摘要
薄片vedoomicroscopact用于检查小型气道中收缩的动力学原位.
BALB / C小鼠吸入弹性蛋白酶(0-20 IU),然后在安乐死和肺部去除前留下14天。在薄肺切片中评估了胆碱能反应性。响应10的缩小幅度和速度−5M乙酰胆碱(ACh)的完全浓度-反应关系−8-10年−5 M) were assessed.
在体内暴露于弹性蛋白酶伴随着统计学上显着降低的幅度和收缩的速度,但ACH浓度反应关系没有变化。相反,过夜,在体外从对照动物的切片暴露于弹性蛋糖蛋白酶(2.5μg·ml−1)导致气道变窄的幅度和速度增加,松弛受损,气道与周围实质明显撕裂。这些变化是气道壁栓系力降低的特征。
因此,肺切片技术与气道收缩速度的跳频分析相结合,提供了研究气道实心相互作用的有力工具。肺气肿的弹性渗透模型,其在空域扩大和丧失实质附件中表现出来,伴随着呼吸道收缩动力学减少。这种功能损失的机制仍有待阐明。
慢性阻塞性肺病(COPD),以气道炎症、支气管炎和肺重塑(包括肺气肿和纤维化改变)为特征1- - - - - -3.,已经是世界上死亡率和发病率的主要原因之一,并且普遍存在4,5.主要的触发因素是香烟烟雾,占COPD病例的80-90%。然而,在吸烟者中,只有15%的受试者出现慢性气流受限6.几种丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶与人类的COPD相关联7.此外,许多不同的实验方法(鼻内灌注弹性酶、基因靶向上调弹性酶表达或下调α-抗胰蛋白酶、使用各种蛋白酶抑制剂)都突出了内源性蛋白酶在空域扩大中的重要作用,并确定了这些蛋白水解系统之间的许多相互作用7.除了在破坏细胞外基质(尤其是弹性蛋白)方面发挥关键作用外,蛋白酶还可能通过产生趋化因子和细胞因子,以及通过为细胞突破组织屏障,在调节炎症方面发挥重要作用7.
意识到这种中央或甚至蛋白酶的因果作用导致了几种COPD的啮齿动物模型的发展8其中一种是让动物通过鼻内吸入猪胰腺弹性蛋白酶9,10.这一挑战导致炎症反应,在几天内解决,以及持续100天的结构变化。stoneet al。11.以前报道过弹性酶在仓鼠中的剂量依赖效应;即使剂量低至6单位的弹性蛋白酶也会产生轻微肺气肿,如肺功能检测。格雷和米切尔也一样12.描述了猪离体支气管段壁内注射弹性蛋白酶的效果;这导致气道壁与实质分离,导致反应性增加在体外.钱和米兹纳13.据报道,与对照疗法相比,顽固的实质表现出对乙酰胆碱(ACH)的敏感性更大,并且在肺气肿的弹性蛋白酶诱导的仓鼠模型中对ACH的最大收缩性明显更大。
使用这种方法,已经可以检查和量化与实验诱导的肺气肿相关的各种组织学和免疫/炎症指数。然而,COPD还以部分可逆的气流阻塞,Atelectasis和瓦斯捕获,以及气道高反应性,所有这些都有助于损害肺部的气体交换14.,15..事实证明,COPD和肺气肿的这些方面更难检查;气道功能改变本身尤其难以检查。尽管总的气流和阻力都可以测量在体内或者在切除的肺部,对气道的特定段变化并不容易,即。更大的航空公司与各种细支气管血管(传导、末端或呼吸)。成像技术,如正电子发射断层摄影术或计算机断层摄影术,已经允许在活体动物中分辨一些较大的气道,但这些方法受到时间和空间分辨率的限制,并且需要昂贵和复杂的设备。最近引入的薄肺切片技术可能会克服这些障碍。使用后一种方法,肺膨胀的一种凝胶状物质,然后切成薄片一样薄50μm,然后可以研究使用标准videomicrometric技术和终端的响应性细支气管监控视频利率同时仍然位于本国环境(即。实质附着在很大程度上是完整的。这种方法已被用于检查过敏原诱导的气道高光反应性大鼠模型中的气道壁妥癌相互作用16.,17.,而不是上述COPD的弹性模型。
本文作者将后一种方法与小鼠肺气肿模型相结合,以探讨实质破坏对气道平滑肌收缩动力学的影响。使用Balb/C小鼠,因为当使用薄肺切片技术研究时,这些小鼠对胆碱能刺激具有强大的重复性反应18..目前作者增加了Ach-诱导的收缩中的速度测量,以更好地了解弹性蛋白酶治疗对气道与实质的影响的影响以及周围的实质施加的束缚的变化的影响。本作者假设,降低的束缚可能表现为更大的缩小程度,收缩的更快速度和放松的速度较慢(后者在取两个速度的比例时特别明显)。
材料与方法
动物处理和在体内赋予弹性蛋白酶
所有实验都得到了麦克马斯特大学(Hamilton, ON, Canada)动物研究伦理委员会(Animal Research Ethics Board)的批准,并根据加拿大动物保护委员会(Canadian Council ON Animal Care)的指导方针进行。
雌性Balb/C小鼠(6-8周龄)购自Charles River Laboratories (Montreal, PQ, Canada),并在进入限制区域的特定无病原体条件下维持12小时的光-暗循环,并提供食物和水随意.根据机构指导,用异氟烷麻醉一组动物,并在将鼻内(15μL至每个鼻孔)施用0-20IU的弹性蛋白酶/ 100g体重,然后将其送回该设施进行恢复14天。否则,通过封闭室中的二氧化碳吸入,使封闭室中的二氧化碳吸入为1分钟,除去肺活动,以用于组织学或生理研究的肺部。
肺切片
肺切片采用了伯格纳和桑德森最先描述的方法19.并在实验室内适应。简而言之,在安乐死之后,胸壁被移除,气管使用静脉内导管(20g Intima,Becton Dickinson,Sandy,US,USA),肺部挤压,用〜2ml琼脂糖(VII型 - 低胶凝温度膨胀; Sigma Aldrich,St.Louis,Mo,USA)温热至37°C;除非另有说明,否则后者的浓度为汉克斯缓冲盐水溶液(HBSS)的浓度为2%。随后注射了空气(〜0.1-0.2mL)以将琼脂糖HBSS从感兴趣的气道(那些将可视化)冲洗,因此它们将自由收缩,而不受到腔内抵抗。通过将肺制剂冷却至4℃的琼脂糖5-10分钟,然后使用EMS-4000组织切片器除去并切割左叶(120-μm厚度)(电子显微镜科学,华盛顿堡,美国)在4°C。将切片在HBSS中洗涤并在相位造影显微镜下进行检查;然后在37℃和5%二氧化碳的Dulbecco的改性鹰的培养基(DMEM)中孵育过撕裂或以其他方式损坏的那些切片。
在体外气道收缩测量
过夜孵育后取出肺片,转移到新鲜HBSS中30min。气管几乎充满电荷耦合装置(CCD)相机成像区(外径约125 μm),上皮和实质完好,上皮纤毛跳动活跃,没有被琼脂糖堵塞的患者被选中。满足这些标准的切片安装在玻璃盖滑块上(45×50 mm;Fisher Scientific, Suwanee, GA, USA),并由一块尼龙网(250µm网;CMN-0250D, Small Parts, Miami Lakes, FL, USA),以及第二玻璃盖滑块(22×40 mm);这似乎没有提供任何阻力阻力的气道运动(它似乎不受约束的移动玻璃表面,虽然这没有具体测量)。以约4.5 mL·min的速率在两个盖片之间和组织切片上灌注DMEM−1.哦是添加/删除通过这种灌注和良好的气道通路,表明胆碱能反应的发病潜伏期小于5s。采用高分辨率CCD固态摄像机(CV-252;尼康,东京,日本),并以延时拍摄(3毫秒曝光,0.2帧·s)−1)使用图像采集软件(视频保密; IO Industries,伦敦,加拿大)。视频图像转变为气道区域的录音与使用Scion图像分析软件(Scion,Frederick,MD,USA)的时间,其将10位视频图像转换为二进制,然后通过像素求和在每个帧中测量气道的横截面积。最后,分析了录音和统计比较。
组织学
每种切除的肺的气管用聚乙烯管(Becton Dickinson,Sparks,MD,USA)插管,并在20cmH的恒定压力下用10%福尔马林膨胀2O.肺固定24 h,石蜡包埋。三微米厚的切片用苏木精和伊红染色。平均弦长评估如前所述20..使用Leica DMR显微镜(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)对每个肺的五个随机场进行数字化。使用Leica Qwin图像处理软件(Leica Imaging Systems, Cambridge, UK)对切片进行分析。大气道和支气管被排除在分析之外。数据显示为空气空间的平均弦长,独立于肺泡间隔的厚度。
在体外接触弹性蛋白酶
特别指出的是,来自原始动物的切片(那些没有吸入弹性蛋白酶的在体内)与猪胰腺弹性蛋白酶(Sigma Aldrich)共孵育过夜,最终浓度为2.5µg·mL−1在37°C和5%二氧化碳的DMEM中添加抗生素和抗真菌药。过夜孵育后,切片在相差显微镜下分析,并选择最小可见损伤的气道评估胆碱能反应性。
材料
细胞培养试剂由Invitrogen生命技术公司(GIBCO, Carlsbad, CA, USA)提供。切片孵育用DMEM中加入PennStrep(青霉素10000 U·mL)−1,链霉素10,000 u·ml−1),两性霉素B(125μg),l-抗坏血酸(35 g·mL−1)、转铁蛋白(5µg·mL−1)、硒(3.25 ng·mL .−1)和胰岛素(2.85µg·mL .−1).HBSS多数采用羟乙基哌嗪乙烷磺酸缓冲液(0.2 M pH 7.4)补充。所有其他试剂均从Sigma获得,除非另有说明。将猪胰腺弹性蛋白酶(Sigma Aldrich)溶于0.9%氯化钠中,浓度为1 mg·mL−1,分成250µL等分,-20℃保存。
统计数据
气道区域标准化为在实验开始时测量的腔面积的百分比(在挑战前的ACH挑战之前)。采取了这种气道区域录音的第一种衍生,以获得缩小或扩张的速度。通过使用面积测量来估计气道半径(假设后者是圆形的;面积=π×R,也获得了平滑肌缩短的速度。面积=π×r2,这里r是半径),然后利用半径计算圆周率作为π和直径的乘积。这样,就有可能在一帧一帧的基础上估计长度的变化,并且它的一阶导数作为缩短的速度。所有数据均表示为平均值±扫描电镜.各组间采用未配对方差分析进行统计比较;采用非配对t检验比较同一组织内管腔狭窄的速度。采用Pearson检验进行相关分析。p值<0.05被认为有统计学意义。
结果
在体内弹性蛋白酶处理导致空域扩大
在初始实验中,本作者量化了通过在去除肺部之前2周(每100g体重的0.02-20IU弹性蛋白酶0.02-20 IU弹性蛋白酶)诱导的各种浓度的弹性蛋白酶诱导的空体扩大程度。图1⇓显示20和10 IU / 100 g体重可引起广泛的肺气肿病变。在每100 g体重5iu时,仅观察到最小的和局灶性空域扩大。在浓度< 2iu / 100g体重时没有观察到组织损伤(数据未显示)。空域扩大量化(图1e)⇓)每100克体重(P <0.05)显示统计学上显着增加的平均弦长度为20和10 IU(P <0.05)。
对照组织胆碱能反应
用于评估气道对胆碱能刺激反应性的实验方案如图2所示⇓.组织首先用10挑战−5 M ACh to evoke a maximal constrictor response; in naive tissues, this elicited a rapid and dramatic decrease in airway diameter which reached a peak within 5 min. ACh was then washed from the tissues by superfusing with regular HBSS for 5–10 min, during which time the airway relaxed back toward its baseline diameter. Finally, the full cholinergic concentration–response relationship was explored by challenging the tissues with ACh at concentrations ranging from 10−8到10−5M。
图2D⇑总结了在同一代表性肺切片中,由腔区记录的一阶导数逐帧推导出的狭窄/扩张速度。在该跟踪中,收缩(主动过程)的速度是松弛(被动过程)的两倍多。这一方法鉴别不同收缩速度的能力也在示踪的第二部分中得到强调,其中显示了对ACh浓度增加的响应。特别地,两者都是10−7 M ACh and 10−6M - ACh引起的气道面积减少了约20%,但后者的速度几乎是前者的7倍。另外,也可以估计平滑肌缩短的速度本身,通过将内腔区域的变化转换为内腔周长的变化(参见方法部分)。发现缩短的速度与腔变窄的速度几乎相同,仅在极小的气道直径下略微不同(见图2D⇑和6D.⇓),表明气道区域的监测变化是一种有用的替代物,用于跟随平滑肌长度的变化。尽管如此,鉴于气道并不完全圆形,腔内缩小的速度均用于统计比较。
平均,10−5 M ACh evoked a mean decrease in initial airway area of 53.6±3.12% (n = 5; fig. 3g⇓)和收缩速度(图3h⇓)明显大于松弛(图3i)⇓;p < 0.05);这两个速度的平均比值为4.14±0.69(图3j)⇓).对照组织中平均累积ACh浓度-响应关系如图3所示⇓是在图4中给出的⇓.
实验方法的验证
在采用这种新方法之前评估了几种不同实验参数对进行测量的影响,以检查改变束缚力对气道功能的影响。
bet al。21.已经表明,肺切片中收缩反应的大小在气道大小的很大范围内变化;然而,在这些比较中,他们没有包括收缩/松弛速度。在本研究中,我们检测了气道大小的一个小得多的范围,没有发现收缩幅度和速度与气道大小在统计学上显著相关(图5)⇓;P> 0.05,Pearson的相关测试)。
为了解决用于膨胀肺的琼脂糖是否可能影响测量的机械响应16.,琼脂糖浓度减半:这被发现对收缩或松弛的幅度或速度没有统计学上的显著影响(表1)⇓).
在全动物研究中测量的肺顺应性随肺膨胀程度而变化。使用薄肺切片技术,根据动物的相对大小,用约1.2毫升琼脂糖充气至充分的生理肺活量。本研究对肺膨胀程度的依赖性进行了评估。即使注入琼脂糖的体积减少了三分之一,测量的响应的大小或速度都没有观察到统计学上的显著影响(表1)⇑;未配对t检验,p > 0.05)。
的影响在体内胆碱能反应性的弹性蛋白酶处理
当动物的组织吸入弹性蛋白酶时在体内使用上述实验方案进行检查,发现弹性蛋白酶治疗对胆碱能刺激的反应有一致的、深刻的和统计上显著的影响,在一定程度上依赖于所使用的弹性蛋白酶的浓度。特别是,对第一次注射乙酰胆碱的反应的平均幅度下降,即使在那些接受5iu弹性酶的组织中在体内,并且在治疗的人中几乎废除在体内用15或20 iu elastase(图3G⇑;方差分析,p < 0.05)。不出所料,经过预处理的组织的平均胆碱能反应在体内10iu弹性酶则介于这两个极端之间;然而,值得注意的是,单个组织的反应范围从明显正常(类似于那些在原始组织)到严重受影响的15和20 IU弹性酶处理组织。
还发现收缩和放松的速度是显着降低(P <0.05,ANOVA)与吸入弹性蛋白酶的动物组织中的幼稚动物相比在体内,抑制程度取决于弹性蛋白酶的浓度(图3 - 3j)⇑).
最后,在预先暴露的组织中检测乙酰胆碱浓度-反应关系在体内至5或10 IU弹性酶(15和20 IU弹性酶对最大胆碱能刺激反应的显著抑制作用排除了对次最大胆碱能反应的研究)。响应的平均幅度为10−8到10−5M和ACh在图4中给出⇑.elastase没有统计学上显着的影响在体内(5或10 IU)的胆碱能浓度-反应关系(ANOVA)观察。
的影响在体外弹性蛋白酶治疗胆碱能反应
为了解决简单破坏弹性组织的效果而没有炎症,纤维化和修复的混淆影响,将来自另一组幼稚动物的肺切片随着添加到培养介质的不同浓度的弹性蛋白酶而孵育过夜,然后在第二天检查使用上述实验方案。切片预处理过夜在体外100μg·ml−1非常柔软和脆弱,斑片状实质,上皮变性和明显减少上皮纤毛跳动活动。50µg·mL−1弹性酶纤毛活跃,但薄壁组织片状脆弱。切片用5µg·mL和2.5µg·mL预处理过夜−1Elastase的外观上皮在外观和较少的实质损伤(图6C⇓).目前的作者选择使用2.5μg·ml−1弹性蛋白酶研究过夜的效果在体外弹性蛋白酶治疗胆碱能反应性。
以这种方式处理的切片对ACh表现出更大、更活跃的收缩反应,而在洗脱ACh时则表现出更缓慢的松弛反应(见图6a中的代表性示踪图)⇑b)。事实上,气道通常不会恢复到它的基线直径,可能是因为在缩窄反应中,气道从实质附着物中撕裂了。这个响应的平均幅度和速度如图3所示⇑;单因素方差分析显示,这些数据在统计上有所增加在体外弹性蛋白酶治疗,相对于对照组织。松弛速度明显降低(p<0.05)。
乙酰胆碱浓度-反应关系也被这种直接的隔夜弹性酶处理所改变。尽管10−8在上述组织中,M - ACh是亚阈值,它现在引发了一个深刻的,虽然短暂的收缩反应(图6)⇑).同样地,回复10−7M - ACh明显增强。平均浓度-响应关系如图4所示⇑.
讨论
肺切片的视频显微测量已经被广泛用于研究各种机械反应16.,17.,22.,23..其他研究使用0.75-1%的琼脂糖在切成500-1000-μm厚的切片之前将啮齿动物肺充气16.,或250微米厚22..然后用2%琼脂糖对该方法进行改进,使肺膨胀和变硬,然后切成约100µm厚的切片19..阿德勒et al。24.之前已经证明,2%琼脂糖填充的肺具有与空气填充的肺相似的剪切模量。
然而,这些早期的研究大体上只检查了气道狭窄的绝对程度,很少或没有注意到这些变化的动态。有关结缔组织基质的重要信息可能存在于气道狭窄/开放的时间过程中。在目前的研究中,这项技术已经扩展到包括瞬时收缩速度的估计,并表明后者是平滑肌缩短速度的简单和接近的估计。这种技术比其他技术有另一个优点在体外气道功能测量技术;后者是在等张或等轴条件下进行的,而肺切片中的气道和肺中的气道在体内携带繁琐的(既不是均衡也不直通)。
由于这些原因,本方法在研究气道平滑肌(ASM)及其周围实质基质之间的相互作用方面具有非常宝贵的价值。Duguetet al。25.已有报道称,气道收缩和收缩速度是由气道壁上的弹性载荷控制的。限制ASM缩短的主要弹性负荷是肺实质(通过肺泡附着于气道壁)、气道壁本身以及平滑肌细胞缩短的内阻26.- - - - - -28..
慢性阻塞性肺病的部分特征是肺实质破坏和肺泡功能丧失导致的肺泡腔增大。大量证据表明,这种实质破坏是继发于过量的蛋白水解活性,而蛋白水解活性又与气道炎症有关29.,30..这些改变中的许多变化是在弹性蛋白酶诱导的实质破坏的鼠模型中复制。然而,虽然上面提到的组织学和炎症指数在啮齿动物模型中容易地检查,但是通过改变的卧室力带来的气道功能的变化,这也不是高度临床相关的,因此不容易地检查。薄的肺切片技术提供了在他们仍在本地环境中,可以轻松监测甚至非常小的气道的机械响应,同时它们仍然存在高的时间和空间分辨率。
本作者假设本体啮齿动物呼气液模型中的实质破坏将表现为更大且更快的收缩,在诱导松弛时,气道重新打开。与期望相反,本作者发现治疗动物中的胆碱能反应在体内与匹配的原始动物相比,弹性蛋白酶水平一致且显著降低。事实上,在动物暴露于更高浓度的弹性酶(15和20 IU)时,胆碱能反应性是可以忽略不计的。胆碱能反应量的降低伴随着气道变窄速度的降低,本文作者预测这将预示组织内栓系力的增加。弹性酶的吸入可能不仅导致实质的肺气肿性改变,而且还会导致气道壁的纤维化重塑本身.酶促消化的弹性蛋白由肺衍生细胞修复31.,甚至是第一次使用啮齿动物模型的研究10除斑片状肺气肿改变外,肺弹性蛋白水平净增加(30%)。布鲁尔et al。32.研究表明,弹性蛋白酶治疗后肺泡壁表现出更多的迟滞。相反,可能有胶原蛋白相关的重塑;伊藤和同事33.,34.在小鼠弹性溶解模型中发现空气层扩大和实质弹性蛋白丢失,同时胶原蛋白含量增加(48%)。还应该承认,目前的实验方法可能会偏向于研究那些肺气肿变化最大的切片/气道,因为在切片过程中,气道萎陷和肺撕裂,相反,更倾向于研究纤维化的气道(COPD的另一个特征,可以在小鼠模型中复制),因为它们在切片过程中更健壮。也有可能在体内弹性酶损伤包括平滑肌本身的变化,减少收缩表型。考虑这些因素,在弹性蛋白酶滴注后2周内发生的炎症和/或修复过程可能会导致平滑肌朝向更高的分泌表型(伴随收缩表型的损失)。本作者折扣了弹性酶处理的组织在肺泡壁上表达了更多/不同的蛋白质的替代解释,这使得它们更粘附在本研究中使用的玻璃表面在体外装置,由于气道的预期,以期观察到突出(这是当前作者的经验,当观察到腔内的琼脂糖塞内的琼脂糖塞)和/或从玻璃突然撕开的气道突然撕开。也没有观察到。
当检查浓度 - 反应关系对于ACH时,弹性酶处理和幼稚组织之间没有发现差异。因此,ASM的固有灵敏度不受影响。这些并发变化的一种解释是弹性酶暴露在体内首先导致组织损伤/破坏,然后是修复过程,留下气道瘢痕和纤维化。目前的作者正在调整他们的组织学分析,以定量弹性蛋白/胶原蛋白的含量在非常薄的切片,从录像制作。对这些已经很薄的切片进行组织学切片切割是困难的,组织内的琼脂糖可能改变染色测定本身.另外,弹性蛋白酶治疗可能导致ASM质量丧失和/或损害ASM功能。
与上述相比,弹性蛋白酶过夜处理的组织表现出了预期的变化,即。从周围的实质上撕裂气道墙,较慢,完全放松,恢复到休息时恢复休息直径。相反,胆碱能收缩的大小和速度相对于对照切片仍未妨碍。这些观察结果与通过蛋白酶的急性处理引起的组织中的减少的束缚力一致;弹性蛋白对于小型气道的弹性反冲和它们抵抗负压塌陷的能力至关重要35..用这种蛋白酶过夜治疗不会给组织重塑事件留出足够的时间,如纤维化或平滑肌增生/肥大(或后者向分泌表型的转变)。
总之,目前的实验方法直接允许具有高空间和时间分辨率的小气道可视化,同时仍然在天然的细胞外环境中,为气道缩小的动力学提供了有价值的洞察力和改变的束缚的影响。使用本方法,由于不同程度的平滑肌激活,可以区分气道动力学的差异(10−7与10−6 M ACh) or even strain of animal (Balb/C与C57小鼠;这里没有显示数据)。否则,用同样的分辨率是不可能看到如此大小的气道的(例如计算断层扫描/正电子发射断层扫描)。然而,本技术确实有一些限制。首先,气道狭窄的绝对动力学可能受到盖玻片和组织切片之间的摩擦的影响,以及琼脂糖本身,其在整个实验中留在凝胶状态中的肺泡中。然而,这些效果应该是治疗组之间的常数,因此仍然可以进行相对比较。其次,从本实验布置中缺少纵向力。
在未来的研究中,应该注意检查蛋白酶激活受体对本文描述的变化的潜在贡献。此外,通过比较有和没有慢性阻塞性肺疾病的人类手术标本的肺切片中气道狭窄的大小和速度,将这个模型扩展到人类状况将是有趣的。
致谢
作者要感谢M. Sanderson和Y.Bai(Massachusetts Medical School大学,伍斯特,MA,USA)的帮助,为肺切片技术提供帮助。
脚注
有关编辑意见,请参阅第611页。
- 收到2007年3月5日。
- 接受2007年5月20日。
- ©ers Journals Ltd