文摘
最近的临床调查表明,T-cell-based免疫治疗恶性胸膜间皮瘤(MPM)可以代表一个替代其它治疗策略。然而,它的发展遭受缺乏识别肿瘤抗原的目标。粘蛋白1(中央)表示,承认在许多癌症细胞毒性t细胞,没有调查作为一个潜在的MPM的免疫目标。因此,本研究的目的是分析MPM MUC1表达的细胞,以确定是否该抗原可以的目标细胞毒性CD8 + t细胞(细胞毒性淋巴细胞(ctl))。
我们第一次评估MUC1的表达和糖基化MPM使用不同的MUC1-specific单克隆抗体细胞株。然后我们获得的细胞毒性t淋巴细胞克隆特定MUC1肽(残留950 - 958)提出的人类白细胞抗原(HLA)——* 0201和研究其interferon-γ和MPM细胞株的细胞毒性反应。
我们发现所有MPM细胞系MUC1蛋白表达在细胞表面不同的糖基化配置文件。我们也观察到抗原* 0201 + MPM细胞系认可和细胞溶解抗原* 0201 / MUC1(950 - 958)特殊细胞毒性t淋巴细胞克隆独立MUC1糖基化的形象。
因此,MUC1抗原表达和演讲MPM细胞可能代表一个有吸引力的目标免疫治疗治疗MPM尽管hyperglycosylated概要文件。
恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一个激进的胸膜肿瘤,通常与长期接触石棉。发病率增加,预计将在2020年达到顶峰在西方国家和发展中国家继续上升1]。
临床策略开发MPM治疗,包括化疗、放疗和手术,是有限的功效2]。然而,MPM案例报告和最近的临床试验描述T-cell-based免疫疗法的使用作为一个有趣的替代治疗间皮瘤(3]。的确,以前的观测显示淋巴细胞浸润和更好的预后之间的相关性(4- - - - - -7]。此外,我们先前所显示的,在临床前研究中,可以生成,细胞毒性淋巴细胞(ctl)对MPM (8,9]。最近,Hegmanset al。(10)报道,注入患者树突状细胞(dc)脉冲诱导的自体肿瘤细胞溶解产物能够对MPM的CTL反应。
T-cell-based免疫治疗治疗的发展限制的MPM是缺乏特征的肿瘤相关抗原(taa)承认t细胞。在文献中,识别MPM由TAA-specific ctl细胞很少被描述并没有分析细节。Yokokawaet al。(11)表明,残留547 - 556的CTL线具体mesothelin和人类白细胞抗原(HLA)——* 0201能够溶解三mesothelin +抗原* 0201 + MPM细胞系,同样的,一项由M唉et al。(12]表明,CTL线具体残留122 - 140霍奇金病的肿瘤1 (WT1)癌蛋白和抗原* 0201能够溶解WT1 +抗原* 0201 + MPM细胞系。
额外的TAA的兴趣是粘蛋白(中央)1抗原。这种高度糖基化的I型跨膜糖蛋白,数量可变的20-amino酸重复序列称为可变数目串联重复序列(VNTRs),现在被认为是最有趣的一个目标对癌症免疫疗法(13,14]。此前有报道称,VNTR序列可以特别认可CD8 + ctl表面的许多癌症细胞类型(乳腺癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤)在HLA类I-unrestricted时尚(15]。这个识别依赖于肿瘤特异hypoglycosylation MUC1的(16,17),不存在于正常细胞(18]。最近,经典承认MUC1肽与HLA类分子在肿瘤细胞表面的ctl也被证明。一个HLA-A1-restricted和几个抗原* 0201 - MUC1抗原表位的限制,尤其是MUC1(950 - 958),认可的ctl对肿瘤细胞的表面,有被描述19- - - - - -22),但不会在MPM调查。
到目前为止,众所周知,MUC1是由MPM细胞与正常相比间皮瘤细胞过表达(23]。因此,MUC1可以代表一个有吸引力的TAA对MPM目标CTL反应。评估这个,我们分析了MPM MUC1表达和糖基化的细胞,获得不同的MUC1(950 - 958) / 0201 -特定的细胞毒性t淋巴细胞抗原*克隆从外周血单核细胞(PBMCs)于* 0201 +健康的捐赠者,对MPM细胞株,研究他们的答复。我们发现最高活性CTL克隆认可和细胞溶解抗原* 0201 + MPM肿瘤细胞,独立于MUC1糖基化概要文件。这个结果表明MUC1可能是一个不错的TAA候选人MPM T-cell-based免疫疗法的发展。
材料和方法
肿瘤细胞培养
胸膜腔积液收集胸腔穿刺术,通过免疫组织化学和采用标签和诊断成立。所有病人给签署知情同意。人类MPM细胞系(Meso4、Meso13 Meso34, Meso35, Meso45, Meso47, Meso56, Meso62, Meso96, Meso122, Meso144和Meso148)从胸膜腔积液。他们建立和特征在我们实验室几个特定的标记。隔离这些细胞系的方法描述其他地方(24]。他们都显示一个类上皮表型。建立人乳腺癌细胞系MDA-MB231 (r . Cailleau安德森医院,休斯顿,TX,美国)和MCF-7(由B.J.苏格曼,基因泰克公司,旧金山、钙、美国)分别获得从d Jager (Klinik皮毛Oncologie、苏黎世、瑞士)和来自美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞系heat-inactivated维护在RPMI 1640补充10%胎牛血清(FCS), 100 U·毫升−1青霉素、0.1 mg·毫升−1链霉素和2毫米l谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,里昂,法国)。T2细胞系(礼物t .恩,路德维希癌症研究所,布鲁塞尔,比利时)是人类t细胞白血病抗原* 0201 + / b细胞线混合缺陷抗原处理相关转运子1和TAP2 (TAP),因此表达空HLA类分子在其表面,能够装载外源肽(25]。细胞培养在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C。在一些实验中,肿瘤细胞系培养24 500 IU·毫升−1干扰素(IFN) -γ(Abcys,巴黎,法国),或与5毫米benzyl-2-acetamido-2-deoxy-α- 48 hd-galactopyranoside (BGN) (Sigma-Aldrich)在第一个24小时。
抗体和多肽
藻红蛋白(PE)共轭鼠标反IFN-γ单克隆抗体(mAb),鼠标反人类hla a2马伯(克隆BB7.2)和异硫氰酸荧光素(FITC)共轭老鼠免疫球蛋白(Ig) G1k同形像控制马伯买来BD (Le Pont-De-Claix、法国)。鼠标反MUC1(克隆HMFG-1和SM3)马伯买来Abcam(法国巴黎)。鼠标反MUC1(克隆VU-3C6)马伯购买从圣克鲁斯生物技术(Tebu-bio, Le Perray en雷诺,法国)。FITC-conjugated反CD58马伯,FITC-conjugated反HLA-ABC马伯,PE-conjugated山羊F (ab′)2anti-mouse免疫球蛋白(重型和轻型链(H + L))买来贝克曼库尔特(Roissy、法国)。FITC-conjugated反CD54马伯购买从研发系统(法国里尔)。MUC1 (950 - 958), STAPPVHNV mesothelin (530 - 538), VLPLTVAEV肽买来Eurogentec(愤怒、法国)。肽纯≥95%。
t细胞启动
血从抗原* 0201 +健康的捐赠者获得Etablissement法语杜唱(法国南特)。诱导MUC1(950 - 958) /抗原* 0201 +执行特定的CD8 + t细胞在我们前面描述的但有少量修改(26]。简单地说,t细胞培养在RPMI 1640补充8%汇集人类血清(小灵通)当地生产与monocyte-derived dc分化5天1000 IU·毫升−1集落刺激因子(Abcys)和200 U·毫升−1白介素(IL) 4 (Abcys),然后用50μg成熟24 h·毫升−1ng polyinosinic: polycytidylic酸(Sigma-Aldrich)和20毫升−1肿瘤坏死factor-α(Abcys)和脉冲2 h 10μM MUC1(950 - 958)肽。t细胞文化刺激之后谈恋爱的时候每周有peptide-pulsed DCs的10 U·毫升−1- 2 (Proleukin;美国CA凯龙星Corp .)、维尔ng)和5毫升−1IL-7(研发系统)。6天之后第三个刺激,一个整除的t细胞文化是用来评估MUC1的百分比(950 - 958)特殊IFN-γt细胞的胞浆内染色。
t细胞克隆
从多克隆细胞文化包含MUC1(950 - 958)特殊t细胞克隆通过限制稀释为我们之前描述的26]。简而言之,t细胞在U-bottom镀96 -孔板与辐照(35 Gy)馈线细胞(1×105同种异体的PBMCs和1×104每口井的eb病毒转化b细胞),在10浓度,1或0.5 t细胞。刺激介质由RPMI 1640包含8%的小灵通,150 U·毫升−1和1 - 2μg·毫升−1phytohaemagglutinin L (Sigma-Aldrich)。2周后,每一个克隆进行肽特异性检测。特定的克隆被周期性re-stimulation维护文化。
Complementarity-determining地区3β测序
RNA从5×106从每个t细胞克隆细胞与RNable提取试剂(Eurobio、乌、法国)根据制造商的指示和15μL溶解在水中。反转录PCR扩增和测序进行如前所述[27]。我们跟着设立的t细胞受体(TCR)命名rdenet al。(28]。
免疫荧光法和流式细胞术
膜染色,1×105细胞在4°C的环境与1μg·毫升30分钟−1特定或isotype-control马伯,洗。马伯稀释和洗涤进行使用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS (Sigma-Aldrich)。当非结合的马伯,第二个孵化与PE-conjugated山羊F (ab′)2anti-mouse免疫球蛋白(H + L)。荧光是由流式细胞术分析(FacsCalibur;BD)使用Cellquest软件(BD)。相对荧光强度(RFI)计算样本均值作为荧光除以isotype-control意味着荧光。
为IFN-γ胞浆内染色,T2或肿瘤细胞系镀在1×105细胞·好−1在一个96孔板。事先,细胞与不同浓度的MUC1脉冲(950 - 958)1 h在4°C,然后洗净。他们培养5×104MUC1-specific细胞CD8 + t细胞克隆在媒体包含10μg·毫升−1brefeldin (Sigma-Aldrich) 6 h在37°C。细胞被固定在PBS含有4%多聚甲醛在室温下10分钟。细胞膜与PBS permeabilised含有0.1% BSA和0.1%的皂苷,孵化与PE-conjugated鼠标反IFN-γ马伯在室温下30分钟,然后洗净。生产IFN-γ决心通过流式细胞术封闭的t细胞(FacsCalibur;双相障碍)。
细胞内钙2 +级视频成像
测量细胞内钙2 +执行水平与CD8 + t细胞克隆N5.14装载1毫米Fura-2 / acetoxymethyl酯(分子探针;表达载体,Villebon伊薇特、法国)1 h在汉克的平衡盐溶液在室温下(哈佛商学院)。t细胞被洗,在哈佛商学院resuspended 1% FCS和播种Lab-Tek玻璃室幻灯片(美国Nunc Naperville, IL)涂有聚-l赖氨酸(Sigma-Aldrich)。t细胞被肿瘤细胞培养剩下坚持玻璃幻灯片1 h在37°C t细胞。细胞内钙的测量2 +反应在37°C DMI 6000 B显微镜(徕卡微系统、南特、法国)。细胞被照亮每15 s 300 w氙灯使用340/10和380/10-nm激发过滤器。排放在510 nm用于分析Ca2 +反应,和捕获CoolSNAP HQ2相机(美国亚利桑那州图森市Roper)和7.1 Metafluor成像分析软件(美国通用成像、Downington PA)。
51Na2阴极射线示波器4细胞毒性试验
肿瘤细胞株孵化了51Na2阴极射线示波器4(美国PerkinElmer,波士顿,MA) 1 h在37°C。1×103肿瘤细胞(目标)进行清洗和培养MUC1-specific CD8 + t细胞克隆(效应)在96孔板4 h 37°C一式三份。效应/目标比率的2/1,10/1和50/1。四健会孵化后37°C, 25μL每个上层清液的收集和添加到100年μL闪烁液体鸡尾酒(OptiPhase Supermix;PerkinElmer)在液体闪烁计数。特定的细胞溶解的百分比计算100×(实验释放——自发释放)/(最大释放——自发释放)。自发释放51Cr决心从靶细胞单独培养。的最大释放51Cr是获得目标细胞,细胞溶解在媒体含有1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)。
结果
通过MPM细胞MUC1的表达
我们首先进行了实时PCR实验来确定MUC1基因转录。变量的水平MUC1记录被发现在所有MPM线测试(数据没有显示)。然后我们使用流式细胞术研究MUC1蛋白的表达和分子参与肽表示和t细胞激活(CD54, CD58和HLA类)大量MPM细胞表面的线(图1)。我们使用三个单克隆抗体的结合MUC1的区分不同糖基化状态:HMFG-1, SM3 VU-3-C6 [29日]。克隆HMFG-1承认糖化和hypoglycosylated MUC1形式,而克隆SM3和VU-3-C6特定hypoglycosylated形式。此外,这些抗体认可MUC1 VNTR主题,这是一个20-amino酸重复序列的数量从20到125重复根据不等MUC1等位基因表达。因此,与这些抗体染色强度不仅反映了MUC1在细胞表面的数量,但也依赖于VNTRs出现在MUC1的数量。使用HMFG-1马伯,我们观察到表面MUC1表达所有MPM细胞系测试(图1)。然而,染色水平变量之间MPM细胞系RFI从7.6 Meso47 Meso56 105.2。这些染色水平略低于观察MCF-7,乳腺癌细胞系已知被MUC1-specific CD8 + T细胞(20.]。异质性染色观察使用两个马伯具体hypoglycosylated MUC1的形式。一些MPM细胞系,如Meso35, Meso47, Meso96和Meso148负面或略染色(RFI < 2),而其他MPM细胞系,如Meso13和Meso56更明显染色(RFI > 5)。此外,一些MPM细胞系被马伯的两个彩色优先具体不同的hypoglycosylated形式,如Meso56 Meso122,分别由SM3优先染色和VU-3-C6。在一起,这些结果表明,所有MPM细胞系MUC1表达水平的差异和糖基化的类型。
我们也分析了分子的表达与CD8 + t细胞激活,如HLA-ABC (HLA类I), CD54(细胞间粘附molecule-1)和CD58 MPM细胞(淋巴细胞功能相关的antigen-3)。所有MPM细胞系染色为这些分子除了Meso34积极,低水平的CD54表达分子(图1)。因此,所有MPM细胞系似乎具备激活MUC1-specific CD8 + t细胞反应。
MUC1抗原* 0201 -限制(950 - 958)特殊CD8 + t细胞克隆
确定MUC1是肿瘤抗原,可以承认ctl MPM表面细胞,生成于* 0201 -受限制的CD8 + t细胞克隆对MUC1(950 - 958)肽。这种肽在协会与CD8 + t细胞抗原* 0201分子在许多癌症类型(20.,21]。PBMCs从抗原* 0201 +健康的捐赠者和MUC1刺激三次(950 - 958)peptide-pulsed自体dc,每隔1周。6天之后第三个刺激,MUC1的存在(950 - 958)特殊t细胞是由测量IFN-γ-producing细胞响应unpulsed或MUC1 (950 - 958) peptide-pulsed TAP-deficient T2细胞。我们发现MUC1(950 - 958)特殊CD8 + t细胞在80年的9个小文化区,五个文化包含> 10%的t细胞特定的抗原决定基。由limiting-dilution文化,然后我们孤立的两个t细胞克隆,N5.14 N32.10,两井包含MUC1的最高分数(950 - 958)特殊t细胞:井它们和N32 (图2一个)。以确保他们的单克隆,我们测序complementarity-determining地区(CDR) 3β,发现他们都表达了一个TCRβ-chain与单个CDR3上区域(表1)。然后测量他们的反应对MUC1(950 - 958)提出的肽抗原T2 * 0201 +细胞。我们观察到,克隆N5.14(半数有效浓度(EC50)均值±扫描电镜25.7±4.4 nM)活动性高于克隆N32.10 (EC50866.7±185.6 nM),因为它承认∼少34倍肽(图2 b)。我们也观察到两个克隆的反应MUC1(950 - 958)提出的肽T2细胞被抑制的存在一个anti-HLA-A * 0201马伯(克隆BB7.2)培养(数据未显示),确认其抗原* 0201的限制。
识别抗原的抗原* 0201 * 0201 + MPM细胞——限制,MUC1(950 - 958)特殊CD8 + t细胞克隆
确定抗原* 0201 + MPM细胞被MUC1(950 - 958) /抗原* 0201 -特定的t细胞克隆,我们首先培养两个克隆与unpulsed或peptide-pulsed T2细胞控制。我们也分析和比较了克隆响应当暴露于抗原* 0201 - MPM细胞系,Meso13,或三个抗原* 0201 + MPM细胞系Meso35, Meso62 Meso144 (图3和b)。正如所料,这两个克隆对MUC1 (950 - 958) peptide-pulsed T2细胞培养时,不产生IFN-γ抗原* 0201 - Meso13细胞系。然而,只有克隆N5.14,显示最好的热望向肽(图2 c),对两个抗原反应强烈* 0201 + MPM细胞系,Meso62 Meso144,和弱第三抗原* 0201 +,Meso35 (图3)。其他克隆,N32.10表现出较低的热望,没能认识到三个抗原* 0201 + MPM细胞系(图3 b),除了如果肿瘤细胞脉冲与肽(数据没有显示)。在这个实验中,我们还检测了反应对MPM的克隆细胞系48 h与IFN-γ事先处理,这是增加分子的表达与抗原表达(CD54、CD58和HLA类I)和MUC1表达(在线补充图1)。IFN-γ-treated抗原* 0201 + MPM细胞系被克隆N5.14更好的认可而未经处理的细胞系。然而,IFN-γ治疗并没有导致识别的三个抗原* 0201 + MPM其他克隆细胞系,N32.10。
我们这个实验来测试识别两个克隆的所有可用的抗原* 0201 + MPM细胞株在我们的实验室。所有抗原的t细胞克隆N5.14回应* 0201 + MPM细胞系进行测试。这个反应是,在大多数情况下,增加治疗后肿瘤细胞系IFN-γ,尤其是IFN-γ生产应对克隆很低的未经处理的肿瘤细胞系(图3 c)。增加显著(p = 0.0164 Mann-Whitney紫外线测试)结果与所有MPM细胞线汇集在一起(图3 d)。相比之下,克隆N5.14没有回应两个抗原* 0201 - MPM细胞系Meso4 Meso13。CD8 + t细胞克隆,N32.10,未能认识到任何MPM细胞系(数据没有显示)。这些结果表明,MUC1的贪欲(950 - 958)特殊t细胞应该高到足以允许识别的自然处理和MPM肽的细胞。
然后,控制的特异性克隆N5.14,我们进行了两个额外的实验。首先,我们确认MPM克隆识别的抗原通过添加一个anti-HLA-A * 0201 * 0201 -限制马伯(克隆BB7.2) t细胞克隆/ MPM细胞株培养(在线补充图2一个)。我们观察到的60 - 70%抑制克隆的IFN-γ反应。其次,我们评估的反应克隆N5.14 HCT116、抗原* 0201 + MUC1结肠癌细胞系(在线补充图2 b)。正如所料,这种肿瘤细胞株并不承认克隆N5.14,确认其MUC1特异性(在线补充图2 c)。
细胞溶解的活动对MPM的CD8 + t细胞克隆N5.14细胞系
我们第一次观察到的证据MUC1抗原* 0201 + + MPM细胞系克隆细胞内钙在第50分钟N5.14消散2 +水平成像实验(图4和在线补充图3)。我们观察到,克隆N5.14不是激活的0201 - MUC1抗原* + Meso13 MPM细胞系。克隆从一个肿瘤细胞转移到另一个扫描特定HLA /肽复合物,肿瘤细胞仍然附着在塑料。一些细胞内钙的峰值2 +观察几个t细胞,但并不持久。相比之下,当克隆培养与抗原* 0201 + MUC1 + Meso144 MPM细胞系,大多数的t细胞肿瘤细胞与细胞内钙持续2 +增加。最后10分钟,一些肿瘤细胞克隆脱离认可的塑料和开始死亡(在线补充图3)。
最后,我们确认识别抗原* 0201 + MPM的克隆细胞系N5.14导致肿瘤细胞的裂解的十万个为什么51Cr释放试验。因此,我们培养克隆N5.14有两个常见抗原* 0201 + MPM细胞系,Meso62或Meso144,或与一个弱认可抗原* 0201 + Meso35 MPM细胞系或nonrecognised Meso13抗原* 0201 -线。我们发现克隆N5.14能够杀死三个抗原* 0201 + MPM细胞系水平与细胞内的反应测量IFN-γ染色(图4 b)。我们使用于* 0201 - MPM细胞系Meso13作为控制和不被克隆。
糖基化水平MUC1不影响识别的抗原由抗原* 0201 * 0201 + MPM细胞——限制,MUC1(950 - 958)特殊CD8 + t细胞克隆
我们没有找到一个相关性抗原的识别水平* 0201 +肿瘤细胞系克隆,MUC1的表面染色,CD54、CD58和/或HLA类我由肿瘤细胞(无花果1和3 c)。然而,染色MUC1-specific马伯不仅反映了表面MUC1的数量,而且VNTR序列中MUC1分子。此外,其他参数,如MUC1糖基化状态,可以在MUC1表达中发挥作用。虽然一些研究表明,识别MUC1的t细胞增加hypoglycosylated[此抗原时17,19),我们的研究表明,糖基化MUC1的状态似乎并不影响MPM细胞的识别。事实上,一些细胞系,如Meso62, MUC1 hypoglycosylation水平很低,被认可的t细胞克隆。相比之下,Meso56展品MUC1 hypoglycosylation的最高水平,是人们越少细胞系之一。
此外,我们使用BGN,竞争性抑制剂O糖基化,减少糖基化MPM MUC1的细胞,然后测试是否这种治疗增加了MPM的识别细胞的t细胞克隆。正如所料,MPM细胞系BGN处理时,MUC1糖基化严重受损,SM3和VU-3-C6染色MPM细胞系显著增加,接近水平观察HMFG-1 (图5)。然而,t细胞克隆反应相似BGN-treated和未经处理的细胞系(图5 b)。这个结果证实MUC1的糖基化状态不影响演讲MUC1(950 - 958) /抗原* 0201复合物对MPM细胞CD8 + t细胞及其识别。
讨论
在这项研究中,我们已经表明,MPM细胞系MUC1表达有显著差异。大多数MPM细胞系,如Meso35或Meso96正常MUC1蛋白表达水平较低的hypoglycosylation在细胞表面。其他MPM细胞系,如Meso13或Meso56更hypoglycosylated MUC1的表达。使用两种不同的MUC1(950 - 958) /抗原* 0201 -特定的CD8 + t细胞克隆,我们也证明了所有抗原* 0201 + MPM细胞系在我们的研究中提出了这一抗原决定基最高的CD8 + t细胞克隆亲和力,无论MUC1糖基化概要文件。此外,MUC1肽表达导致裂解抗原* 0201 + MPM由这个t细胞克隆细胞系。相结合,这些结果表明,MUC1也许是个不错的候选人作为肿瘤抗原MPM免疫治疗治疗的发展。然而,观察MUC1(950 - 958) /抗原* 0201 -特定的CD8 + t细胞克隆最低的活动性不承认抗原* 0201 + MPM细胞系表明MPM的免疫治疗治疗应该瞄准诱导对MUC1 high-avidity t细胞。此外,监控对MUC1在这样的t细胞反应对肿瘤细胞治疗应该执行,而不是目标细胞脉冲高数量的肽。
另外两个taa MPM,能够诱导表达的CD8 + t细胞反应概要地描述,mesothelin和WT1 (11,12),因为他们认识到peptide-specific t细胞线研究了在少数MPM细胞系(分别为1和3 MPM细胞株)。在我们的研究中,我们深入描述了MUC1表达和糖基化在12 MPM MUC1-specific细胞系及其识别的CD8 + t细胞克隆。尽管如此,这些研究和我们自己的表明,至少有三个不同的taa可以结合目标MPM的免疫治疗方法,限制了机会选择肿瘤细胞逃避免疫系统的抗原变异损失。
我们对MUC1表达和糖基化的分析表明,由所有MPM MUC1表达细胞系与变量MUC1糖基化分析概要文件从一个MPM细胞系到另一个。MUC1是经常在MPM细胞表面的糖基化的形式。这是特点是缺失或弱染色SM3或VU-3-C6马伯,诱导或增加与BGN治疗后,糖基化的竞争性抑制剂。然而,几个MPM细胞系表现出一个变量水平的阳性染色SM3或VU-3-C6马伯。因此,一些VNTRs MUC1分子hypoglycosylated表面。我们的研究结果部分确认以前的观测用Creaneyet al。(23),报告恶性间皮瘤MUC1的表达情况,但我们没有确认MUC1的糖基化改变,因为我们观察hypoglycosylated MUC1的分子只有少数MPM细胞系。
我们没有找到一个表面MUC1的染色水平之间的相关性和MPM的识别由MUC1-specific N5.14克隆细胞系。例如,MPM细胞系MUC1较低表面染色,没有或弱hypoglycosylation,如Meso47或Meso62,被认可的克隆,而其他MPM染色高的细胞系表面MUC1 Meso56等弱认可。毫不奇怪,MUC1染色不与t细胞克隆的识别水平,只因为这些染色不能反映MUC1的表达,而且MUC1 VNTRs的数量。此外,MUC1 MPM细胞表面的存在并不占总MUC1表达的肿瘤细胞,而且还取决于MUC1在表面的营业额和sheddases的乳沟,如肿瘤坏死factor-α-converting酶/ ADAM17和膜1型矩阵metalloprotease [30.,31日]。
MUC1的表达以外的其他参数可以调节MUC1的表达(950 - 958)肽CD8 + t细胞。我们提出,MUC1的糖基化可能是其中的一个参数。事实上,Hiltboldet al。(19)报道,糖基化的多肽,由五个MUC1 VNTRs,减少了加工和HLA-A1-restricted cross-presentation CD8 + t细胞的DCs中包含9个氨基酸肽这长肽。此外,Hinodaet al。(17)描述增加识别的胃肿瘤细胞培养O糖基化抑制剂BGN,由HLA-unrestricted MUC1-specific CTL。这显然不是在我们的研究中,由于没有相关性MUC1 hypoglycosylation和t细胞克隆识别。此外,我们进行了几个实验来确认没有影响t细胞克隆的MUC1糖基化反应治疗与BGN MPM细胞,竞争性抑制剂O糖基化。治疗MPM细胞系BGN没有增加或诱导t细胞克隆他们的认可,表明MUC1糖基化不会干扰我演讲的HLA类抗原决定基。
一些治疗MPM免疫治疗策略也已经被开发出来。他们在小鼠模型表现出效率高,目前正在评估i ii期临床试验。这些策略包括注入MPM DCs脉冲患者自体肿瘤细胞溶解产物(10)或I型干扰素(32,33],[- 234- - - - - -36)或CD40受体激动剂(37,38]。所有这些策略主要nonantigen-specific免疫疗法旨在提振抗肿瘤天生的和特定的免疫反应,抗原递呈细胞成熟或消耗调控t细胞。TAA MPM表达的细胞的识别和认可,t细胞,如MUC1抗原免疫疗法可能旨在刺激抗肿瘤t细胞反应。这种方法针对MUC1在其他恶性肿瘤取得了可喜的成果,如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌(39- - - - - -43]。例如,在飞行员组成的第三阶段免疫治疗研究注入氧化mannan-MUC1 II期乳腺癌患者没有疾病的证据,一个postolopouloset al。(39)报道说,这种疫苗预防疾病的复发。因此,识别的taa MPM表达的细胞,如MUC1和描述他们的识别ctl会很大的帮助在设计抗原免疫疗法治疗MPM。
确认
我们要感谢j . Le Pendu (INSERM U892,南特,法国)为他的批判阅读手稿,d . Coulais(平台的开发和临床转移,友谊医院南特,南特)和p . Hulin s Nedellec (MicroPICell,细胞成像的核心设施研究所de矫揉造作的Therapeutique de南特南特)的技术援助。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项研究是由由联赛La Inter-Regionale靠le癌症(comitee 44和79年),南特大学医院(法国南特)和ARSMESO44协会。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年10月12日。
- 接受2011年4月8日。
- ©2011人队