抽象的
慢性变应性哮喘与明显的炎症反应、微血管渗漏和上皮损伤有关。正如之前在慢性哮喘大鼠模型中显示的那样,这些改变增加了肺的渗透性和远端气道液体的清除率。角质形成细胞生长因子(KGF)已被证明可以诱导上皮细胞增殖,并保护急性肺损伤。因此,本文作者评估了KGF治疗慢性哮喘大鼠肺通透性和气道炎症的潜在作用。
kgf(1 mg·kg−1)在敏化大鼠的最后一次卵磷蛋白(OVA)攻击之前静脉内施用。通过从肺泡和全身隔室泄漏放射性标记白蛋白的渗透率来评估渗透性。还进行了组织病理学分析。
KGF治疗可降低OVA致敏大鼠两种标志物的渗漏和血管外肺水的水平。KGF治疗也能减少支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞数量,但对支气管粘膜没有影响。KGF显著限制了变应原引起的上皮完整性的改变以及细胞间连接蛋白β-catenin和封闭带蛋白-1的表达。
总之,给药角化细胞生长因子显著限制肺通透性和气道炎症,这与慢性变应性哮喘中上皮改变的减少有关。这些数据为哮喘的治疗策略开辟了新的前景。
微血管渗漏是哮喘发病机制中的一个典型特征1.此前研究许多研究表明,涉及与平滑肌增生相关的支气管壁的上皮层和层胶壁的活性举射是气道阻塞的负责2- - - - - -4.负责这种exsudation的机制可能是多因素,但肯定涉及上皮细胞和内皮渗透性的增加5.目前的作者最近研究了慢性支气管过敏炎症中的肺通透性和肺液运动,表明通透性的增加与肿瘤坏死因子(TNF)-α依赖的远端气道液清除率上调有关6.这种反应的调节可以代表哮喘治疗中有吸引力的研究途径。实际上,肺泡上皮修复在急性肺损伤中至关重要,并且在早期阶段加速该过程可以代表一个主要的治疗目标。
角质形成细胞生长因子(KGF)是肝素结合生长因子7哪些已经被证明对急性肺损伤有保护作用8,9.kgf刺激两者体外和体内肺泡II型细胞增殖分化10.,11.;首先认为其活动仅限于上皮细胞12..这一假设受到吉利斯的挑战等等。13.他证明了KGF可以诱导大鼠角膜血管新生,并保护内皮免受过氧化氢的毒害。KGF的保护作用是多因素的。目前的作者已经证明,在α-萘基硫脲诱导的肺损伤中,通过钠钾腺苷三磷酸酶刺激增强肺泡液清除14..在铜绿假单胞菌肺炎,kgf恢复肺液间隙,与内皮屏障的改善有关15..KGF在TNF-α损伤后的肝细胞中具有抗凋亡作用16.最后,在氧化性肺损伤中,KGF通过增强DNA修复保护肺泡上皮细胞,防止紧密连接的破坏17.,18..KGF也影响炎症反应。在酸性吸入肺损伤中,KGF预处理降低了巨噬细胞炎症蛋白-2α浓度和中性粒细胞招募19.;还显示出KGF可以减少许多干扰素诱导的基因的转录物20..体外, KGF下调支气管上皮细胞的细胞间粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1的表达,导致粒细胞对这些细胞的粘附降低21..
因此,本研究的目的是评估KGF在卵磷酸甲蛋白(OVA)的后期的效果,抑制棕色挪威大鼠的慢性哮喘。kgf在最后一次在最后一个ova挑战之前三天静脉内注射(六个)。目前作者评估了这种治疗对肺渗透性,炎症反应以及与过敏反应相关的上皮改变的影响。目前作者还测量了在最后一个挑战后7天后对炎症反应和支气管和肺泡修复的影响。
方法
动物
无菌的无病原体雄性棕色挪威大鼠(280-300克,中心D'ÉLEvagedépré,圣·德克兰德,法国)被居住在里尔大学动物护理设施(Lille,法国)和允许食物和水中自由.所有实验都得到里尔动物护理和使用委员会的批准。所有实验共使用44只大鼠。
KGF注入
为了I.v.注射用七氟醚(Servorane)麻醉动物TM值;Abbott, Maidenhead, UK),并在实验研究前连续三天在阴茎背侧静脉注射一次。KGF(重组人KGF 1 mg·kg)−1在1mL PBS中;注射了AMGEN,千橡木,CA,USA或等体积的等渗盐;然后使动物恢复。在肺损伤模型中建立了有效剂量14.,15..
免疫和暴露于OVA
于第1、15天免疫大鼠I.P.注射10 μg OVA,附1.5×1010.heat-killedBordetella pertussis.生物和1毫克2O3.(Vaxicoq;Institut Mérieux,里昂,法国)22..在第1天和第15天注射对照动物,其中0.5ml无菌等渗盐水。
将动物暴露于雾化OVA(体积重量1%)或无菌生理盐水中20分钟22..用超声波雾化器(Pariboy,Starnberg,Germany)产生气溶胶。在第21天的第一次(最后一次后6天后,第一次将大鼠与OVA溶液(或无菌盐水)暴露于OVA溶液或无菌盐水I.P.第25、29、33、37和41天。
组织病理学
对各组的肺和支气管样本进行分析。样品用甲醛固定,石蜡包埋。石蜡切片用苏木精和伊红染色,May-Grünwald Giemsa染色(MGG;Sigma-Aldrich, St Quentin en Fallavier,法国)用于分析炎症细胞。细胞计数(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞)由两名独立的观察人员进行,并通过高倍场(×100)表达。四个视野,优先选择在支气管周围,细支气管周围和血管周围区域,评估每个切片。使用计算机辅助形态测定法(IM500;(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzerland),为脱屑(基底膜上缺乏上皮细胞)或受损(萎缩、变薄、脱离)的支气管上皮长度的百分比。
在石蜡包埋的肺切片上分别进行β-catenin和ZO -1免疫组化分析,这两种蛋白是粘连和紧密连接形成所需的接合蛋白。首先,切片去脂并在90°C的柠檬酸缓冲液中孵育20分钟进行抗原回收处理。然后,将切片与兔免疫球蛋白(Ig)G、抗β-catenin (Santa-Cruz Biotechnology, San Diego, CA, USA)和anti- zo -1 (Invitrogen, Paisley, UK)共培养,浓度为2 μg·mL−1在PBS中具有2%胎牛血清。洗涤后,通过与生物素化的抗兔IgG山羊IgG(Sigma-Aldrich)孵育来检测结合,然后用ABC-碱性磷酸酶试剂盒(Vector,Burlingame,Ca,USA)孵育。用红色的红色显示酶活性,并用丙豆内(Sigma-Aldrich)反染色。
在活的有机体内测量肺泡渗透率
手术准备和通气
如前所述15.,挪威棕色雄性大鼠被戊巴比妥麻醉(赛诺菲,利伯恩,法国)。将导管(PE-50)插入左颈动脉,监测全身动脉压力并采集血液样本。潘库溴铵(0.3 mg·kg−1·H−1I.v.给出了达到神经肌肉阻滞的。插入气管插管(PE-220)通过气管造口术。大鼠用恒容量泵(Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA)通气,吸气氧分数为1.0,峰值气道压力为0.78-1.2 kPa (8-12 cmH)2o)和正端呼气压力为0.20kPa(2 CMH2O)。
制备滴注
用于肺泡滴注的试验溶液如下制备:简要地,使用林格乳酸制备5%牛白蛋白溶液6,15.,23..对5%白蛋白溶液,1 μCi125.I标记的人血清白蛋白(125.I-HSA;CIS生物国际,Gif sur Yvette,法国)。此外,在研究结束时,还添加了无水埃文蓝染料(0.5 mg),以确定注入剂的位置。将注入溶液的样品保存起来,用于总蛋白测量、放射性计数和水/干重比测量。
一般协议
对于所有实验,使用以下一般方案。在手术制剂后,使心率和血压被稳定1小时。然后将大鼠置于左侧侧褥疮位置(以促进液体沉积到左肺中)。
计算血浆蛋白的通量进入肺插形,血管示踪剂,1μCi131.I-HSA,被注入血液中6,23..131.根据标准化技术,在当前的作者机构中编写了I-HSA24..为了计算从空间的蛋白质的通量进入循环等离子体,3ml·kg−15%牛白蛋白溶液,1μCI125.在10分钟内后30分钟将I-HSA滴入左肺,使用1ml注射器和聚丙烯管(0.5mm内径)25..
肺泡灌注开始1 h后开腹,大鼠出血。取尿液进行放射性计数。肺被摘除通过通过使丙烯管(0.5mm内径)进入左下叶中的楔形位置,获得来自远端空位的胸骨切开术和流体。测量液体浓度的总蛋白质浓度和放射性。右肺部分别均化,用于水/干重比测量和放射性计数。
血液力学,肺气交换和蛋白质浓度
持续测量全身动脉压和气道压。每隔1小时测量动脉血气。动脉氧张力被用来量化氧合不足6,23.,26..从注入的蛋白溶液、最终的远端空域液体以及初始和最终的血液中采集样本,使用自动分析仪(Hitachi 917;日立、日本东京)。
白蛋白通过内皮和上皮屏障
两种不同的方法被用来测量白蛋白穿过肺内皮和上皮屏障的通量。第一种方法测量残差125.I-HSA(肺泡蛋白示踪剂)在肺内积聚125.血浆中的I-HSA。第二种方法措施131.如前所述,肺血管内空间中的I-HSA(血管蛋白示踪剂)在肺血管内空间中6.
支气管肺泡灌洗
来自每个实验组的肺部磨损,总共30毫升PBS,在5ml等分试样中具有3mM EDTA。通过计数300个细胞·样品MGG染色后测定总和差异细胞计数−1结果以各细胞类型占总细胞数的百分比表示。
实验方案
研究了以下实验组以分析渗透性和病理分析。C组:由无菌盐水免疫和挑战的大鼠,在第43天分析(n = 9);综合组:在第43天(N = 9)分析,用卵子和假攻击免疫大鼠(n = 9);ova组:在第43天分析的免疫和卵子攻击的大鼠(n = 9);Kova组:在第43天分析的胃肠大鼠和OVA的大鼠分析,KGF在静脉内施用(第38,39,39和40天; N = 9)。另外两个实验组仅致力于组织学分析。罗瓦群:在第50天(N = 4)分析卵醛的大鼠和胃肠挑战,分析(n = 4);Krova小组:类似于Kova,但在第50天分析(n = 4)。
在活的有机体内在前四组中的每一个的最后雾化后,24小时对蛋白质毛细管屏障的渗透性评估蛋白质屏障的渗透性的研究。同时获得病理分析和支气管肺泡灌洗(BAL)。
统计分析
结果以平均值±表示扫描电镜.使用Kruskal-Wallis测试和适当的Mann-Whitney U-Test分析数据。P <0.05的值被认为是统计学意义。
结果
KGF预处理改善OVA致敏和攻击试验后观察到的渗透性的改变
KGF的给药与两个标记泄漏的减少有关,125.I-HSA和131.I-HSA,分别在系统和肺泡盒中(图1⇑).与OVA组相比,KGF处理后间质血浆当量和肺湿/干重比也显著降低(分别为100和65%;表1⇑).
KGF预处理可抑制BAL患者的淋巴细胞和中性粒细胞招募
与对照组相比,OVA刺激导致支气管周围炎症的发展(图2a)⇓b)和白细胞内流(图3)⇓).这种细胞浸润主要由来自OVA大鼠的淋巴细胞和粒细胞组成(图3⇓).此外,与对照或具有敏化大鼠的卵巢大鼠嗜酸性粒细胞和单核细胞的数量显着较高(P <0.05;表2⇓).OVA挑战诱导上皮病变,如血管在BAL中所示。在Kova组中,KGF管理与OVA相比,KGF管理显着降低了BAL中的淋巴细胞和中性粒细胞计数(图3⇓),而对血频加入渗透没有显着影响(图2D⇓和e,表2⇓).令人惊讶的是,KGF没有影响卵巢诱导的嗜酸性粒细胞在Bal和支气管粘膜中的招募。此外,在最后一次挑战后7天进行的组织病理学分析表明,主要由单核细胞组成的支气管炎炎症浸润在来自ROVA和Krova组的两只大鼠中持续存在的单核细胞,尽管差异与对照大鼠没有统计学不同。在BAL中,在ROVA或Krova组中没有检测到显着的炎症细胞浸润。
KGF限制上皮改变
由于KGF主要靶向上皮细胞,因此本研究主要关注这种治疗对哮喘相关上皮病变的作用。致敏动物的OVA刺激可诱导支气管上皮损伤,如图2a所示⇑B(最后一次吸入后24小时)。KGF治疗限制了这些上皮改动并恢复了上皮完整性(图2D⇑的确,在KOVA组中只有4.3%的上皮表面发生改变,而在OVA组中为43.4% (p<0.05)。此外,在给药KGF后,血管周围水肿显著减少(图2g)⇑和h)。
此外,在最后一次挑战后7天,在Krova组中恢复支气管上皮(7%损坏的上皮;图2F⇑)抑制在ROVA组(24%受损的上皮损伤)中持久的上皮改动。
讨论
由于微血管泄漏和上皮改变代表了严重哮喘发病机制中的重要特征,因此当前作者评估了治疗的效果,其具有能够促进气道粘膜修复的因子,例如KGF。在本研究中,证明KGF在褐色挪威大鼠过敏支气管炎症模型中提高了胚芽渗透性的肺泡渗透性的增加。此外,上皮和肺泡渗透率的降低与上皮改变的改善和BAL中的中性粒细胞和淋巴细胞流入的降低相关。
上皮损伤是哮喘的一个典型特征1.上皮是一种屏障,但也产生在炎症反应中发挥关键作用和在哮喘中重塑的介质。在该方法中,许多生长因子如肝细胞生长因子,粒细胞 - 巨噬细胞刺激因子,转化生长因子-β和上皮生长因子(EGF)。EGF刺激上皮细胞增殖和迁移。KGF也称为FGF-7,属于成纤维细胞生长因子的家族,主要刺激上皮细胞的增殖7,11.,12.,27.,28..KGF已被证明是肺中肺泡上皮II型细胞和支气管上皮细胞的有效有丝分裂原体外和体内10.,11.,29..KGF的保护作用已在不同情况下证明,包括预防细胞损失,而且在损伤后修复上皮修复14.- - - - - -17..
在哮喘中,对KGF的作用知之甚少。目前的作者已经在慢性哮喘中证实,在最后一次OVA雾化前使用KGF治疗与上皮和内皮标记物泄漏的减少有关。Waters已经研究了KGF对气道上皮细胞通透性的影响等等。30..实际上,KGF降低了基础白蛋白通量并防止过氧化氢诱导的渗透性增加在气道上皮细胞单层上。这种效果可能是由于透镜性渗透性的变化,但由于迅速观察到上皮渗透率的降低(加入后1小时),因此不能降解细胞增殖。一种机制可能是由于这种模型中的kgf诱导的紧密交叉点稳定18..在本研究中,KGF在最后一次挑战之前连续3天施用,这是一种应该足以恢复大鼠支气管上皮的时期。当在敏化大鼠的支气管粘膜中观察到重要的上皮病变后,在第五次攻击后注射了KGF。如图2所示⇑, KGF治疗明显限制上皮屏障的改变,提高通透性。然而,用这种方法,不能确定这种渗透率的增加是否与大或小气道有关。这两个部位可能都参与了,因为KGF治疗明显诱导了大小支气管上皮的修复。迈克耳逊等等。31.也显示出来体外和体内该大鼠KGF诱导的支气管上皮细胞增殖,DNA合成的剂量依赖性增加。由于在本研究中,在处理3天后观察到效果,细胞增殖可能涉及该模型中的上皮再生。此外,防止紧密结破坏和支气管细胞增殖可以共同起来限制过敏原诱导的肺上皮渗透性的增加。实际上,目前的作者观察到,KGF可防止ova诱导的ZO-1和β-catenin的表达,两个适配器分别在形成紧密和粘附的连接中发挥关键作用。还在支气管粘膜内的细胞浸润中鉴定它们的表达;这可能是由于它们如前所述的一些炎症细胞的瞬态表达32.,33..β-连环蛋白还有一个功能,即。作为转录因子淋巴增强剂因子/ T细胞因子蛋白的共激活剂,该方法涉及细胞增殖和金属蛋白酶的生产34..ZO-1还可以招募参与细胞增殖和分化调节的信号传导蛋白35..需要额外的实验来确定KGF是否在转录或转化水平上起作用,并确定该KGF诱导的上调是否与重新形成粘附和紧密的连接相关。此外,尽管在粘膜内持续存在炎症细胞浸润后,在最后第7天在第7天实现上皮恢复。因此,这些数据表明,KGF能够修复上皮损伤并限制目前实验模型中的OVA挑战的影响。
未评估液体清除的解剖水平。大多数使用相同程序(标记示踪剂)评估上皮细胞和肺泡通透性的数据来自急性呼吸窘迫综合征和肺炎实验模型。II型肺细胞似乎是参与液体运动的主要细胞14.,15.,23..然而,在哮喘学中获得的其他数据表明,从支气管粘膜发出的细胞也是可能涉及的1,3..在目前的作者的大鼠模型中,在一个肺中注射1ml不能使参与液体清除的细胞定位。
在哮喘大鼠中,KGF治疗也限制内皮通透性的增加。关于KGF在内皮细胞增殖中的作用的数据很少。体内,KGF诱导大鼠角膜血管新生13..此外,它阻断过氧化氢渗透性的增加和微血管内单层的过氧化氢和血管内皮生长因子/血管渗透性因子的增加,但不是主动脉,内皮细胞13..KGF还能够诱导血管生成并稳定微血管组织中的内皮屏障。在A.离体静水肺水肿模型,KGF衰减损伤通过防止肺泡毛细血管渗透性增加的机制,证明其内皮渗透性的含义36..在过敏大鼠的模型中,这些数据表明KGF的作用可能致力于对内皮渗透性的直接影响。由于KGF的施用限制肺渗透率增加和上皮改变与敏化大鼠反复的卵子攻击相关,因此可以假设该处理影响气道炎症。虽然支气管内粘膜内的浸润未经修饰,但在用卵巢攻击攻击的大鼠kgf给药后,嗜中性粒细胞和淋巴细胞计数降低。事实上,kgf具有限制一些趋化因子的生产的能力19..只是等等。21.证明,体外KGF下调上皮细胞粘附分子的表达;这种效应与中性粒细胞的粘附性降低有关。此外,ZO-1和β-catenin的表达增加也可能限制白细胞的转运通过支气管上皮内细胞间隙的电位重新形成。
总之,本数据表明,角质形成细胞生长因子施用限制了慢性过敏性哮喘大鼠模型的肺渗透性增加,并限制了卵霉素诱导的上皮损伤。然而,治疗对肺内炎性浸润的抑制效果。这些观察结果表明,这种治疗策略旨在恢复上皮和内皮屏障完整性可能具有极大的潜力,可以限制对严重哮喘的渗透率增加的肺功能的后果。进一步的研究是确定角质形成细胞生长因子的影响是否可以长期降低炎症反应和/或过敏原特异性免疫应答。
致谢
作者要感谢J.基普斯(比利时鲁汶)在详细编写这本书时提供的帮助和支持,也要感谢X. Marchandise、P. Briche和N. Zenani(法国里尔)每天的鼓励。
- 收到了2006年1月25日。
- 接受2007年3月22日。
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