文摘
间质性肺炎最近相关的突变基因编码的表面活性剂蛋白C (SFTPC)。特别是,SFTPC突变在许多家庭已报告形式的肺纤维化和婴儿与间质性肺疾病。本研究寻找SFTPC成人患者的突变零星特发性间质性肺炎。
总共35成人零星的特发性间质性肺炎患者和50名健康受试者被追究SFTPC突变DNA直接测序。的零星的特发性间质性肺炎患者,25岁患有特发性肺纤维化和10个来自非特异性间质性肺炎的患者。
只有两个经常产生变异,T138N S186N,被检测到。等位基因频率的变化以及其他非编码标识变化没有显著差异在不同的患者组和对照组之间。
总之,突变基因编码的表面活性剂蛋白质C不散在病例中常见的特发性肺纤维化和非特异性间质性肺炎,表明变异的基因并不扮演重要的角色在这些形式的特发性间质性肺炎的发病机理。
特发性间质性肺炎包括七种不同的实体包括特发性肺纤维化(IPF)和非特异性间质性肺炎(NSIP)1。IPF的组织学形态的特点是通常的间质性肺炎(摘要)和不良预后与平均2 - 3年的生存2。大约3%的IPF病例估计家族3。
最近的研究表明,一些家族性间质性肺炎病例相关的突变基因编码的表面活性剂蛋白C (SFTPC)。大多数的这些突变发生在c端BRICHOS proprotein的域4。这一地区对适当的加工和折叠pro-SFTPC很重要5- - - - - -7。
2001年,Nogeeet al。8报告SFTPC剪切位点突变影响基因内区4的一垒(c.460 + 1 g >),一位母亲和她的婴儿,导致跳过的外显子4和截短蛋白缺失的37 carboxyterminal地区的氨基酸。婴儿遭受细胞NSIP,而母亲显示脱皮的间质性肺炎。在体外研究表明,突变导致凋亡细胞死亡的两种机制:一方面,这个突变积累在内质网(ER)导致ER应激诱导的特点是夸张展开蛋白质反应;另一方面,增强沉积突变蛋白的细胞聚集的抑制蛋白酶体活性表明中断的泛素蛋白酶体系统演示4。
第一次SFTPC突变与摘要,IPF的组织学相关,是2002年了。在这项研究中,托马斯et al。9报道一个杂合的T的颠换外显子5,导致替换一个高度保守的亮氨酸残基的谷氨酰胺残基188密码子(L188Q)在一个大的家族性肺纤维化相似。在这个家族的97个成员,11个肺纤维化,六成人显示摘要模式和三个孩子细胞NSIP模式。异常片状体形成和异常pro-SFTPC证明在II型细胞的亚细胞定位的家庭成员的影响。此外,在体外研究证明夸张L188Q突变体的毒性9。
2002年,Nogeeet al。10分析了SFTPC在原因不明的慢性肺部疾病,并发现患儿的杂合突变34中的11个病人。在另一项研究调查34零星或家庭有不明原因的呼吸窘迫的情况下,两个杂合的SFTPC突变,I73T和R167Q识别和发现与肺肺泡蛋白质沉积症有或没有fibrosing肺病11。
在最近的一项研究调查SFTPC突变成人IPF的散发病例和NSIP 13 135例显示SFTPC在控制变化并没有发现,但只有一个病人拥有一种氨基酸变化的变体,I73T12。
这些数据支持的假设SFTPC突变导致某些类型的间质性肺疾病的病理生理学。因此,本研究调查了35成人患者零星的特发性间质性肺炎SFTPC突变。
方法
研究对象
这项研究是通过当地的机构审查委员会和知情同意是获得所有的病人。总共25德国IPF患者和10个德国NSIP患者(如欧美共识标准定义的)登记1,2。在15例,25的IPF和NSIP 6分(10分满分),证实了诊断肺活检。表1⇓6分钟步行试验的距离显示了人口特征,和病人的肺功能测试组的结果。对照组50个人健康的德国没有肺部疾病(医务人员和学生;23岁女,27岁男性;意思是(范围)年龄34.4(24 - 61)岁)。
DNA提取、PCR
从血液基因组DNA提取白细胞使用旋转列(试剂盒、希尔登,德国)。的SFTPC编码区35病人和50对照组被直接DNA测序分析。测序,SFTPC扩大了在三个使用以下寡核苷酸片段PCR: 5′-GTTGGAACTGGTCCTTGCAGG-3′, 5′-TCCCCATA-CTCAGG-CCTCTG-3′(promoter-intron 2), 5′-GCCTCATGACCTCATGCCTG-3′, 5′-AGCTTA-GACGTAGGCACTGC-3′(内含子1-exon 5)和5′-GTCCCACAATAAGGGC-TGCAC-3′, 5′-CTGGGACAGAGGGCGAATGG-3′(基因内区4 - 3′未翻译区(UTR))。
PCR是使用0.75 U AmpliTaq黄金执行聚合酶(美国应用生物系统公司,培育城市,CA), 400年µM deoxynucleoside三磷酸腺苷,1.5毫米MgCl2和0.1µM每25µL引物的总量。循环条件如下:最初的变性12分钟在95°C;48周期20多岁变性在95°C, 40年代的退火64°C和90年代的底漆在72°C扩展;和最后一个扩展为2分钟72°C。
DNA测序
PCR产品消化与虾碱性磷酸酶(USB、Staufen、德国)和我(USB)和执行循环核酸外切酶测序使用BigDye终结者混合(应用生物系统公司)。排序,使用的寡核苷酸:5′-CCCAGGTTTGCTCTTGCTGG-3′, 5′-GAG-GAGGCAGGGCCCATCAC-3′(片段1);5′-TCCAGCCCTAGGACGCCGTG-3′, 5′-CTGTCTGGCATGTCCTGTGC-3′, 5′-GATGGGTACCACTGGCTGAG-3′, 5′-TGGGTC-AGGGAGAGAGCAGG-3′, 5′-CACTCCTCCCAGCAGCCCTG-3′(片段2);和5′-GTCCCACAATAAGGGCTGCAC-3′, 5′-GGGAGTGGGAAGTACCGGTC-3′, 5′-CTGGGACAGAGGGCGAATGG-3′(片段3)。在这一过程中,整个编码区,包括5′和3′utr和启动子序列从-400年开始,进行了分析。循环条件如下:初始变性3分钟紧随其后30周期变性在95°C的20年代,退火60°C 20年代和30年代伸长60°C。反应产品纯化与交联葡聚糖G-50 (Amersham、弗莱堡、德国)和装上ABI 3100荧光定序器(应用生物系统公司)。
统计分析
统计分析进行了使用确切概率法和p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
两个单核苷酸多态性(snp)是确定的SFTPC编码区两个病人组和对照组:c。413C to A transversion in exon 4, leading to an exchange of threonine by asparagine at codon 138 (T138N); and a c.557 G to A transition in exon 5 resulting in an exchange of serine by asparagine at codon 186 (S186N). Allele and genotype frequencies of both variations did not differ significantly between the different patient groups and control subjects.
强大的连锁不平衡被发现之间的两个编码SNPs, T138N S186N,正如前面所描述的芬兰组:138 n是几乎完全在独联体以186 n13。至于两个单核苷酸多态性的等位基因频率,频率估计的单体型之间没有显著差异不同的患者组和对照组。
额外的变化位于催化剂,UTR或intronic地区被确定。再一次,没有明显的等位基因频率的差异之间的病人和对照组观察。表2⇓总结的等位基因频率检测患者和对照组的变化。
讨论
目前的研究调查SFTPC突变在35个成人零星的形式的间质性肺炎患者,25与NSIP IPF和10。肺炎都是零星的,第一个成年疾病的表现。成为他们的症状性疾病的患者平均年龄为60.8±9.4,49.9±13.3年IPF和NSIP分别。其实只有两个单核苷酸多态性预测一种氨基酸变化检测,但没有控制和患者之间的等位基因频率的差异。没有SFTPC帧转移或剪切位点突变检测的患者。
一般来说,数据可能零星的遗传基础形式的间质性肺炎是罕见的。多态性基因编码的肿瘤坏死factor-α,interleukin-1受体拮抗剂、血管紧张素转换酶和补体受体1与IPF的散在病例14- - - - - -16。改变增长factor-β1多态性也与IPF的进展17。到目前为止,只有一项研究调查SFTPC成人患者的突变零星的IPF或NSIP形式。在这项研究中,89名IPF患者和46 NSIP进行分析,但只有一个IPF患者拥有基因序列变异预测氨基酸序列的改变(I73T)12。在一个13个月大的婴儿严重的呼吸衰竭,同样的突变与组织学模式组合NSIP和肺肺泡蛋白质沉积症。功能分析表明,突变体表面活性剂的表达蛋白质C前肽(proSP-C)导致proprotein交易异常,导致积累的异常处理proSP-C肺泡18。
与零星的形式的肺纤维化,SFTPC以家族形式突变可能是更重要的。超过68个家族与家族性特发性肺纤维化至今被描述3,19,20.。这些家族形式是最可能在减少外显率的常染色体的方式传播。一些家族性肺纤维化病例被发现与杂合的相关SFTPC突变8,9。有趣的是,不同的组织病理学类型的肺纤维化被发现在同一家族的成员共享相同的SFTPC突变。这些不同形式可能代表的多效性的表现同样的基因缺陷9。外显率降低的另一个特点SFTPC相关的家庭形式的肺纤维化,表明额外的内源性或外源性因素的肺纤维化倾向显著的多样性SFTPC突变9。
有几种机制SFTPC突变可能导致肺纤维化的病理生理学。最近在体外研究表明,细胞内积累的不完全处理和错误折叠SFTPC可能导致肺泡II型细胞损伤和凋亡,从而启动纤维化4。这是符合当前公认的假说,慢性损伤肺泡上皮细胞的潜在致病事件启动IPF的纤维化反应21,22。而蛋白质错误折叠是一个可能的解释患者的纤维化的发展SFTPC突变,也可以想象,纤维化是由于缺乏成熟的SFTPC;SFTPC-deficient老鼠发展严重的进行性肺疾病显示组织学特性与间质性肺炎一致23。有趣的是,成熟SFTPC缺席在肺组织或支气管肺泡灌洗液的婴儿最近描述剪切位点突变(c。460 + 1 G >)8。此外,SFTPC不足被描述在一个家族没有检测到与间质性肺炎SFTPC突变24。
除了突变SFTPC与肺表面活性物质相关,另一个分子的突变系统最近被证明发生在儿科间质性肺炎;突变磷酸腺苷盒蛋白(美国广播公司)A3基因已经与致命的呼吸衰竭新生儿缺陷的表面活性剂蛋白B和C和非致命性慢性间质性肺炎在一个年长的孩子25。进一步的研究需要阐明的角色ABCA3突变成人形式的间质性肺炎。
总之,没有表面活性剂的致病性突变蛋白C基因被确定在35个成人零星的特发性肺纤维化患者或非特异性间质性肺炎,表明,与家族性肺纤维化相比,表面活性剂蛋白质C基因的突变是零星的罕见原因特发性肺纤维化和非特异性间质性肺炎。
确认
作者要感谢Haendel和m·布劳恩为他们出色的技术援助。
- 收到了2006年3月10日。
- 接受2006年9月1日。
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