文摘
囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)基因编码一个环腺苷酸(营)端依赖氯通道位于主要在上皮细胞顶膜。在肺动脉的细胞,大量的氯通道已经被识别和描述,而不是雌性生殖道。因此,雌性生殖道的存在和功能研究在大鼠肺内的动脉。
雌性生殖道表达式,本地化和功能分析在平滑肌细胞培养使用逆转录酶聚合酶链反应和免疫沉淀反应(RT)其次是蛋白激酶磷酸化,分别immunolocalisation和碘射流试验。雌性生殖道的作用在肺vasoreactivity决心动脉环使用一个器官浴系统。
rt - pcr和免疫沉淀反应分析,以及immunolocalisation研究中,发现雌性生殖道基因转录和蛋白的表达。碘射流试验显示功能营地的存在,钙和用电量的氯通道。此外,下面的效果被发现:1)抑制forskolin /碘化genistein-activated流出格列本脲,diphenylamine-2-carboxylic酸和CFTR-specific抑制剂(雌性生殖道异烟肼)-172年;2)激活benzoquinolizinium碘流出的导数雌性生殖道活化剂MPB-07和产甲烷- 91;和3)抑制MPB-dependent雌性生殖道的流出异烟肼-172年。最后,雌性生殖道活化剂浓度诱导血管舒张和苯肾上腺素环preconstricted,内皮的存在与否。
目前的结果是第一次揭示功能环腺monophosphate-regulated囊性纤维化跨膜电导调节导致endothelium-independent动脉细胞在大鼠肺内的血管舒张。
囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道是一个环腺苷酸(营)端依赖氯通道表达在上皮细胞顶膜衬腔的支气管树和消化道1。雌性生殖道被普遍认为是专门为雌性生殖道上皮细胞表达,直到证据表达nonepithelial组织出现。雌性生殖道在心肌细胞中表达2、脑3和endothelia4,最近被发现在气管平滑肌细胞(smc)5和主动脉smc的老鼠和老鼠6,7。尽管雌性生殖道表达谱,临床图片CFTR-related疾病囊性纤维化的病人似乎与心脏无关,血管和大脑功能障碍。因为真正选择性催化剂和抑制剂也缺乏,雌性生殖道的作用在这些组织仍然悬而未决。然而,雌性生殖道的药理学最近的进展,提供几个雌性生殖道催化剂,如染料木黄酮和benzoquinolizinium衍生品6- - - - - -8,以及受体阻滞剂,如thiazolidinone复合CFTR-specific抑制剂3 - ((3-trifluoromethyl)苯基)5 - ((4-carboxyphenyl)亚甲基)2-thioxo-4-thiazolidinone(雌性生殖道异烟肼-172)9。
几个Cl- - - - - -电导平滑肌中描述,包括肺动脉。在Cl- - - - - -渠道表达smc,广泛的研究探讨calcium-activated Cl的含义- - - - - -电流(我Cl, Ca),诱发细胞内钙浓度上升([Ca2 +]我)10。尽管分子的性质我Cl, Ca仍然是未知的,它的作用在静止膜电位和血管张力为肺动脉被描述11- - - - - -13。
关于volume-sensitive Cl- - - - - -通道(我Cl,膨胀),Cl的成员- - - - - -通道(ClC)基因家族的良好候选分子我Cl,膨胀基础,ClC-3最近提议我Cl,膨胀在大鼠和犬肺动脉14。有趣的是,ClC-3调节肺高血压大鼠14。它也是值得注意的Cl的贡献- - - - - -渠道是增强基底语气和norepinephrine-induced萎缩肺高血压大鼠15,16。
一个cAMP-dependent Cl- - - - - -通道也被描述在老鼠和牛肺动脉17,18。这个通道是涉及cAMP-induced肺血管舒张、肺动脉SMC (PASMC)迁移和形态变化。然而,这样一个通道的分子身份仍然未知的肺动脉,可能与雌性生殖道。
尽管雌性生殖道出现在主动脉smc6,7,Cl- - - - - -通道是重要的因素在生理和病理生理学的肺动脉,没有研究调查的表达和功能作用的雌性生殖道肺动脉。因此,目前的研究集中在肺内的动脉(IPA)和调查了这艘船的雌性生殖道的表达,然后探索cAMP-dependent碘流出,其药理学和雌性生殖道的作用催化剂在肺血管舒张。
方法
组织准备
雄性Wistar鼠(年龄在8 - 10周)(Le Genest-Saint-Isle Janvier,法国)被惊呆了,然后被颈椎脱位根据当地的动物保健和使用委员会(协议号AP2/11/2005阿基坦地区伦理委员会的熟知/要数普瓦图-夏朗德大,法国)。心脏和肺被切除,放置在Krebs-Henseleit (KH)解决方案,这包括118.4毫米氯化钠,氯化钾4.7毫米,2.5毫米CaCl2,1.2毫米MgSO4,1.2毫米KH2阿宝425毫米NaHCO3和11.1毫米d葡萄糖(pH值7.4),和15%氧气/二氧化碳5% / 80%饱和氮。音标的第一顺序从左肺解剖免费从周围的结缔组织KH的解决方案。
细胞培养
整个心肺准备迅速移除和冲洗培养基(杜尔贝科修改鹰介质/玫瑰(pH值7.3)补充penicillin-streptomycin 1%, 1%的丙酮酸钠和1%的非必需的氨基酸)。异丙醇在培养基在无菌条件下切割,切成几块(1 - 2毫米2)。smc是获得这些外植体和培养如前所述5。所有的细胞都从这些外植体应用使用单克隆抗体anti-smooth肌肉α-actin (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier,法国),而他们的负面标签与内皮一氧化氮合酶抗体(BD转导实验室,Le Pont-de-Claix法国;数据未显示),证明人口smc的存在。
分析逆向transcriptase-PCR雌性生殖道mRNA的表达
总RNA提取使用RNABIe®(Eurobio、Courtaboeuf、法国),根据制造商的协议。互补DNA作为模板与PCR引物PCR特定鼠雌性生殖道的基因19:cfrex3 (5′-GCGATGCTTTGTCTGGAGATTC-3′)和cfrex6a (5′-CCACTTGTAAAGGAGCAATCCATA-3′),生成该地区222年和625年之间核苷酸。管家β-actin基因(加入基因库。NM031144)被用来控制,引物r-acti4 (5′-CTACCTCATGAAGATCCTGA-3′)和r-acti5 (5′-TTTCATGGATGCCACAGGAT-3′),横跨核苷酸561年和829年之间的地区。检查匹配在不同的外显子引物,通过调整与老鼠基因组序列的序列。
免疫沉淀反应和雌性生殖道的磷酸化
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达野生型雌性生殖道(用作雌性生殖道积极控制表达式)和国际音标smc洗了三次在PBS (pH值7.4),刮在radioimmunoprecipitation分析缓冲区(50毫米三(羟甲基)氨基甲烷(三)盐酸(pH值7.5),1毫米乙二胺tetra-acetic酸(EDTA), 100毫米氯化钠和1% Triton x - 100)补充了蛋白酶抑制剂(20μM亮抑酶肽,0.8μM抑肽酶,10μM抑肽素,4 - 2.1毫米(2-aminoethyl)盐酸氟化-benzenesulphonyl)和单一化由几个通过23-gauge注射器针头。细胞溶解产物被治疗如前所述7。简而言之,溶解产物与雌性生殖道孵化鼠单克隆抗体克隆24-1(研发系统,明尼阿波利斯,美国)或多发地老鼠免疫球蛋白(Ig) G (Sigma-Aldrich)。雌性生殖道的磷酸化在体外使用两个单位的催化亚基蛋白激酶(PK) (Sigma-Aldrich)和370 kBq(γ-32P]三磷酸腺苷(ATP;Amersham淀粉微球生物科技、奥赛、法国;111年TBq·更易−1)。想起了放射自显影法磷酸化蛋白质。
免疫荧光研究
Immunofluorescent标签IPA smc使用anti-CFTR糖基单克隆抗体(鼠标反克隆24-1;研发系统)与碘化TO-PRO-3(分子探针,英杰公司公司- pontoise,法国)如前所述执行核染色5。
等长张力测量
雌性生殖道的作用催化剂机械活动测量使用异丙醇环(长1.5 - -2.5毫米)如前所报道20.。总之,KH溶液、饱和与15%的氧气/二氧化碳5% / 80%的氮,是使用。机械性能评估使用一个器官浴和传感器系统(EMKA Technologie、巴黎、法国),耦合IOX软件(EMKA Technologie)为了方便数据采集和分析。在初步实验中,确定组织被平衡设定在最佳长度对被动荷载为0.8 g。异丙醇环被清洗和预约0.3μM苯肾上腺素(检)为了测试雌性生殖道的松弛剂性质活化剂(10-chloro-6-hydroxybenzo [c] quinolizinium氯(MPB-07) 5-butyl-10-chloro-6-hydroxybenzo [c] quinolizinium氯(产甲烷- 91)和10-fluoro-6-hydroxybenzo [c] quinolizinium氯(产甲烷- 80);3 - 300μM,准备如前所述21通过构造一个累积量效曲线。一些实验被执行在endothelium-denuded戒指。内皮是被灌注血管腔的解决方案包含3 - 0.3% ((3-cholamidopropyl) diethylammonio) 1-propane磺酸盐(家伙),其次是冲刷与无毒的解决方案,如前所述22。家伙的效果证实了没有放松10μM carbamylcholine 0.3μM PHE-induced precontraction。所有的实验都在37°C。
化学药剂都溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;最终浓度≤0.1%),除5、11、17日23-tetrasulphonato-25, 26日,27日28-tetramethoxy-calix4芳烃(芳烃;慷慨地提供A.K.辛格和R.J.桥梁(美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学、匹兹堡)),carbamylcholine,皮套裤,MPB-07,产甲烷- 80和法溶解在水中。实验中使用的最大DMSO溶液的浓度≤0.1%,所有的化学物质为0.3%,产甲烷- 91和没有影响的机械活动环。
碘化流出
雌性生殖道Cl- - - - - -频道活动化验了测量的速度125年我从培养细胞流出(如前所述)6,7。细胞与射流清洗缓冲,由136.9毫米氯化钠,氯化钾5.4毫米,0.3毫米KH2阿宝40.3毫米,不2阿宝4,1.3毫米CaCl2,0.5毫米MgCl2,0.4毫米MgSO4,5.6毫米葡萄糖和10毫米玫瑰(pH值7.4)。
为了刺激volume-sensitive Cl- - - - - -运输、射流的渗透性缓冲区从300减少到150 mOsm·L−1。包含Na细胞孵化流出缓冲区125年我(美国马萨诸塞州波士顿的新英格兰核;37 kBq·毫升−1了1 h在37°C)然后用射流清洗介质的存在与否0.3μM板式换热器去除细胞外125年我失去细胞内125年我决心通过移除流出的介质缓冲每分钟8分钟。前三个整除被用来建立一个稳定的基准仅在射流缓冲区。中包含适当的药物被用于其余整除。最初的细胞内的分数125年我失去了在每个时间点确定,时间的比率125年我流出计算:
ln (125年我t1/125年我t2)/ (t1- - - - - -t2)(1)
在哪里125年我t是细胞内125年我集中在时间t,t1和t2连续的跨度为。曲线被绘制的速度构造125年我流出与时间。所有的比较都是基于最大时间率(k;在最小值−1),不包括用于建立基线点(k峰- - - - - -k基底)。
统计分析
数据均值±扫描电镜n的观察,或环的张力记录的数量。数据集比较用方差分析或一个未配对t检验。差异p < 0.05时被认为是重要的。
结果
雌性生殖道的表达出来
雌性生殖道表达出来了使用三种实验方法。首先,雌性生殖道信使rna的存在是被反向transcriptase-PCR(图1⇓)在肠中,已知一个器官表达雌性生殖道和用作表达积极的控制的雌性生殖道(巷1),和PASMCs(巷3),但不是在大鼠骨骼肌(巷2)。其次,免疫沉淀反应使用anti-CFTR抗体紧随其后在体外PKA磷酸化作用分析表明,在CHO细胞系作为积极的控制,成熟雌性生殖道磷酸化在体外在培养PKA PASMCs(图1 b⇓)。CFTR主要检测形式(带C)是一个175 kda蛋白,确定使用分子质量标准。控制与多发地老鼠免疫球蛋白(通道2和4)中也有所体现。第三,采用一种方法被用来确定在PASMCs CFTR的存在和位置检测。细胞被染色的anti-CFTR糖基单克隆抗体和anti-smooth肌肉肌动蛋白抗体,而没有染色可以发现在控制实验(图2所示⇓)。综上所述,这些研究结果表明,雌性生殖道内生IPA smc中表达时,可以检测到PKA-phosphorylated成熟的蛋白质。
抑制剂cAMP-dependent氯运输的动脉细胞培养的肺内的
由于雌性生殖道激活营地,提出,cAMP-dependent forskolin / genistein-activated Cl- - - - - -交通会得到雌性生殖道的支持。格列本脲和diphenylamine-2-carboxylic酸(DPC)是两个非特异性抑制剂的Cl- - - - - -渠道,包括雌性生殖道23对称二苯代乙烯衍生物4,4′-diisothiocyanatostilbene-2, 2′-disulphonic酸(所做的)是一个非特异性阻滞剂Cl- - - - - -渠道,但不抑制细胞外的雌性生殖道的等离子体膜23,杯芳烃是一个表面上整流Cl的抑制剂- - - - - -但不是雌性生殖道的渠道23,24。Forskolin /碘化genistein-dependent射流完全抑制100年μM格列本脲和500年μM DPC,但500年100海里芳烃和μM了(n = 4为每个;图4⇓,)。雌性生殖道异烟肼-172 (Calbiochem VWR国际、Fontenay-sous-Bois、法国;10μM),一个特定的雌性生殖道拦截器9碘化,也强烈抑制射流应对forskolin /染料木黄酮(图4所示⇓),这表明雌性生殖道可能负责forskolin / genistein-activated Cl- - - - - -在培养音标细胞运输。
雌性生殖道的作用在肺内的动脉血管舒张
自从cAMP-related受体激动剂诱导肺血管舒张25,26雌性生殖道的影响催化剂进行了大鼠异丙醇环preconstricted 0.3μM板式换热器。MPB-07和-91是好具体的雌性生殖道活化剂,而产甲烷- 80是一个非常贫穷的雌性生殖道激活但是一个有用的控制6,7,21。与产甲烷- 80,MPB-07和产甲烷- 91诱导的血管舒张IPA环是否endothelium-denuded(无花果5⇓和6 b⇓和无花果5⇓和6⇓分别)。
500年存在μM做,我Cl, Ca拦截器11这没有影响cAMP-dependent Cl- - - - - -运输(图。4⇑),200μM MPB-07仍然诱导强烈的放松(59.9±4.5%的原始precontraction板式换热器(n = 15);数据未显示),这表明产甲烷的影响主要是独立的我Cl, Ca活动。
最后,在培养大鼠异丙醇细胞使用0.3μM板式换热器,250μM MPB-07和产甲烷- 91碘化刺激流出(n = 4;图7⇓),而产甲烷- 80诱导雌性生殖道低激活(图7 b⇓)。碘化与forskolin /染料木黄酮,射流刺激产甲烷- 91是500年对100 nM杯芳烃μM做,但完全抑制的100年μM格列本脲,500μM DPC(数据未显示)和10 CFTRμM检测异烟肼-172(图7所示⇓)。雌性生殖道异烟肼-172也抑制了反应MPB-07和产甲烷- 80(图7 b⇓)。
综上所述,目前的结果表明,活化的雌性生殖道诱发endothelium-independent鼠帕斯血管舒张,显示一个潜在的和意想不到的雌性生殖道的肺血管张力作用。
讨论
目前的报告提供证据,表明CFTR功能检测内生IPA平滑肌中表达。首先,它表明受体激动剂的营地通路,如forskolin,刺激雌性生殖道Cl- - - - - -通道的活动。其次,药理学的雌性生殖道上皮雌性生殖道的非常相似,在激活(使用产甲烷衍生品和染料木黄酮)和抑制(CFTR使用格列本脲,DPC和检测异烟肼-172)。此外,结构和药理MPBs特异性(即。不同活动的产甲烷- 80,MPB-07和产甲烷- 91)在异丙醇是相似的细胞从老鼠和老鼠主动脉6,7在上皮细胞21。第三,激活IPA导致endothelium-independent雌性生殖道的血管舒张。目前的研究是第一个显示雌性生殖道的存在和功能通道在初级培养PASMCs及其对肺血管舒张。
的存在我Cl, Ca和我Cl,膨胀在老鼠PASMCs也证实,使用培养IPA smc研究Cl- - - - - -运输结果验证。
功能性cAMP-dependent Cl的存在- - - - - -频道曾建议在牛肺动脉平滑肌的使用,而非特异性Cl- - - - - -通道阻滞剂,如phenylanthranilic酸,9-anthracene羧酸,5-nitro-2——(3-phenylpropylamino)苯甲酸(NPPB),并在cAMP-dependent 5 -羟色胺引起的反应17,27。这个通道的分子起源还没有被确认,尽管cAMP-related 5 -羟色胺的反应被抑制phenylanthranilic酸和9-anthracene羧酸但不做和NPPB。雌性生殖道是麻木不仁了23,这一结果证实了在目前的研究中,这表明通道中观察到大鼠异丙醇可能类似于观察牛肺动脉平滑肌17。雌性生殖道激活的药理音标使用产活化剂(产甲烷- 91 > MPB-07 >产甲烷- 80)与碘化研究射流和等长张力技术(在目前的报告)类似于先前获得的大鼠或小鼠主动脉细胞6,7上皮细胞,21和气管细胞5。此外,内皮去除不影响肺动脉血管舒张MPBs,导致协议与之前报道的大鼠和小鼠主动脉6,7。最后,营地的激活和碘化MPB-dependent流出被CFTR CFTR-specific抑制剂检测完全抑制异烟肼-172年的异丙醇,如上皮细胞9和主动脉smc6。所有这些结果导致雌性生殖道的结论,作为cAMP-dependent Cl- - - - - -通道PASMCs表达,参与endothelium-independent肺血管舒张。
在上皮细胞,营地受体激动剂刺激transepithelial Cl- - - - - -运输通过磷酸化顶端雌性生殖道的开放通道1,28。在体循环的smc,即。主动脉6,7或肺循环(本研究),雌性生殖道的激活是证明precontraction后肌肉细胞。这些观察结果与先前的研究一致表明,阵营与血管smc的放松血管舒张反应β-adrenergic受体激动剂或——血管活性肠肽等25,26。从当前的研究表明雌性生殖道的存在在异丙醇,这或许可以解释,至少部分,为什么营浓度的增加会引起肺血管舒张通过雌性生殖道的激活。
值得注意的是目前的研究是在帕斯进行的,从而表现出CFTR功能检测。容易设定,改变肺动脉的雌性生殖道功能可能与肺动脉高压的发展,因为:1)帕斯,与肺外动脉相比,尤其对缺氧敏感,因此强烈参与了肺动脉高压的发病机制;2)受遗传疾病的患者囊性纤维化也开发一些呼吸道疾病,最终导致肺动脉高压;和3)一些Cl- - - - - -渠道参与肺动脉高压(见介绍部分)。虽然这是超出了目前的研究范围,进一步的调查需要探索的表达和功能雌性生殖道的肺动脉肺高血压动物。
总之,当前报告了第一次的直接证据功能囊性纤维化跨膜电导调节表达鼠肺内的动脉主要培养平滑肌细胞。在更多的集成模型,如肺内的动脉环,激活的囊性纤维化跨膜电导调节诱发endothelium-independent血管舒张,表明潜在的囊性纤维化跨膜电导调节作用在肺血管张力的调节。一个有趣的发现可以产生出新的治疗发展囊性纤维化跨膜电导调节催化剂能够放松肺动脉平滑肌细胞,因此潜在的降压药物。
确认
作者要感谢h . Crevel (INSERM U885,波尔多大学2,波尔多,法国)技术援助,c . Vandebrouck(法国普瓦捷普瓦捷大学)细胞培养制备、immunolocalisation囊性纤维化跨膜电导调节和讨论,和v .梭罗(普瓦捷大学)协助rt - pcr和免疫沉淀反应实验。
- 收到了2007年5月16日。
- 接受2007年6月20日。
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