文摘
潮汐的呼吸,尤其是深呼吸,与支气管狭窄引起的气管平滑肌收缩(ASM);然而,这种bronchoprotective呼吸受损哮喘的效果。应用于简约ASM力波动在体外因为它relengthen, force-fluctuation-induced relengthening (FFIR)。鉴于ASM,呼吸产生类似的力量波动,FFIR代表一个可能的机制呼吸抵销支气管收缩。因此,了解调节FFIR相当大的兴趣,和ASM如何操纵利用这一现象。证明之前,p38增殖蛋白激酶(MAPK)信号调节FFIR ASM。在这里,这是假设,MAPK激酶(MEK)信号通路调节FFIR。
为了测试这一假说,FFIR变化测量在ASM处理MEK抑制剂,U0126 (1 4-diamino-2 3-dicyano-1, 4-bis [2-aminophenylthio]丁二烯)。
浓度增加U0126 FFIR大引起的。U0126减少细胞外signal-regulated激酶1/2磷酸化而不影响等张缩短或20-kDa p38 MAPK和肌球蛋白轻链磷酸化。然而,U0126浓度的增加逐渐减弱的磷酸化高分子量caldesmon (h-caldesmon),下游MEK的目标。这样的变化与h-caldesmon磷酸化FFIR表现出显著的负相关。
目前的数据表明,FFIR监管通过MEK信号,表明MEK是介导的作用,在某种程度上,通过caldesmon。
支气管狭窄和气流阻塞在哮喘发作期间,在某种程度上,由于过度收缩气管平滑肌(ASM)。气道狭窄的程度在支气管挑衅并不仅仅是预测,甚至主要由ASM生成等距力量的能力1- - - - - -10。在正常动物和人类个体接受支气管挑衅,气道收缩是由潮汐呼吸大大减弱9,11- - - - - -13和深刻的启示,在所有已知的最有力bronchodilatory干预措施10,14。这些结果可能出现,因为在呼吸,力量波动直接从肺实质行为传播感染ASM来影响其维护缩短状态的能力;因此,呼吸道口径的动态平衡3,4,8在一个长度超过静态状态。
在简约isotonically孤立牛ASM,起始力的波动会导致明显的肌肉relengthening4,15。已经证明这种force-fluctuation-induced relengthening (FFIR)生理调控15,16。例如,药物抑制p38增殖活性蛋白激酶(MAPK)信号激酶调节平滑肌收缩17在牛,也强化FFIR气管平滑肌(TSM)条15。因为MAPK激酶(MEK)也被卷入调节平滑肌收缩18- - - - - -20.,提出MEK信号也可能影响FFIR。
乙酰胆碱(ACh)激活G-protein-coupled毒蕈碱的受体21导致一些信号级联的起始。活化的肌球蛋白轻链(多层陶瓷)激酶和MEK促进20-kDa多层陶瓷(MLC20)磷酸化通过细胞内钙水平升高和Ras信号,分别。还Ras /皇家空军/ MEK信号级联激活(磷酸化)细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2及其下游integrin-linked激酶等监管部门的萎缩22,23和caldesmon24- - - - - -27。
在目前的研究中,假设MEK信号通路调节FFIR在TSM测试使用MEK抑制剂,U0126 (1 4-diamino-2 3-dicyano-1, 4-bis [2-aminophenylthio]丁二烯)。发现,在MEK抑制,改变FFIR caldesmon磷酸化(δFFIR)负相关。相比之下,MEK抑制减少无论是MLC20 p38 MAPK和27-kDa热休克蛋白(Hsp27)磷酸化或等渗缩短。这些结果说明MEK FFIR的关键调节器,并表明其效果介导,至少部分通过caldesmon磷酸化。
方法
组织准备
按照机构动物保健和使用委员会批准协议,狗被过量的犀牛和安乐死·戊巴比妥钠(30毫克公斤体重−1静脉注射)。气管被移除和冲洗Krebs-Henseleit (KH)解决方案包含115毫米氯化钠,纳科25毫米3,1.38毫米KH2阿宝4氯化钾,2.51毫米,2.46毫米MgCl2,2.5毫米CaCl2葡萄糖和11.2毫米。KH的解决方案是喝醉酒的5%与95%的氧气/二氧化碳为了保持pH值7.3 - -7.5,和所有研究进行了37°C KH的解决方案。一些组织存储长达4天在4°C研究之前,对结果没有任何明显的影响。
如前所述16,平行纤维束的TSM测量0.25 - -0.50毫米宽,0.5 - -1.0毫米在深度上覆结缔组织的解剖和上皮细胞。每一块肌肉带连接两端在铝箔剪辑(激光服务公司,韦斯特福德,妈,美国),坚定地肌肉。一夹在严格溜钩的一端水平dip-tray风格的器官浴。另一个片段被绑钩连接到一个300 b杠杆臂/测力传感器(极光科学,极光,加拿大),测量输出力和长度变化,监控使用ADInstruments Powerlab图软件(美国科罗拉多斯普林斯,ADInstruments有限公司)。
组织平衡
在∼90分钟,组织定期合同(∼10-15-min间隔)使用43毫米KCl-substituted KH解决方案建立参考长度(L裁判)。l裁判3.5 - -8.0毫米不等。休息调整长度之间的反应,直到开发力最大的和可重复的。正如前面所示,这个氯化钾浓度是适合犬TSM压敏电阻器收缩和不会导致释放乙酰胆碱从神经元素组织准备28。
等距的协议
平衡后,TSM将受到U0126 (WI Promega,麦迪逊,美国;15或30μM)或车辆≥45分钟,然后累计课时量效进行了研究(1×10−91×10−4米)。所有等距数据在应对ACh正常化的每一块肌肉收缩引起过去接触43毫米KCl-substituted KH的解决方案。
FFIR协议
平衡后,组织被同分异构地萎缩了切换灌注的解决方案包含1×10 KH的解决方案−4米,和最大响应(F马克斯)指出。肌肉被允许放松与KH reperfusing独自解决方案。l裁判和F马克斯被用作基础参数下面描述的强迫振荡协议(图1一个)。组织气鳔1×10−4M ACh 20分钟后力已经达到了放松的基线,和允许缩短isotonically对后负荷的32%F马克斯在持续了20分钟。ACh曝光,正弦力振荡(0.2赫兹,幅值的±16%F马克斯)然后叠加(模拟潮汐呼吸)20分钟4,15,16,29日。FFIR指出最后20分钟和课时被冲毁。肌肉振荡使用极光科学动态肌肉控制软件。肌肉力量和长度输出是通过国家仪器pci - 6036 e数据采集板(美国国家仪器、奥斯汀、TX);数据监控和收集使用基于labview的动态肌肉控制(极光科学)和ADInstruments PowerLab图软件。
实验性的协议。气管平滑肌条受到U0126 (1 4-diamino-2 3-dicyano-1, 4-bis [2-aminophenylthio]丁二烯)或车辆(控制)45分钟,之后振荡协议然后重复。的区别(δ)force-fluctuation-induced relengthening (FFIR)之后与治疗前确定。负载振荡将32±16%的最大收缩力(F马克斯)。快结束时,第二个收缩顺序,组织被瞬间冷冻在液氮vehicle-treated(控制)肌肉条(c),没有明显的δFFIR。MEK抑制与U0126 (b和d)显著增加δFFIR相对于车辆控制条处理。代表显示痕迹。l裁判:参考长度。
组织培养1 h在KH解决方案包含3、15或30μM U0126或0.03%二甲亚砜(DMSO溶液;车辆控制)。之前的研究表明,这DMSO溶液的浓度不影响后续长度等张/强迫振荡协议的变化16。这些MEK抑制剂的浓度选择基于文学价值观和我们自己的研究在一个单独的TSM条显示他们对等距力量只有最小的影响(见上面的等距协议部分)。此外,这些并不影响浓度等张缩短响应,MLC20磷酸化或p38 MAPK激活状态在当前研究中(见结果部分)。这段平衡后,等张收缩协议在抑制剂的持续存在重复或车辆(图1)。肌肉长度变化在宫缩抑制剂治疗前后被表示为一个百分比的L裁判。快结束时,第二个收缩序列,但在力波动停止之前,大多数组织都瞬间冷冻在液态氮。条被转移到dry-ice-chilled丙酮(包含5%三氯乙酸和二硫苏糖醇10毫米)和存储在-80°C蛋白分离和免疫印迹分析。
Jasplakinolide和U0126结合研究
以前,这是表明,收缩肌动蛋白聚合在调节FFIR起着关键的作用16。这个协议的目的是测试假设MEK抑制增强FFIR通过减少肌动蛋白丝稳定。组织的时候,F马克斯确定和初始等张/强迫振荡协议执行(如上图)。TSM条被允许放松然后孵化1 h jasplakinolide (EMD生物科学、圣地亚哥、钙、美国;500海里),代理稳定肌动蛋白细丝,促进聚合。虽然仍在jasplakinolide,收缩序列重复。第二个收缩序列完成后,组织被允许放松在KH的解决方案包含500海里jasplakinolide基线。一旦实现基线轻松的语气,组织进一步孵化在30μM U0126(除了500海里jasplakinolide) 1 h。第三个结合收缩序列执行在U0126和jasplakinolide的存在。这些组织是指定CJU (control-jasplakinolide-jasplakinolide加上U0126)基于三个等张/振荡收缩序列。三个对照组也进行测试,CCC (control-vehicle-vehicle) CJJ (control-jasplakinolide-jasplakinolide)和(control-vehicle-vehicle加上U0126)情事属实者。最后第三收缩序列,但在力波动已经停止之前,组织瞬间冷冻在液氮和转移到dry-ice-chilled丙酮(如上所述)。
西方的分析目标蛋白质的磷酸化
蛋白质从U0126、jasplakinolide和vehicle-treated肌肉被冻结的结尾处各自收缩序列提取如前所述16,30.。所有车道凝胶都含有相同浓度的总蛋白提取。变性蛋白质被dodecylsulfate-polyacrylamide钠凝胶电泳分离(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),转移到Immobilon-P聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜和磷酸化和总ERK1/2探测,高分子量caldesmon (h-caldesmon) MLC20, p38 MAPK和Hsp27。磷酸化和总蛋白被发现在不同的PVDF膜使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(美国热,罗克福德,IL),并吸干强度(卷)计算使用BioRad密度计和软件(BioRad、大力神、钙、美国)。比例的总蛋白磷酸化是表示相对于数据派生vehicle-treated组织在同一蛋白质印迹。
所有主要抗体在兔子长大,从下列来源:磷酸化(丝氨酸789 (Ser789年))和nonphosphorylated h-caldesmon: l .亚当(美国百时美施贵宝,普林斯顿,纽约);Hsp27和磷酸化MLC20:地下水面Gerthoffer(美国SL南阿拉巴马大学、移动);磷酸化Hsp27:试验设计(美国安阿伯市MI);MLC20:圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国);ERK1/2: M.J.邓恩(美国密尔沃基威斯康星医学院,WI);和磷酸化nonphosphorylated p38 MAPK和磷酸化ERK1/2:细胞信号(丹弗斯、马、美国)。
数据分析
所有数据都表示为±扫描电镜。期间所有肌肉长度达到agonist-elicited等张缩短和FFIR被表示为一个百分比的L裁判。第一次和第二次之间的差异等张/强迫振动序列(即。之前和之后的抑制剂或车辆)或第二和第三收缩序列在jasplakinolide研究中,表示为δFFIR。结果不同群体比较用方差分析或成对或未配对t检验。当方差分析显示差异意味着,数据进一步分析使用Newman-Keuls测试多个比较。显著性差异p < 0.05时被定义。
结果
MEK抑制和FFIR ACh-contracted宠物TSM
对于每个等张收缩/振荡序列,计算FFIR肌肉收缩带长度的变化,发生在20分钟振荡周期(图1);δFFIR计算这些值的每一块肌肉。U0126对δFFIR三个浓度的影响,3、15和30μM,比较单独的车辆(图2)。U0126δFFIR ACh-contracted TSM在浓度的增加(p < 0.001)。在先前的研究16,vehicle-treated组织可再生的FFIR之后与治疗前(即。δFFIR∼0)。这些数据支持了假设MEK调节δFFIR犬TSM。
不同浓度的增殖作用的影响蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂U0126 (1 4-diamino-2 3-dicyano-1, 4-bis [2-aminophenylthio]丁二烯)。的区别(δ)force-fluctuation-induced relengthening (FFIR)比acetylcholine-contracted狗气管平滑肌条,仅接受车辆(n = 14)。数据意味着±扫描电镜。MEK抑制调节FFIR浓度的方式(p < 0.001 (n = 6 /浓度);方差分析)。*:p < 0.05与没有药物治疗;#:p < 0.05与0,3和15μM U0126。
MEK抑制和等距力量代或等渗缩短ACh-contracted宠物TSM
15和30的影响μM U0126对犬TSM等长收缩评估。没有明显的量效关系的转变也观察U0126集中,尽管条处理浓度越高往往对减少力1×10−4M ACh (p = 0.269) (图3)。等张缩短治疗后组织之间没有差别对待30μM U0126或车辆(图3 b);因此,这个参数不能占δFFIR观察组间的差异。
增殖效应蛋白激酶激酶抑制静力响应和等张缩短乙酰胆碱(ACh)感染犬气管平滑肌(TSM)条。)U0126 (1 4-diamino-2 3-dicyano-1 4-bis [2-aminophenylthio]丁二烯)浓度的15 (□;n = 3)和30μM (○;n = 5)对静力响应能力没有显著的影响相比,控制条(•;n = 4) (p = 0.486;方差分析)。b) 30μM U0126 (n = 6)治疗导致大幅增加变化force-fluctuation-induced relengthening控制(n = 14)相比,但并不影响TSM条治疗后的等张缩短(p = 0.951;未配对t检验)。数据意味着±扫描电镜。l裁判:参考长度。
MEK抑制和caldesmon磷酸化ACh-contracted宠物TSM
U0126浓度的增加逐渐减少h-caldesmon磷酸化(p = 0.002) (图4和b)。因此,δFFIR(逐渐增加而增加U0126浓度(图2)不同的反向h-caldesmon磷酸化水平(图4摄氏度)。正如所料,U0126治疗大大降低ERK1/2磷酸化研究浓度(数据没有显示;p < 0.001)。然而,MEK MLC20磷酸化的抑制作用没有显著的影响,p38 MAPK或Hsp27(数据没有显示;p > 0.25;方差分析)。
增殖的影响在caldesmon磷酸化蛋白激酶激酶抑制狗气管平滑肌(TSM)条。3)相对caldesmon磷酸化水平(n = 6), 15 (n = 5)和30μM (n = 6) U0126 (1 4-diamino-2 3-dicyano-1, 4-bis [2-aminophenylthio]丁二烯)相比,那些在TSM条仅接受车辆(n = 10);和b)代表相应的控制和免疫印迹U0126-treated组织。Caldesmon证明减少磷酸化后治疗15和30μM U0126相比vehicle-treated和3-μM条(p = 0.002;方差分析)。c)的变化force-fluctuation-induced relengthening(δFFIR;•)反向变化相对caldesmon磷酸化(□)条简约与乙酰胆碱的存在U0126(数据来源于图2和4)。数据意味着±扫描电镜。h-caldesmon:高分子量caldesmon;l裁判:参考长度。*:p < 0.05与没有药物治疗;#:与0和3μM U0126;¶:与0,3和15μM U0126。
MEK抑制增加FFIR机制,不涉及损失的肌动蛋白丝的完整性
正如前面发现的16,独自jasplakinolide (CJJ;n = 3)没有影响FFIR相比控制(CCC;n = 4)。结果一致two-contraction协议(图1 b和d), 30μM U0126显著增加δFFIR (n = 4)组织情事属实者条(p = 0.004;方差分析)。CJU (n = 3)条受到jasplakinolide在第二次收缩序列然后jasplakinolide + U0126在第三。在这些CJU条,δFFIR仍相当于观察组织(p =情事属实者ns)。Jasplakinolide不会大幅改变U0126对磷酸化ERK1/2或h-caldesmon(数据没有显示)。
讨论
有越来越多的证据证明潮汐呼吸功能反对醋甲胆碱引起的气道狭窄7,10,13,似乎很有可能感染ASM的FFIR可能占这anti-bronchoconstrictive效应。因此,相当大的兴趣知道机制确定FFIR和平滑肌如何操纵来突出这有益的现象。先前的研究已经清楚地表明,力量波动应用于isotonically简约ASM导致相当大的relengthening尽管持续收缩的刺激1,4,15,16。本研究扩展了这些发现证明以下。1)FFIR可以增强通过抑制MEK信号通路(无花果。1和2)。2)在FFIR MEK抑制的影响不能占的变化生成等距力量,等张缩短(图3)、减少MLC20磷酸化改变p38 MAPK激活或肌动蛋白丝动态,因此必须依赖其他机制。3)相反,增强作用引起的FFIR MEK抑制伴随h-caldesmon磷酸化的抑制(成反比图4摄氏度),这表明MEK调节FFIR,至少在某种程度上,通过其下游目标,h-caldesmon。
毒蕈碱的受体激活涉及到一个复杂的信号级联,包括激活MEK及其下游效应器(图5)。几项研究在不同的物种证明衰减MEK的平滑肌收缩的抑制信号通路19,31日- - - - - -34。值得注意的是,德安杰洛和亚当35证明,在猪颈动脉,抑制ERK激活使用PD 098059衰减引起的等距力量,与减少MLC20和h-caldesmon磷酸化观察组织内皮素1激活时。此外,欧莱et al。36表明,推倒caldesmon表达减少KCl-stimulated血管平滑肌收缩了62%。在此,试图评估MEK抑制的影响在犬TSM FFIR没有减少等距力量代或等渗缩短。15和30μM U0126显然没有影响等张缩短(图3 b),而且,尽管更高浓度的U0126代稍微倾向于减少等距力量,这个代理压根不会影响力量代15μM(使用时图3)。尽管如此,大量的观察和concentration-related FFIR的扩充。作为主要的机械干涉这些研究(即。U0126治疗)直接修改MEK激活,这些重大变化表明,MEK信号负调节FFIR通过一个机制,不需要改变传统措施的收缩,即。生成或等渗缩短等距力量。
图解模型的信号通路参与平滑肌收缩。乙酰胆碱(ACh)激活G-protein-coupled M2和M3毒蕈碱的受体,导致几个信号级联的激活。米2激活Raf /增殖蛋白激酶(MAPK)激酶(MEK)信号,而反过来,激活细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2和收缩的下游监管机构,包括高分子量caldesmon (h-caldesmon)。通过激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和ERK1/2,细胞内Ca2 +和integrin-linked激酶(同类)促进磷酸化(P)的20-kDa肌球蛋白轻链(MLC20)。只有几个可能的效应分子参与这个途径进行描述。DAG:甘油二酯;PKC:蛋白激酶C;知识产权3:肌醇1 4 5-trisphosphate;凸轮:钙调蛋白;PI3K: phosphatidylinositol-3激酶;Hsp27: 27-kDa热休克蛋白。
几个潜在的机制MEK FFIR信号可能发挥其监管影响进行评估。Caldesmon actin-associated蛋白质,似乎调节血管平滑肌35。工作实验室的石油醚亚当表明的磷酸化h-caldesmon平行等距力量生产,而且ERK1/2生理相关caldesmon激酶35。当caldesmon Ser磷酸化789年活跃ERK1/2肌动球蛋白交互抑制24- - - - - -27。在目前的研究中,U0126显著降低ERK1/2磷酸化,以及在较小程度上,caldesmon磷酸化,发现δFFIR之间成反比关系,在Ser caldesmon磷酸化水平789年(图4摄氏度)。因此目前的结果建议h-caldesmon磷酸化的潜在作用,至少在爵士789年,在调节FFIR的大小。尽管U0126治疗,抑制ERK活化半部分caldesmon磷酸化仍然发生。与这些研究结果一致,表明抑制MEK信号减少但不废除caldesmon磷酸化37,38。此外,U0126 FFIR更高浓度增加不成比例的关系更温和下降caldesmon磷酸化。这表明,MEK抑制行为通过多个机制影响FFIR,也许其他传说caldesmon激酶的抑制,如意思是cdc2(细胞周期蛋白依赖性激酶1)39短暂快速脉冲刺激导致蛋白激酶21,40,41第二,酪蛋白激酶42或钙调蛋白激酶ⅱ43,可能会增强FFIR更加显著。
其他几个潜在机制MEK抑制可能导致增加FFIR也探索。原肌球蛋白的MEK下游信号可以催化磷酸化44,一个肌动蛋白side-binding蛋白质稳定肌动蛋白丝。磷酸化原肌球蛋白结合亲和力增加到肌动蛋白丝。因此,提出,MEK信号可能导致稳定肌动蛋白丝。因为它曾表明,稳定的肌动蛋白丝jasplakinolide块latrunculin B-induced FFIR的增加16,这个假设检验判断jasplakinolide也可以阻止MEK-inhibition-induced FFIR的增加。结果报告,jasplakinolide预处理不能防止U0126对δFFIR的影响。这样看来,MEK的信号通过一个机制,减少FFIR不涉及肌动蛋白丝完整性的损失。然而,它仍然可以想见,肌动蛋白丝之间的相互作用和细胞膜局部粘连可能涉及。
有趣的是,没有重大变化和MEK抑制MLC20磷酸化。我们曾认为,增加肌动球蛋白crossbridge自行车可能会减少拉伸的净效应简约ASM4,8,15,45,46。在目前的研究中,MLC20磷酸化并不是影响U0126治疗,和组织处理或不U0126缩短同样(图3 b)。由于MLC20磷酸化是一个关键因素的肌动球蛋白crossbridge循环率,似乎MEK抑制肌动球蛋白腺苷三磷酸酶活性几乎没有影响。因此MEK通路调节FFIR犬TSM以外的一种机制通过改变MLC20磷酸化(或者,据推测,肌动球蛋白crossbridge循环率)。然而,可想而知,actin-myosin绑定本身和减少h-caldesmon磷酸化受损吗40,47,48,这可能解释了为什么MEK的抑制,从而减少h-caldesmon磷酸化,增强FFIR在目前的组织。
最后,Lakseret al。15先前表明,p38 MAPK激活抑制FFIR感染牛TSM。其他的研究表明,MEK / ERK1/2之间的串扰和p38 MAPK信号通路可能发生49- - - - - -52。然而,由于U0126并不影响p38 MAPK的磷酸化水平或Hsp27在目前的研究中,MEK抑制显然不施加其影响力FFIR通过改变p38 MAPK信号。
据我们所知没有MEK激活增加哮喘患者的报告与nonasthmatics;然而,伯吉斯et al。53报道的增加哮喘人类ASM细胞ERK的磷酸化在低浓度的胎牛血清的存在。此外,段et al。54表明,U0126显著降低ovalbumin-induced醋甲胆碱在小鼠哮喘模型气道高反应。有趣的是,ERK的磷酸化也增加了ovalbumin-challenged老鼠的天真的老鼠相比,提出的潜在作用MEK / ERK信号通路在过敏性哮喘模型。
总之,目前的研究表明,MEK信号通路调节的大小FFIR简约ASM的通过一个机制,在某种程度上,包括h-caldesmon,但似乎并不取决于MLC20磷酸化的变化,p38 MAPK信号或肌动蛋白丝的完整性。由于FFIR可能账户,至少部分的支气管收缩的功能对立潮汐呼吸,目前的结果有潜在影响的强迫振荡的影响通过呼吸气流阻塞支气管收缩的刺激。因为FFIR生理调节(就是明证能力影响FFIR MEK的操作活动),似乎可以想见,在哮喘治疗干预增加FFIR可能是有益的。
脚注
支持声明
这项研究是由美国国立卫生研究院的支持(贝塞斯达,医学博士,美国)赠款HL 79368, AI 56352和HD 043387。
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- 收到了2009年10月9日。
- 接受2010年1月12日。
- ©2010人队