摘要
在过去十年中,已经应用了包括基因组,表观蛋白,转录组和蛋白质组的高通量技术,以进一步了解我们对这种异质疾病的分子发病机制的理解,并制定旨在改善肺癌患者管理的策略。最终,这些方法应导致早期诊断的敏感,特异性和非侵入性方法,并促进对治疗和结果的反应预测,以及识别潜在的新型治疗目标。
基因组研究是首先通过向肺癌分子生物学提供新颖的洞察力来首先移动这一领域,并通过产生疾病进展的候选生物标志物。肺癌产生遗传和表观遗传改变,导致异常基因功能;然而,挑战仍然确定关键监管控制机制,并将驾驶员区分开驾驶员可能具有较小但添加剂对癌症发育的影响。
通过DNA甲基化和组蛋白修饰的表观遗传调节调节染色质结构,进而激活或沉默基因表达。蛋白质组学方法是对这些分子研究的重要补充,因为癌症细胞的表型是由蛋白质决定的,不能仅靠基因组学或转录组学来预测。
本文重点介绍现有的技术平台和一些拟议的临床应用。我们在此说明“-组学”如何彻底改变了我们的肺癌生物学方法,并为肺癌的个性化治疗带来了希望。
“肺癌”系列
C. Brambilla编辑
本系列中的8号
肺癌是癌症相关死亡率的主要原因,全世界是男性和女性,每年都有> 100万人死亡1.尽管最近在诊断和治疗策略方面取得了进展,但是NONSMALL细胞肺癌(NSCLC)预后仍然贫困,5岁的总存活率为15%1.超过60%的患者被诊断为先进或转移性疾病,主要是由于缺乏早期诊断工具,随后没有资格进行手术切除。虽然手术提供了治疗的最佳机会,但5年的整体生存仍然令人失望50%2.最近的研究表明,基于铂族佐剂化疗可以提高存活3.,4,但哪些患者可能从中受益尚不清楚。近年来,一些高通量肿瘤分子分析的新方法已经被开发出来,并为癌症的创新诊断和治疗策略的发展提供了强有力的工具。基因组研究在提供肺癌分子生物学信息方面一直处于领先地位5,其次是明确的证据表明遗传和表观遗传改变都是推动致癌作用。最近,蛋白质组学方法被揭示至关重要,因为细胞的表型由蛋白质确定,并且不能单独通过基因组学或转录组科预测。实际上,蛋白质的表达水平与信使RNA的表达水平不相关6,蛋白质通常受翻译后修饰(如。磷酸化,糖基化),可能会改变它们的功能。本文对高通量分子分析的四个主要类别(基因组学、表观基因组学、转录组学和蛋白质组学)进行了评估,并总结了在肺癌生物学方面的经验教训及其即将出现的新的临床应用。
方法论方面
表1中提出了所选高吞吐量方法的摘要⇓.
基因组学
基因组学是对生物体的整个基因组的研究。相关技术中最重要的是高通量毛细管测序,对比基因组杂交(CGH)阵列和单核苷酸多态性(SNP)阵列。
全球基因组测序
全局基因组测序从凝胶的测序中进行了重大改进,以自动阅读TGCA寡核苷酸7- - - - - -9.一种更好的分离系统,称为毛细管电泳,允许DNA在毛细管中而不是在凝胶中进行分类,这使得DNA装载系统自动化,从而提高了吞吐量和速度。新的测序仪不使用旧的链终止范式;相反,合成测序技术将短片段的DNA与小珠子结合,然后将小珠子放入光纤芯片的孔中。DNA将另一个分子加入到它的链中。当这种情况发生时,测序者识别出哪个孔使用了T或G分子,表明序列中的下一个碱基是哪个。组装这些DNA片段是一个主要的挑战,可能需要在组装完整的基因组序列之前多次通过测序器。
表观组织
表观基因组学是对表观遗传修饰的大规模研究,即。不改变DNA序列的基因表达的可遗传变化,主要是DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰。
根据区分DNA序列中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的能力,可以使用不同的技术来检测DNA甲基化,如下:通过甲基化敏感或不敏感限制性内切酶进行DNA消化,通过亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠进行DNA化学修饰,并通过5-甲基胞嘧啶免疫沉淀分离基因组的甲基化和未甲基化部分。所有这些技术现在都与高通量技术相结合。早期的表观基因组方法使用定制的、基于玻片的cpg丰富区域阵列,这些区域与甲基化或未甲基化的DNA相对应15.后来,由于它们更好的精度和定量潜力,使用市售的高密度寡核苷酸阵列16.
到目前为止,没有高吞吐量的方法来研究组蛋白修改。然而,染色质免疫沉淀的片上技术是一种微阵列平台,在该微阵列平台上,免疫沉淀的DNA与已知探针杂交;它允许评估染色质州17.
转录组学
转录组学或基因表达的整体分析是对转录组的研究,转录组是基因组产生的一整套mRNA转录本。最常见的相关高通量技术是基因表达阵列(寡核苷酸和cDNA阵列)和microRNA (miRNA)表达阵列。
基因表达阵列
在过去的15年中,已经开发了用于半定量测量的方法,该方法在给定的肿瘤样品中的转录基因的相对丰度18.基因表达阵列主要利用基质拟合探针,分析样本的处理后MRNA模板将杂交。为此目的开发了两种主要类型的阵列:寡核苷酸和cDNA阵列。虽然前者使用在阵列基质上合成的短寡核苷酸,但后者阵列采用拷贝DNA的探针。在从肿瘤标本中提取的预处理和荧光标记的mRNA样品的杂交之后,阵列被扫描,并测量转录性丰度为信号强度的直接相关。在数据归一化之后,可以使用几乎无限的计算和统计方法分析数据。最常用于癌症标本研究的一般方法涉及用于无监督的聚类和监督学习方法的方法。虽然无监督方法允许根据特征的相似性允许自组织数据矩阵,监督学习方法可以产生可以区分的基因组或基因的特征先验的定义了肿瘤的子集。例如,可以根据临床结果(“存活率差”和“良好存活”组)来定义两组肿瘤。监督学习方法,例如涉及基于K-最近邻的预测方法的学习方法现在可以帮助识别转录水平最能区分两组的那些基因组19.为了使预装签名的过度录制的风险,这种方法通常涉及在单独的数据集中的预测器验证,或者通过将原始数据集分成学习和测试集中来验证预测器。在后一种情况下,预测器使用学习集构建,然后在测试集中验证。而且,预测器的稳定性通常由数据的随机置换进行测试。相比之下,分层聚类方法可以帮助识别未知的肿瘤的亚组先验的以典型的转录特征为特征。
miRNA表达阵列
miRNA是单链的,小(长度为18至24个核苷酸),非编码RNA通过结合并调节特异性mRNA的翻译来负调节基因表达。似乎每个miRNA调节多种基因的翻译,许多基因似乎由多个miRNA调节。miRNA微阵列能够比较不同组织的miRNA表达谱20.. 从肿瘤和正常组织中分离总RNA,然后使用电泳系统进行凝胶分离,该系统旨在加速小RNA分离和分离。每个样本的miRNA部分用不同的荧光团标记。标记的miRNA与玻片杂交,玻片上排列着多达1300个8到9个核苷酸的不同探针。计算癌症与正常miRNA的荧光强度之比,以测量特定miRNA序列表达水平的变化。
蛋白质组学
蛋白质组学是对蛋白质,特别是其结构和功能的大规模研究。已经开发了几种高通量技术。
二维凝胶电泳
这项技术依赖于聚丙烯酰胺凝胶,它首先根据蛋白质的电荷,然后根据它们的分子量分离蛋白质。用激光密度计对凝胶进行扫描,并用软件进行分析,使每一种凝胶能够半定量显示>500 - 1000个蛋白质21.感兴趣的单个蛋白点可以被消化成多肽,用于质谱(MS)序列分析。这一技术的最新改进是凝胶电泳(DIGE)的差异,该技术用于直接在同一凝胶上比较来自两种不同细胞类型的两种蛋白质混合物。这两个泳池用不同的荧光染料做了标记,混合在一起,在同一凝胶上运行22.来自两个库的相同蛋白质共同迁移,并通过定量荧光法独立检测。感兴趣的差异表达蛋白是通过改变两种荧光信号的比率来确定的。当样品在不同的凝胶上运行时,使用第三种荧光染料作为内部标准,允许在所有凝胶上的所有斑点标准化。该标准由包含等量的测试和对照样品的混合样品组成。
矩阵辅助激光解吸电离飞行时间MS
基质辅助激光解吸电离飞行时间MS(MALDI-TOF MS)是一种高通量技术,其分析具有在复杂的生物混合物中表达的高敏感性和特异性蛋白质,例如血清,尿液和组织23,24.它需要样品共结晶,其具有吸收激光能量的基质,然后将和将分子喷射到气相中。然后通过固定电位差从离子源加速离子源,并且在以与其成反比的速度到达速度之前米/z比率(较轻的离子比相同电荷较重的离子更快到达探测器)。每个离子撞击探测器所花费的时间就会产生一个信号,并表示米/z给定离子与特定强度的比值。该方法已广泛应用于生物标本的蛋白质组学分析,如下所述。
液相色谱串联质谱
该技术结合了高效液相色谱(LC)和电喷雾电离质谱,从液体溶液中电离和汽化蛋白质25.与该技术相结合的生物样品的多维分馏可以更深刻地询问蛋白质组。霰弹枪蛋白质组学分析平台使用具有特异性蛋白酶的样品的消化,通过强阳离子交换色谱法进行多维分离肽,例如在多维蛋白质识别(Mudpit)技术中26- - - - - -28或等电聚焦29,30.,然后反向相(RP) LC分离直接耦合到串联质谱仪器(MS/MS)(图1)⇓).序列选择最丰富的多肽进行MS/MS分析。由此产生的碎片离子,然后在第二次MS扫描分析根据他们米/z比率。根据碰撞细胞中产生的片段及其精确的分子量,可以推导出肽序列31.通过与数据库中相同标称质量的预测序列进行比较,识别出肽段,并推断出其来源的蛋白质。
“自下而上”或鸟枪分析的示意图表示。首先,蛋白质混合物被(胰蛋白酶)消化,产生的多肽被在线耦合到质谱仪的多维液相色谱(通常是强阳离子交换,然后是反相分离)分离。当他们洗脱时米/z首先确定肽的比例,然后从最丰富的肽信号(Y5,Y6和Y7是来自最丰富的肽信号的一个或多个质谱(MS)/ MS扫描米/z“y-ions”和b4的值是米/z“B离子”的值。从氨基末端延伸的片段峰被称为“B”离子,似乎从C-末端延伸的那些被称为“Y离子”)。重复该循环直至所有肽从中洗脱色谱柱。对于选择用于MS / MS的每种前体肽,从序列数据库中提取相似标称肿块的肽,导出预测的碎片模式在网上.然后将这些模式与实验碎片谱进行比较,以生成相关分数。一个蛋白质的阳性鉴定是基于对其序列中产生的两个或多个肽段的观察。
组织收集的注意事项
大多数发现努力基于在手术,支气管镜检查或其他诊断程序时获得的组织标本的收集,储存和处理。经过知情同意,所有生物标本都需要根据标准操作程序收集,并必须制定质量控制策略以保证样品的充分性。这需要临床医生,病理学家和研究协调员之间的一致努力。通过使用新鲜冷冻材料,最好使用使用生物流体或组织样品中的高通量技术的分析。肿瘤衍生的标记可能存在于血液和其他生物标本的较低水平处。因此,生物标本中分析物浓度的动态范围为成功分子分析增加了技术考虑的关键尺寸。与方法缺乏标准化有关的困难,导致不同研究结果与大多数发现努力翻译到临床实践的困难之间的巨大变化。为解决这些问题,已经进行了巨大的努力37,38,包括生物仓库和生物标本研究办公室(国家癌症研究所,Bethesda, MD, USA)。
使用福尔马林固定石蜡包埋组织有许多优点。它允许使用大量可用的组织集合,这是完全注释和更容易处理的。提取方法允许回收高质量的DNA, RNA和蛋白质,用于高通量发现和验证策略。然而,围绕保存方法的问题和可用的组织数量很少仍然使这些努力具有挑战性39.有前途的单分子测序和高通量癌基因突变分析代表了未来可能适用于对个性化医学的小临床样本的策略。但是,在下一代测序进入临床使用之前,必须解决成本,数据分析和解释问题。
肺癌高通量分子分析的生物推迟
通过系统重新排序在肿瘤中的基因重新排序发现关键突变
最近提供了丰富的临床相关信息来源的一个领域是肿瘤标本中基因的系统重测序。这些研究的灵感来自于观察到基因激活激酶代表了极好的治疗靶点。在系统性癌症基因重测序工作中,激酶是测序量最大的基因之一。这些项目的早期发现包括BRAF.甲状腺,结直肠和肺癌的突变,以及大多数恶性黑色素瘤40.一小部分BRAF.- 肺癌似乎是<5%,并且专门仅限于肺腺癌41.这一发现导致许多制药公司启动了专门针对特定目标的药物发现计划BRAF.- 依赖性肿瘤。调查研究这些药物的功效在几种肿瘤类型中正在进行42.是否BRAF.-突变型肺癌可以通过靶向下游通路成员的抑制剂成功治疗BRAF.仍有待建立。在另一项研究中,编码-1A类磷酸锶 - (3,4,5) - kkinase的催化亚基的基因中的突变(Pik3ca.),在大部分上皮癌症中发现43.肺癌中发现这些突变的频率是<5%的损伤,Pik3ca.是乳腺癌中最常突变的癌基因,也经常在结肠直肠癌中突变。在几种功能分析中,发现这些突变通过激活而致癌Akt生存途径44.最近,涉及新一代磷酸肌苷(PI.)3-激酶抑制剂提示携带这些突变的肿瘤可能只对这种治疗敏感45.由于其中一些药物目前正在进行早期临床试验,因此有相当大的希望,它们可能在临床有效的多种实体肿瘤。这一希望得到了观察的支持,即由致癌激活的受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤经常表现出激活pi3-激酶/Akt途径。
这些项目中最具突破性的发现是酪氨酸激酶表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)在〜10%的高加索人中突变,高达40%的东亚NSCLC患者46- - - - - -49.这些突变在东亚种族、从不吸烟和肿瘤组织学为肺腺癌的患者中富集。这些特征与那些在治疗时经历过反应的患者密切相关表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib或Gefitinib。事实上,外显子重新测序揭示了突变表皮生长因子受体对吉非替尼或厄洛替尼有反应的患者存在激酶结构域,但对无反应的患者没有。因此,突变体表皮生长因子受体似乎是另一个成功的治疗靶向致癌激活酪氨酸激酶的例子。不幸的是,所有患者最初对表皮生长因子受体抑制剂最终会复发。复发时肿瘤活检的系统遗传学分析显示第二位点突变表皮生长因子受体作为致病机制。这种突变T790M类似于T315i突变ABL.,导致最初回应伊马替尼的慢性骨髓白血病患者的获得性抗性50- - - - - -52.功能细胞和结构生物学研究已经正式证明了T790M突变在获得耐药性方面的致病性质。获得性抗性的另一种机制是德诺维放大遇见受体酪氨酸激酶基因53,54.重要的是,这种机制是通过细胞系实验中深入的细胞生物学和癌症基因组分析确定的,并随后在患者标本中进行验证。因此,这一发现进一步支持使用细胞系实验作为具有实质性临床相关性的临床前代理。
自发现以来,已经进行了无数的试验表皮生长因子受体肺癌突变的研究目标是确定表皮生长因子受体突变检测作为一种选择治疗患者的工具表皮生长因子受体抑制剂。虽然对这些试验结果的详细讨论超出了本综述的范围,但我们想强调一些中心结果。重要的是,试验选择患者的基础是表皮生长因子受体突变或临床特征表皮生长因子受体突变(亚洲人、不吸烟者、腺癌)持续产生超过70%的应答率,并导致中位总生存率超过20个月55- - - - - -59.虽然这些结果在社会上引起了广泛的兴奋,因为他们提出了一种有效的治疗肺癌患者的亚群,但它建议表皮生长因子受体突变是预后而不是预测性。这些结果最初由Eberhard研究支持et al。60建议表皮生长因子受体-突变患者具有较好的独立于治疗的总生存期。这是Eberhard的研究et al。60最近被Iressa非小细胞肺癌试验评估响应和生存对税前(利息)审判的结果证实61,这未能在整体生存中表现出益处表皮生长因子受体-突变患者使用吉非替尼。事实上,这个试验中的无进展生存率明显更好表皮生长因子受体-突变患者接受吉非替尼。最近,IRESSA泛亚研究(IPASS)试验的结果62比较吉非替尼和卡铂加多西紫杉醇在东亚从不吸烟或有吸烟史的腺癌患者中的疗效。这个试验不仅证实了明显的生存益处表皮生长因子受体-突变的患者接受吉非替尼治疗,但也显示表皮生长因子受体接受吉非替尼治疗的突变阴性患者预后最差。总之,这些发现表明表皮生长因子受体事实上突变是接受患者治疗结果的预测表皮生长因子受体抑制剂和没有表皮生长因子受体突变不应该用这些药物治疗;因此,表皮生长因子受体在治疗肺癌患者之前,必须进行突变检测表皮生长因子受体抑制剂。
在独立研究中,表皮生长因子受体拷贝数增益和扩增被发现是接受吉维替尼或奥尔特尼的患者治疗结果的更好标记而不是存在表皮生长因子受体突变55,63- - - - - -65.然而,关于用于突变检测的方法和拷贝数评估标准的方法提出了担忧。此外,使用常规测序方法的突变检测通过低灵敏度而受到阻碍,特别是在具有高蛋解细胞混合物的样品中(参见以下部分)。相比之下,染色体拷贝数增益的检测对样品杂质的敏感性远不太敏感。鉴于这一事实表皮生长因子受体突变与表皮生长因子受体复制号码收益和放大(66和r.k.Thomas,Max Planck德国Köln的神经学研究所;个人沟通),推测调查结果表明提出了预测的作用表皮生长因子受体复制数增益/放大可能反映了在EGFR-突变检测。
在解释报告体细胞致癌基因突变频率和临床相关性的研究结果时,一个重要的问题是,在癌症标本中最广泛使用的突变检测方法——双脱氧核苷酸测序67,受到低灵敏度的阻碍。特别地,这适用于具有非umuloural细胞混合的样品,在临床中分析了大多数活组织检查标本的典型特征。例如,在患者系列22种富集的标本中表皮生长因子受体先前使用Sanger方法进行严重测序的突变47,确定的决心表皮生长因子受体突变患病率显示,常规测序缺失了三个突变68.相比之下,最近发展起来的基因分析方法,最初设计用于快速基因组测序,能够对给定的肿瘤标本中所有等位基因物种进行准确和独立的取样。利用454 LifeSciences公司(Roche Diagnostics, Base, Switzerland)开发的基于阵列的皮滴定焦测序合成技术,在常规测序失败的样本中发现了致癌基因突变。该方法能准确检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织标本中的突变68.此外,它在极敏感的情况下提供了准确的突变诊断(如。降至1%的等位基因表示,并允许识别与抗抵抗力相关的Gatekeeper突变T790M表皮生长因子受体恶性胸腔积液标本中的抑制剂(图2)⇓).因此,在临床遗传诊断中使用新型基因组分析可以很容易地克服传统测序的巨大局限性。
在另一个名为OncoMap的项目中,为>的17个癌基因中的200个已知癌基因突变设计了基因分型分析,涵盖多个类别(如。受体酪氨酸激酶,细胞内酪氨酸激酶,丝氨酸苏氨酸激酶和小GTP酶)。将质谱基因分型方法(亮片)施加到覆盖多种肿瘤类型的1,000名人癌标本中的基因型本面板。这种方法是高度准确的,敏感的和特异性。最重要的是,由于这种方法的可扩展性和快速性,我们能够在实验时间的几周内进行全部1,000个肿瘤,并以合理的成本69.
完全表征主要人类癌症类型的基因组的努力70- - - - - -74透露,除了已知的癌症相关基因之外,许多额外的基因在个体癌症中突变。然而,大多数这些突变仅发生在单一的肿瘤中,这表明每个肿瘤由有助于肿瘤发生的单个突变组成。给定实体的每个肿瘤的平均突变数为48例胰腺癌中的48例为乳腺癌101例71.最终,将需要功能性细胞生物学实验来确定这些突变对致癌转化的个体贡献。这种努力需要在高通量下提供测定的细胞生物学,以应对高通量癌症基因组分析所发现的众多遗传病变。
最后,正在开发的技术将有助于提高基因组测序的吞吐量和灵敏度。考虑到与采用富含高肿瘤含量样本的发现导向基因组分析项目不同,临床上的典型诊断样本是一小块福尔马林固定的经支气管活检,具有大量坏死和大量炎性细胞。单分子测序或高通量癌基因突变分析等技术是如何解决这些问题的好例子,以确保准确诊断和目标治疗的最佳患者分层。
通过阵列CGH测定的肺肿瘤中稳定的基因组改变告诉我们肿瘤的行为
在过去的10年里,我们已经了解到,癌症中的细粒分子改变可以用于分类的签名75- - - - - -77,它们提供了预测患者生存的相关信息75,78,复发的风险79以及对治疗的反应76,80.尽管如此,NSCLC仍然在很大程度上作为一个单一的主要实体进行管理,使用类似的预防、诊断和治疗方法。染色体异常通常与分子异常相关,并为特定疾病背景下的基因发现和特征描述提供了一个起点81.在癌症生物学中,染色体异常具有诊断、预后和预测治疗反应的价值。桑格研究所癌症基因组计划的癌症基因共识82含有363个癌症基因,其中292是雌性通过易位激活癌症。最近的研究报告了138个基因组扩增的热点(跨104个人癌细胞系)83.作者在之前的研究中确定了约50%的推定癌基因显示基因组扩增。在肺癌细胞系中,平均每个基因组检测到32个扩增区域。综上所述,这些数据表明基因组扩增可能是致癌基因激活的一种常见机制。
基于高密度细菌人工染色体克隆、cDNA微阵列、寡核苷酸阵列或SNP阵列结合mRNA表达阵列的阵列CGH的使用,极大地提高了传统CGH的分辨率,并有助于在全基因组中识别新的候选基因84- - - - - -87.在肺癌的普遍染色体变化中,染色体3Q扩增是最常见的,并且是肺癌的早期事件以及航空消化道肿瘤88,89.肺癌中染色体3Q远端部分的扩增是肿瘤转化的主要特征90.它在肺癌发展的早期阶段被发现,包括严重的支气管发育不良,并在整个癌症的进展和转移阶段保持91. 吸烟史和3q扩增之间的因果关系已被提出,但尚未得到证实。扩增子的大小在肿瘤之间差异很大,范围从染色体3q22到3qter,鳞状细胞癌中最常见的扩增区域在3q26到3q29之间(∼35 Mb)。高通量技术最终将允许整合复杂的分子分析,并阐明这种扩增子在肺癌中的作用。
在致癌物的领域的气道上皮:致癌战场
致癌物暴露诱导弥漫性上皮损伤,遗传变化和遗传/恶性病变在领域的一个地区,代表整个领域的癌症发展风险增加。吸烟对气道转录组的影响一直是最近调查的主题。
其中一种调查,使用Affymetrix HG-U133A和HG-U133加上2.0阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)学习小型气道支气管上皮,在表型正常吸烟者中明显上调300个基因(n = 16) compared to matched nonsmokers (n = 17), including genes coding for response to oxidants and xenobiotics, immunity and apoptosis92.此外,显示了表型正常吸烟者中小气道上皮基因表达的可变性,表明遗传因素响应吸烟93,94.
基因表达模式发生在支气管气道上皮细胞获得通过高密度寡核苷酸微阵列分析探索了来自健康流动,前和非吸烟者的支气管镜检查95.涂刷主干支气管获得气道上皮细胞。RNA被分离、加工并杂交到Affymetrix HG-U133A阵列上。在那个研究中,斯皮拉et al。95鉴定的基因表达改变发生响应烟雾暴露,并证明了许多基因的表达与累积烟草暴露相关。使用Affymetrix HG-U133A微阵列,同一组进行了由经历柔性支气管镜检查的当前和前吸烟者获得的组织学普通大型气道(主干支气管)上皮细胞胶质的基因表达分析作为在四个医疗中心怀疑肺癌的诊断研究96.每个受试者都被跟踪,直到最终诊断为肺癌或做出替代诊断。在77个样本的训练集中,他们确定了一个80个基因的生物标志物,用来区分吸烟者是否患有肺癌。该生物标志物在独立测试集(n = 52)上进行了测试,准确率为83%(80%敏感,84%特异性),随后在5个医疗中心独立获得的前瞻性序列上进行了验证(n = 35)。这些结果表明,烟草烟雾诱导了整个气道上皮的癌症特异性损伤区域,具有潜在的诊断和/或风险标记价值。最近,同一组使用了临床和组合基因组模型,证明了生物标志物独立于其他临床因素,并显示了更高的预测准确性(图3)⇓)97.在患有肺癌的患者中,该标记可以提高组织学评估的诊断敏感性,并减少使用侵入性和昂贵的额外诊断测试。此外,它可以作为肺癌发展风险的候选生物标志物,作为化学预防策略的反应的中间端点生物标志物。
基因组对肺癌临床预测模型的附加价值。联合训练和测试集的受试者工作特征曲线(n = 118),包括因怀疑肺癌而接受支气管镜检查的吸烟者。临床模型(····)包括三个变量:年龄、肿物大小和淋巴结病变;临床基因组模型(-)包括以前的变量和生物标志物评分。临床模型和临床基因组模型曲线下面积分别为0.89和0.94,两者曲线下面积差异显著(p<0.05)。复制从97,并得到出版商的许可。
基因表达谱分析致癌途径的潜力
致癌物是一种复杂的方法,其特征在于多种独立的遗传改变的积累,通常涉及过表达的癌肠和肿瘤抑制基因的丧失。这些遗传改变破坏了细胞信号传导途径的正常调节,对控制细胞生长,分化和凋亡是必不可少的。几项研究表明了基因表达谱的潜力来分析致癌途径并描述癌症表型的复杂性98- - - - - -102..
在最近的一项研究中,在用腺病毒感染静止的原发性乳腺上皮细胞感染激活途径的基因表达曲线以表达相关基因和人工激活感兴趣的途径103..每个标记准确评估相应通路状态的能力通过内部验证措施得到验证,通过使用三种小鼠肿瘤模型(小鼠乳腺肿瘤病毒-Ras, Myc E2F3)通过使用成人小鼠肿瘤拉通过同源重组激活活性。然后在NSCLC样品中评估途径活动。拉在大多数腺癌中发现途径放松管制,而不是鳞状细胞癌,表明其在腺癌发育中的作用。肿瘤高拉活动也被预测为低水平Myc,E2F3,β连环蛋白和Src活动,以及反之亦然.放松的病人拉与β连环蛋白,Myc和Src构成了贫困人口贫困人口。最后,研究人员成功地使用途径放松调节签名来预测靶向癌细胞系中相应途径的治疗剂的敏感性。本研究是综合途径分析如何发展我们对致癌作用的良好说明。此外,在组织学和结果方面,这种方法可能有助于更好地分类肺癌患者,并试图解决个性化治疗的需要。最后,该策略代表了一个有前途的工具,用于指导使用组合的靶向疗法。
表观遗传事件在肿瘤进展中的作用
最近,越来越清楚的是,表观遗传事件,如DNA甲基化和组蛋白修饰,也是肿瘤进展的中心。
基因组DNA低甲基化,导致基因组不稳定,以及异常启动子高甲基化,导致肿瘤抑制基因失活104.,已被证明是人类癌症中的常见事件。在肺癌患者中,血液中检测到启动子高甲基化105.,支气管灌洗106.、诱导痰107.和胸膜液108..TP16在临床诊断鳞状细胞癌的临床诊断之前,在吸烟者痰中发现启动子甲基化。在鳞状细胞癌的临床诊断之前109.,因此被提议作为肺癌早期检测和监测预防试验的生物标志物110.,111..此外,四种基因的启动子区的甲基化(TP16,CDH13,Rassfia和APC.)与早期复发相关(图4)⇓)112..随着高通量技术的发展,发现了新的异常甲基化靶基因113.,114..其中一个的蛋白表达,通过简单地去除OLIG1,肺癌患者的存活率显着相关115..
TP16和CDH13患者I阶段Ⅰ期Nonsmall细胞肺癌患者的甲基化与早期复发相关。当TP16和CDH13都甲基化在肿瘤和纵隔节点中时,无比TP16和CDH13未甲基化(61.2%(95个),递归存活率显着降低%CI,49.7-70.9); P <0.001)。- :甲基化(n = 11);········:未甲基化(n = 80)。复制从112.,并得到出版商的许可。
染色质是基因表达调控中的重要球员,其结构的改变与癌症发育联系,通过DNA甲基化以及组蛋白的超 - 乙酰化(取决于靶基因)。乙酰化状态与转录活性有关,已经表明,活性组蛋白乙酰化在重新表达沉默的肿瘤抑制基因中起作用116..最近的研究表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂对非小细胞肺癌有抗肿瘤活性117.- - - - - -119..
miRNA表达的改变可能导致癌症相关基因的失调
通过基因表达调控,mirna似乎参与了多种细胞功能,如增殖、分化、死亡和抗应激120..据报道,MiRNA的表达水平在人类癌症中表达了不受约理,表明在血管生成中的作用。
在一项分析104对非小细胞肺癌和相应的正常肺组织的研究中,43个mirna的表达谱区分了肺癌和非癌肺组织121..六个mirnas(Hsa-mir-205、hsa-mir-99b、hsa-mir-203、hsa-mir-202、hsa-mir-102和HSA-MIR-204-PRE)在腺癌和鳞状细胞癌中差异表达,表达水平更高hsa - mir - 99 b和hsa - mir - 102在腺癌。此外,高HSA-MIR-155、低hsa-let-7a -2表达与肺腺癌低生存率相关(p = 0.033)。这一观察结果通过RT-PCR分析得到证实,并与一组独立的腺癌进行了交叉验证。在另一项143例手术切除的非小细胞肺癌研究中,低让7表达也显着与较短的存活率相关(p = 0.0003);和过度表达让7A549肺腺癌细胞株抑制肺癌细胞生长在体外122..
NSCLC中的差异表达的miRNA基因经常位于脆性位点和/或具有频繁拷贝数改变的染色体区域,表明MiRNA表达的差异可以通过基因组改变诱导。然而,由于50%的MiRNA位于与癌症相关的染色体区域,因此也怀疑miRNA作为癌肠或肿瘤抑制基因的作用。miRNA表达型材代表肺癌诊断,分类和预后的潜在标志物。然而,观察到研究之间的不一致,可能是由于技术和分析差异以及缺乏标准化。
蛋白质组学检测翻译后修饰的重要性
蛋白质的翻译后修饰,例如磷酸化,糖基化和蛋白水解加工,是常见事件,并且具有显着修饰蛋白质功能以及赋予细胞或组织特异性的潜力。与基因组分析不同,蛋白质组学分析具有检测这些修改的能力。
酪氨酸激酶信号传递说明了翻译后修饰的重要性,而酪氨酸激酶信号传递在癌症中经常被解除调控。在一项基于磷酸肽免疫沉淀和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析的磷蛋白组学研究中,酪氨酸激酶信号在41个NSCLC细胞系和150个NSCLC肿瘤中被鉴定123..激酶已被称为癌症(如。表皮生长因子受体和c-MET),以及以前从未涉及非小细胞肺癌的激酶(PDGFRα和DDR1)已确定。在以酪氨酸激酶为基础的靶向治疗的实际时代,本研究提供的见解特别有趣。
如前所述,组蛋白修饰代表了有助于致癌作用的翻译后修饰的另一个例子。由于翻译后修改是可逆的,因此开发了抑制这些修改的药物并对肺癌治疗具有巨大的希望。蛋白质组学策略通过不仅鉴定翻译后修饰,而且具有重要作用,还具有重要的作用,也具有对其抑制剂诱导的变化的量化和监测。
聚糖参与癌症生物学
糖类技术地址糖,无论是自由还是存在于蛋白质或脂质的复杂分子中。糖可以驱动一系列与癌症发育有关的分子过程。以下几个例子说明了这一点。
黏蛋白是高度O通过上皮细胞合成的糖基化蛋白质,并且它们的糖基化图案可以在炎症或肿瘤转化期间改变。腹膜上皮和鳞状细胞癌显示出异常模式的粘蛋白表达。然而,鳞状细胞癌和腺癌显示出类似的粘蛋白基因表达模式,支持常见细胞来源的概念124..最近的结果已经发现了死亡受体之间的新联系O-糖基化和凋亡信号。O糖基化的DR4.和DR5.促进配体刺激的聚簇DR4.和DR5.,调解招聘和激活Caspase-8125..
N通过改变其诸如细胞信号传导和细胞粘附的功能,认为受体或粘附分子的糖粉被认为是细胞功能,这涉及癌症侵袭和转移126..例如,缺乏核心岩藻糖基化表皮生长因子受体导致抑制表皮生长因子(egf.)信号传递和细胞生长127..NMS的血液蛋白质的糖基化分析已被证明是在例如胰腺癌中的概念研究证明中有价值128..确定正常、侵袭性和侵袭前病变的血清聚糖谱可能具有重要的诊断、预后和治疗意义。凝集素代表高度通用的碳水化合物结合蛋白,用于分析糖蛋白129..这是一个新兴的领域,目前其应用(糖蛋白富集和糖蛋白图谱)在平台和实验室中的变化很大。
人血清中的糖蛋白在许多生物过程中起重要的作用126.,130.,131.并且还具有临床价值作为疾病进展和治疗的生物标志物132..例如,用多凝集素亲和层析法从血清中分离出糖蛋白,先由多肽酶消化N-糖苷酶F和胰蛋白酶。肽已通过纳米LC-MS/MS进行分析,发现大多数已鉴定的蛋白质含有一个以上的潜在糖基化位点。比较健康人和腺癌患者的血清糖蛋白组,发现38种癌症选择性蛋白133..他们作为候选生物标志物的价值需要在预期研究中进行测试。在来自180名无可切除和转移性NSCLC患者的另一个数据集中,在100 mg·m的六种多西紫杉醇期II研究中注册−2, α - 1酸性糖蛋白被发现是反应的独立预测因子,优势比为0.44 (p = 0.0039)。134.. 唾液酸化糖蛋白IL-6已被证明可预测癌症患者的不良预后表皮生长因子受体用吉非替尼治疗的水平的NSCLC135..高表达某些类型肿瘤相关碳水化合物抗原的肿瘤(炸玉米饼)表现出比表达低水平的转移和进展炸玉米饼,这反映在患者生存率下降136..
糖缀合物是肺癌研究的一个新领域,为生物标志物和治疗靶点的开发提供了广阔的前景。然而,这一领域的研究受到固有复杂性的挑战,需要改进分子测序和生物信息学。
高通量技术的选定应用,以解决临床问题
肺癌风险评估
虽然80-90%的肺癌可归因于吸烟,但只有少数吸烟者会发展肺癌142.,143..此外,10-20%的病例发生在从不吸烟者和家族风险已被描述144..这表明基因-环境在疾病发展中的相互作用,以及吸烟者和不吸烟者的不同分子机制。选择性的表达表皮生长因子受体NOSCLC中非吸烟者的突变支持了这一假设。
肺癌的家族性发生在肺癌患者52例肺癌患者的基因组 - 宽联动分析中,其局限于含有许多感兴趣基因的肺癌敏感性基因座(SASH1,LATS1,IGF2R,Park2.和TCF21.)145.,其中一些似乎经常通过甲基化而灭活146.,147.;然而,在该基因座中未鉴定出通过突变灭活的肿瘤抑制基因。
几种案例对照研究,重点关注改变风险的易感性的基因,以解决为什么只有少数吸烟者发展肺癌,并发现致癌物质代谢酶的多态性148.和DNA修复酶149.,150.,以及基因对吸烟行为的影响151..最近,一项全基因组关联研究进行,以确定常见的影响非小细胞肺癌风险的低外显率等位基因152..研究人员分析了1154名吸烟的肺癌患者和1137名吸烟者的315450个SNP标记。10个与肺癌最显著相关的SNP在另外两个大数据集中进行了测试。他们发现了两个与肺癌风险显著相关的SNP,它们都位于染色体区域15q25.1,并归位了三个基因:CHRNA3和CHRNA5(烟碱乙酰胆碱受体α亚基3和5)和PMSA4(蛋白酶体α 4亚基亚型1)PMSA4在肺癌中,烟碱乙酰胆碱受体途径涉及肺癌发病机制和进展153.- - - - - -155..另外两项大型遗传流行病学研究报告了非常相似的结果,说明肺癌中的基因环境相互作用,并进一步征收这种基因组区域在肺癌的发病机制中156.,157..综上所述,这些数据表明尼古丁乙酰胆碱受体是潜在的化学预防靶点。
还需要进一步的研究来阐明肺癌发生的机制,并随后确定有患肺癌风险的患者。这些被选中的人群可能受益于化学预防和仔细的监测,这可能最终改善结果。
基于血液的早期检测和非血迹诊断肺癌
发现用于肺癌诊断的生物标志物标记或图谱是至关重要的,因为单个生物标志物本身不太可能具有足够的特异性和敏感性,不足以证明其临床应用价值。这些新出现的技术,结合循环蛋白/多肽来自肿瘤灌注的假设,重新唤起了人们对癌症患者血液蛋白质组分析的长期兴趣。由于血液获取容易、快速、易于重复测量,这种生物标本对于生物标志物应用于肺癌的早期诊断、疾病状态监测、靶向治疗的发展、对治疗反应的评估和生存期非常有吸引力。它可以提高我们的诊断准确性,减少目前需要开胸手术的恶性细胞的病理证据。
已经在肺癌中研究了几种血清生物标志物,但由于它们的敏感性和/或特异性有限,特别是在早期疾病中,尚未证明在临床实践中158.- - - - - -160..
一组研究人员对100名患者(50名肺癌患者,50名对照组)的训练血清进行了6种血清蛋白的分析,其中4种蛋白是由蛋白质组学(2DIGE和MALDI-MS)发现的,另外2种已知与癌症相关。161..他们发现其中四种蛋白质(癌胚抗原,视黄醇结合蛋白,α1-抗胰蛋白酶和鳞癌抗原)能够区分肺癌病例和对照,敏感性为89.3%,特异性为84.7%。当应用于独立验证集(50例肺癌,50例对照)时,四种蛋白标记达到了77.8%的敏感性和75.4%的特异性,而四种标记单独使用时没有一种具有足够的诊断能力。MALDI-MS还用于分析288名非小细胞肺癌患者和对照组的未耗尽和未分离的血清,对照组分为训练组(92例,92例对照)和试验组(50例,56例对照)162..发现了七信号蛋白质组学签名,将肺癌病例和对照细准的78%,灵敏度67.4%的灵敏度和88.9%的特异性区分为78%;72.6%的准确度,58%的灵敏度和试验集的特异性为85.7%。此外,血清签名与肺癌诊断有关,独立于吸烟历史和水平c反应蛋白,炎症的标志物。虽然基于MS的肺癌蛋白质组学分析允许发现新型诊断生物标志物,但它们的应用仍然仅限于实验室使用。因此,他们的翻译需要人口研究进入诊所。
肺肿瘤级发现和课程预测
非小细胞肺癌样本的微阵列分析结合类发现方法表明,基因表达谱能够准确地将肿瘤分为经典的组织学组,也能够识别组织学亚组163.- - - - - -166..该信息很重要,因为治疗方法可以不同于组织学组甚至亚组。使用Affymetrix U133A基因芯片(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)分析129个鳞状细胞癌,一项研究定义了两种鳞状细胞癌亚组,具有不同的整体生存167..三项其他研究发现腺癌亚组76,164.,168..这三项研究中的每一项都定义了不同数量的腺癌亚群,质疑基因表达微阵列对肿瘤分类的重复性和一致性。样本异质性、样本大小差异和分析平台差异可以解释其中一些结果169..
蛋白质组学肿瘤分析也允许肿瘤级预测和发现。当通过使用MALDI-TOF MS分析79 nSCLC和14正常冷冻的肺组织切片时,选择差异表达的MS信号并定义了使用建立方法的类预测模型170..研究人员发现75%的准确特征允许肺肿瘤通过组织学分类171..他们将这种方法扩展到侵袭前病变的分析,以区分侵袭前病变的低级别和高级别172..这些努力尚未在临床实践中得到应用。这些候选生物标志物的验证需要在更大的研究机构和实验室中进行前瞻性验证,并必须证明其在当前肺癌管理中的临床效用。
预测预后
预测预后可以通过确定哪些患者更有可能从治疗中获益来改善对肺癌患者的管理。
基因表达谱表明可能预测肺癌患者存活的可能性。实际上,在分析86腺癌的研究中,在低风险和高风险患者组之间差异表达了50个基因75.结果在由62名腺癌组成的独立数据集中验证。几个阶段肺癌患者与第三阶段患者聚集到贫困预后组中,表明基因表达谱在诊断时与病理阶段无关,因此提供了增加的预后价值。预测预后的37基因签名也被鉴定为86个腺癌的队列173..当应用于独立的84个腺癌群组时,签名将患者分成三种预后群(良好,中等,差),精度为96%。在使用寡核苷酸微阵列的另一份报告中,以确定基因表达的比率,以评估切除的阶段I腺癌中复发性的风险(在验证试验中的试验组中的66中,有三维试验预测与> 90%的精度复发174..此外,在89早期NMSCLC上进行的基因表达微阵列在手术切除后比临床预测因子更好地预测复发的曲线80.当施加到25和84早期NSCLC的两个独立队列时,预测精度分别为72%和79%。还鉴定了高风险阶段IA患者的亚组,这是可用的,因为这些患者可能是那些可能从佐剂化疗中受益的人。Meta-Analyzes还确定了预测标记169.,175..在交叉研究的比较中,与预后相关的基因表达谱的可重复性较差,尽管在比较的三项研究中有14个基因准确预测了生存率169..
最近,来自多个机构442肺腺癌的汇总分析建立了在考虑任何临床应用之前的不同患者群体和不同实验室的基因表达签名的表现176..调查人员分析了单独或结合临床数据的基因表达数据是否可用于预测肺癌患者的整体存活;测试了几种模型。当单独使用基因表达数据时,仅在两个验证数据集中的所有病理阶段进行一致的统计显着性(八个)的两个模型(八个)进行了危险比(HR)> 1。当结合临床和基因表达数据时,两种模型中的HR> 2具有改善结果预测。本研究确定了基于临床和基因表达微阵列数据的存活预测因子,在结合临床和分子数据时预测存活率更好。
蛋白质组学研究也已用于鉴定预后标志物171.,177..在最近的研究中177.,MALDI-MS用于分析手术切除NSCLC的蛋白质谱。在训练集(116个NSCLC和20个对照)中,发现患有高和低复发风险患者之间的25信号特征,发现无复发和整体存活。在独立验证集(58个NSCLC和七种对照)中,签名也与整体存活率显着相关,并且仅在I阶段病患者中进行复发存活。通过比目前使用的预后因素更准确地预测(如。组织学、肿瘤、淋巴结、转移(TNM)分类等,这些特征表明哪些患者术后可能复发,并可能有助于决定何时进行全身辅助治疗是有益的。最近,MALDI-MS鉴定的预后候选特征蛋白成员被肺癌TMAs免疫组化(IHC)验证178.. 综合IHC得分钙调蛋白,胸腺素β4和胸腺蛋白β10.与生存相关。这种组合策略由MALDI-MS的识别组成,后者由IHC验证代表在为临床环境中为试验中进行测试之前的关键步骤。
预测治疗的反应
NSCLC中化疗的总体反应<30%。因此,巨大的努力寻找可以识别实际受益于特定治疗的患者,并且不会遭受其副作用的生物标记。这些标记有助于确定最佳的治疗策略。
在一项使用寡核苷酸微阵列分析16个NSCLC样本(8个在训练集中,8个在验证集中)的研究中,溶酶体蛋白酶抑制剂Serpin B3和半胱氨酸蛋白酶抑制物C预测铂基化疗的临床反应,精度为72%179..另一组比较了微阵列数据在体外各种癌细胞系的药物敏感性数据,发现基因表达谱预测对个体化学治疗药物的敏感性(Topotecan,Adriamcin,依托泊苷,5-氟尿嘧啶,紫杉醇,紫杉醇,环磷酰胺),以> 80%精度的独立设定验证180..使用已发布的数据集,调查人员显示了在体外- 生成的型材能够预测对具有> 81%的单个药物的临床反应,以及对多药中的方案。在肺癌病例中,多西紫杉醇敏感的个体可能抵抗依托泊苷。研究人员还将化疗敏感性的基因表达鉴定与已知的致癌途径的基因表达鉴别联系起来,并发现了重要的关联pi3-激酶途径放松管制和多西紫杉醇的抵抗力,暗示使用潜在的利益pi3-激酶这一亚组的抑制剂(图5)⇓).
预测化疗敏感性与致癌途径失调的关系。a)在一系列肺癌细胞系中,致癌途径放松作为多西紫杉醇预测敏感性的函数的概率(红色:敏感;蓝色:耐药)。b)在细胞增殖试验中,通过对药物的敏感性测量,显示出磷酸肌醇3-激酶(PI3K)激活可能性增加的肺癌细胞系更有可能对PI3K抑制剂产生反应(p = 0.001, log-rank检验)。c)此外,预测多西他赛耐药的细胞系更可能对PI3K抑制敏感(p<0.001, log-rank检验)。Src:禽肉瘤(Schmidt-Ruppin A-2)病毒致癌基因同源物;Ras:大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物;E2F3: E2F转录因子3;Myc:髓细胞瘤病毒癌基因同源物;集成电路50:半最大抑制浓度。复制从180.,并得到出版商的许可。
识别可能从中受益的NSCLC患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗,MALDI-MS对302名接受吉非替尼或厄洛替尼治疗的患者(139名患者来自分配到训练组的三个队列,163名来自分配到验证组的两个队列)以及158名未接受吉非替尼治疗的患者的治疗前血清进行了检测表皮生长因子受体TKI.181..基于八个MS信号的算法成功鉴定了改善的生存和进展时间的患者表皮生长因子受体TKI治疗,独立于临床因素相关的敏感性表皮生长因子受体TKI(图6⇓).该算法没有准确地分类未治疗的患者的结果表皮生长因子受体TKI。
![图6 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/34/2/489/F6.medium.gif)
Kaplan-Meier分析东方合作肿瘤组验证队核查队的整体生存(n = 96)。这些患者患有先进的Nonsmall细胞肺癌,单独用厄洛替尼治疗第一线。红色的;无贫困的无效分数;绿色:无事实的一小部分;------:95%的置信区间;|:审查患者。复制从181.,并得到出版商的许可。
几项研究发现预测对治疗的反应的标记。但是,对于所有这些,需要预期验证研究以确认其在临床环境中的效用。
结论和未来的观点
本综述凸显了新的全球分子方法对我们对肺癌生物学的理解的影响以及肺癌患者的个性化管理。这里提出的研究说明了“ - 中学”时代如何彻底改变了我们对癌症生物学的方法。基因组学一直是开创性的,为我们的知识提供了坚实的基础。最重要的是,基因组学导致临床意义发现。尽管基因组学仍然是领域,但外形遗传学和蛋白质组学的兴趣日益增长。最近,蛋白质响应抗癌药物的动态已经证明癌细胞根据其结果(细胞死亡或生存)不同,突出了蛋白质组学的重要性,帮助我们了解对药物的个体分子反应182..糖组学和脂组学的早期领域也有希望提高我们对肺癌生物学的理解。
然而,前方还有许多挑战。虽然这些高通量技术有望将个性化的肺癌治疗带到临床,但该领域还需要对大型发现策略中出现的候选生物标志物进行仔细验证。这些高度维度和复杂数据的整合将需要生物信息学和生物统计学方面的重大努力。在模型显示出这些技术的互补性之前,将需要一段时间来进行测试。另一个主要挑战是研究疾病过程而不是疾病状态,并以高通量的方式进行研究。我们需要改进研究致癌过程动力学的方法。从生物标志物的角度来看,在风险队列中重复测量生物标志物在未来将是至关重要的。例如,血浆DNA的鉴定183.,循环肿瘤抗原或与其相关的自身抗体184.,185.为早期癌症诊断提供了有吸引力的手段,并为治疗提供了先导。基于患者血清中对肿瘤抗原的自身抗体的检测对于早期发现癌症可能是非常重要的,因为抗致癌物刺激的抗体可以在肿瘤表型出现之前就被检测出来。代谢组学等新研究领域的未来取决于其监测代谢组中细微变化的能力,这些变化发生在检测到反映疾病的总体表型变化之前。“组学”的综合分析可能提供更敏感的方法来检测与疾病过程相关的变化,并发现有用的新生物标志物。
支持声明
该工作得到了国家卫生院校,龙孢子CA90949,Damon Runyon Cancer Research Foundation(纽约,纽约,美国; CI No.19-03),以及美国退伍军人事务部的绩效审查授予to P.P. Massion. S. Ocak was supported by a grant from the Université Catholique de Louvain (Belgium) and an IASLC Lung Cancer Fellowship Award.
感兴趣的语句
R.K.Thomas的利益声明可在www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl.
脚注
以前的文章在本系列中:1号:De Wever W,Stroobants S,Coden J,et al。综合宠物/ CT在非球体细胞肺癌的分期中:肺癌的技术方面和切除。EUR RESPIR J.2009; 33: 201–212.2号:rami-porta r,Tsuboi M. sublobar切除肺癌。EUR RESPIR J.2009;33: 426 - 435。3号:McWilliams A,Lam B,Soutedja T.早期近端肺癌诊断和治疗。EUR RESPIR J.2009;33:656-665。4号:晚期非小细胞肺癌的一线和二线治疗。EUR RESPIR J.2009;33: 916 - 930。5号:van Tilburg PMB、Stam H、Hoogsteden HC、,et al。肺癌患者术前肺功能评估:文献综述。EUR RESPIR J.2009;33: 1206 - 1215。6号:肺癌信号通路的发病机制:治疗路线图。EUR RESPIR J.2009;33: 1482 - 1497。7号:Horváthi,Lázárz,林莱N.Kollai M,Losonczy G.呼出生物标志物在肺癌中。EUR RESPIR J.2009;34:261-275。
- 已收到2009年3月15日。
- 接受2009年4月3日。
- ©ers Journals Ltd
参考
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