH值比sham-operated MCT-treated老鼠,和E2治疗改善博士因此,E2PH值的缺陷可能是一个风险因素。
PH值的特点是增强PASMC增殖、收缩、炎症和抗细胞凋亡,所有这些导致肺动脉壁厚的增加,阻力,和,因此,压力。在目前的研究中,E2预处理抑制PASMC增殖和MCT-treated老鼠巨噬细胞浸润,与之前研究的结果一致(22]。在这项研究中,由U3月等。(22),E2政府加强PASMC凋亡博士确实,预处理和急性治疗E2诱导肺动脉的明显改善muscularisation和内侧壁厚MCT-induced PH老鼠。
内皮损伤和功能障碍是一个主要的特征MCT-induced博士血管舒张药和血管收缩剂之间的扰动PH值可能是肺血管内皮损伤的结果。不,PGI2和ET-1是关键血管活性的介质,在患者治疗目标博士在先前的研究,在目前的研究中,没有减少,以挪士PGI2cox - 2水平和增加ET-1 ECE水平一直在PH值(15,25,26]。Gonzales等。(5)观察到endothelium-dependent肺血管舒张的增强是由慢性E2治疗。在胎儿肺动脉内皮细胞,E2——刺激以挪士活动被完全抑制雌激素受体拮抗剂他莫昔芬和ici - 182780 (6]。虽然这个研究发现,以挪士蛋白质和活动是调节肺循环的E2的角色,作者并没有调查E2在缺氧或特定管理。然而,R问好等。(24)表明,E2产生保护性的PH值在低氧的影响,但这种保护是不可能增加以挪士的函数表达式。因此,E2的监管以挪士表达式仍然是有争议的。我们进一步证明upregulation以挪士和没有E2在肺MCT-induced PH老鼠。这些发现与之前的报道相一致5,6]。尽管E的机制2增加以挪士表达式没有清楚地阐明,表观遗传异常可能是一种解释。
在动物和人类的研究表明,在怀孕期间有一个海拔PGI标记2血液和尿液的代谢物水平(27]。绝经后女性接受雌激素替代疗法显示PGI尿排泄增加2(28]。年代obrinoet al。(8)报道,E2剂量依赖性增加PGI2生产和COX-1 PGI2合酶表达而不影响人类脐静脉内皮细胞cox - 2的表达。然而,我们观察到肺PGI2生产和cox - 2表达增加了E2在MCT-treated老鼠。一个可能的原因是,MCT可能直接影响cox - 2的规定由E2;另一个可能的原因是E的调整机制2可能是特异性。众所周知,雌激素调节ET-1基因表达和生产(29日]。我们的数据表明,E2不仅调节以挪士和cox - 2的表达,而且也减少了ECE水平MCT-treated老鼠。
E的作用2PI3K / Akt通路已经证明在其他器官系统或细胞(30.,31日]。然而,其影响的精确机制并不完全清楚,它尚未确定是否这些影响在肺脉管系统中发挥作用。在目前的研究中,我们观察到,磷酸化PI3K和Akt是增加了MCT治疗,E2政府逆转增加。在先前的研究在大鼠主动脉环,294002,一个特定的PI3K / Akt通路的抑制剂,和Nω-nitro -l-arginine-methyl酯,NOS抑制剂,减少E2全身的血管舒张。数据显示E2施加vasorelaxant效应由以挪士通过Akt激活/ PKB-dependent机制在大鼠主动脉环32]。在其他的研究中,2-methoxyestradiol, E2代谢产物,抑制neointima形成和人类主动脉平滑肌细胞生长调节蛋白质磷酸化Akt或其他途径来增强cox - 2表达(33]。脱氢表雄酮,祖E2已经发现有益或有害影响相关的血管内皮改变平衡PI3K和增殖kinase-dependent信号在牛主动脉内皮细胞34]。类似的效果2据报道在细胞外signal-related激酶(ERK) 1/2通路在缺氧动物23]。在这项研究中,由L阿et al。(23),缺氧ERK-1/2表达增加,和E2治疗低氧动物表现出减少ERK-1/2激活。因此,E2可以调节的表达不,PGI吗2并通过PI3K / Akt通路ET-1 MCT-treated老鼠。
限制
综上所述,这些研究结果提供了很好的证据的重要性2在调节博士我们不能的发展,然而,排除其他的潜在机制增强肥大被E调制2。我们没有管理一个雌激素受体拮抗剂与E2E,潜在的下游信号机制2可以调节三种血管活性的介质将成为未来的主题调查在肺动脉内皮细胞和PASMC。我们不能明确地确定是否E2新陈代谢酶影响博士的发展此外,我们不能评估雄激素和雌激素代谢物和E2水平在老鼠的生命结束之前的横断面测量。
结论
这些结果表明,E2有效地改善PH值通过各种机制,包括抑制PASMC增殖和巨噬细胞浸润,提高PASMC凋亡,并且可能调解ER / PI3K / Akt通路,调节肺以挪士、cox - 2和ECE水平平衡ET-1,没有和PGI2表达式。E2缺乏由新陈代谢酶的变化可能会增加博士的风险,这些研究结果可能在PH患者有显著的临床意义。
脚注
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支持声明
这项工作是支持的上海市教委创新项目(09年zz35),中国国家自然科学基金项目(81170300),计划上海优秀学术领袖上海教育委员会“黎明”计划(10 sg25),在大学规划新世纪优秀人才(ncet - 10 - 0630),上海Shenkang医院发展的新前沿项目中心(SHDC12010102)。
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- 收到了2012年3月13日。
- 接受2012年8月3日。
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