抽象
甘露糖结合凝集素最近被确定为囊性纤维化的严重程度的调节因子,尽管研究已经产生了不同的结果,其作用机制仍不清楚。
目前的作者已经研究了大量的成年人(n=298)和儿童(n=260),以进一步探索这种明显的关系。
有两个结构突变,但没有杂成年人,有显著降低肺功能和血氧饱和度,更频繁住院,并提出系统性炎症标志物。这是不相关的感染率增加铜绿假单胞菌,也没有增加易感性伯克不过。这些研究结果都没有在儿科人群都进行了镜像。
综上所述,严重的甘露糖结合凝集素缺乏似乎对囊性纤维化成人有害,尽管杂合子不受影响。这表明,这与受损的补体介导的细菌杀灭无关,并假设与宿主的炎症反应有关。如果将甘露糖结合凝集素替代作为治疗该病的新方法,本研究将提示,具有两种结构突变的少数严重缺陷患者可能受益。
这项工作是由囊性纤维化病研究信托,由威康信托基金会高级临床研究员(E.W.F.W.奥尔顿)和威康信托基金会临床奖学金(K.菲德勒)的支持。在儿童健康和大奥蒙德街儿童研究所,国家为儿童健康服务,从英国NHS执行人员接获研究从研发经费(NHS)信托利益。这项研究耗材部分由NatImmune A / S,哥本哈根,丹麦获得资助。M.W. Turner和N.克莱因是这家公司,这是发展甘露糖结合凝集素的重组形式的顾问。
囊性纤维化(CF)的大多数发病率和死亡率与肺部疾病有关,其特征是慢性细菌感染和持续的有害的炎症反应1。然而,疾病的严重程度是高度可变的,即使是在具有相同囊性纤维化跨膜调节受试者(雌性生殖道)基因突变,导致研究者搜索修饰基因,如参与宿主防御和炎症的替代离子通道orproteins。甲聚集,甘露糖结合凝集素(MBL),最近已被鉴定为一种这样的改性剂2。再加上黏膜纤毛活动梯,专业吞噬细胞和其他蛋白质(溶菌酶,乳铁蛋白,防御素,补数),collectins形成气道防御的第一线,前适应性免疫系统发挥作用。在其功能性寡聚体形式,MBL结合于微生物表面上的碳水化合物阵列,启动补体介导的裂解,并作为调理素以促进吞噬细胞功能4。这种蛋白质还以一种复杂的、尚未完全了解的方式影响炎症反应5。
在编码基因的结构区域内发现了三种多态性,MBL-26。突变蛋白质是不能形成高阶低聚物的,并具有缩短的半衰期。具有两个突变的个体已深刻地减少MBL水平,而中间的水平在杂合子观察。多态性也已确定启动子区域内MBL-2其中一个(X/Y)显著影响蛋白质水平8。由于杂合子占健康人群的>的30%,MBL在宿主防御中一般只起辅助作用。然而,低蛋白水平会增加各种感染的风险9- - - - - -11包括呼吸道12。人鼻咽分泌物中MBL的检测13提供了蛋白在呼吸道的防御作用的进一步证据。
之前的两项研究报道了这一点MBL-2是否肺疾病的一种改良剂在CF中,尽管这些报道在是否仅仅在3-4%的个体中出现纯合缺陷状态的影响上存在冲突3.或者它是否也出现在30%携带单一突变的人群中2。这种分化将对MBL替代治疗CF的发展产生重要的影响。为了进一步探索这一问题,目前的作者们已经进行了相关研究MBL-2在一个大的成人和儿童CF队列中,具有严重临床标记的单倍型状态。
方法
患者和临床数据
患者从成人和儿童CF诊所在皇家布朗普顿医院,伦敦,英国招募,以尽可能每当血常规时获得2000年和2002年的样本之间。从临床数据库,病人的医院记录和计算机化的微生物学报告获得临床数据。用力呼气量一秒(FEV1)和肺活量(FVC)分别来自肺功能实验室的年度记录,根据性别、年龄和身高进行校正,并以预测正常值的百分比表示14。对于儿科队列,记录特定年龄的肺功能以进行标准化(6-7、8-9、10-11、12-13和14-16岁)。对于成年人,从1990年到2002年,在可能的情况下记录了年值。通过对所有可用数据进行线性回归,计算出具有两个或两个以上值的所有受试者的年下降率。对成年患者,在年度访视时,通过患者呼吸室的空气获得经皮氧饱和度,并记录补充氧的需求。微生物学数据包括任何阳性样本的存在铜绿假单胞菌和伯克不过只。在儿科组数据也可Stenotrophomonas maltophilia,金黄色葡萄球菌和烟曲霉。皇家布朗普顿医院的临床生化实验室和血液学实验室分别报告了c反应蛋白(CRP)和白细胞计数。对另外38份血液样本进行了分析洋葱伯克霍尔德菌-来自英国其他三个CF中心的感染患者。这些研究对象没有进一步的临床资料。
比较三组的临床参数MBL-2单倍型组(野生型纯合子,杂合子和纯合子/杂合化合物缺乏)。随后,与突变等位基因的两个拷贝每成人患者进行回顾性与两个成人具有匹配无MBL-2突变作进一步比较。根据年龄(最接近5岁)、性别和性别进行配对雌性生殖道基因型(Δ/ΔΔ/或其他/其他)。如果有两个以上的匹配,则将患者与随机生成的列表中最近的两个受试者配对。
该研究得到了皇家布朗普顿医院、哈瑞菲尔德医院、国家心肺研究所和参与中心伦理委员会的批准,所有受试者、家长或护理人员均给予了参与的知情同意。
样品分析
制备和基因组DNA的扩增和MBL-2单倍分型如前所述15。基因分型的外显子-1的突变和启动子多态性分别进行。在两种情况下,合成的DNA分子(通用异源双链体发生器(UHG))构建,跨越感兴趣的区域和含有插入,缺失和/或取代。结合使用这些UHGs(由N.木,布里斯托大学,英国布里斯托友情提供)允许所有可能的已知基因突变的检测。血清MBL水平是通过对称夹心ELISA根据制造商的说明书来确定,使用从国家血清研究所,丹麦哥本哈根的套件。
统计分析
单倍型组间的差异用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey’s进行分析事后比较或卡方分析。Fisher精确检验用于包含少于5个值的组。数据以均数±表示扫描电镜。零假设是在p <0.05被拒绝。
结果
病人的人口统计资料
Blood samples were available from 298 (57% male) adult subjects aged 29.7±0.5 yrs.雌性生殖道基因型数据是这些可在269(90.3%),如下所示:Δ/Δ(48%),Δ/其他(44.6%)和其他/其它(7.4%)。A total of 260 children (48% male) with a mean age of 8.5±0.3 yrs were included. In 228 children,雌性生殖道基因型数据,如下所示:Δ/Δ(58.8%)、Δ/其他(34.6%),其他(6.6%)。
Mannose-binding lectin-2单倍型和血清水平
这两个MBL血清水平和MBL-2522例患者有单倍体资料;7例仅获得单倍型,25例仅获得蛋白水平。两个外显子1的突变频率(图1a)⇓)和启动子区域在成人和儿童之间没有差异,并且与在其他健康受试者的研究中观察到的相似17和CF患者2。总体而言,61.1%的人没有结构突变(通常指定为A / A),35.2%是杂合的(指定为A / O)和3.8%要么纯合的或杂合的化合物(包括指定O / O)。患者结构基因突变的B等位基因在染色体上的71%中发现,与发生的频率较低的其他突变(C:11%,d:18%)。低表达的X启动子多态性中发现的与野生型等位基因结构为30.6%。
a)甘露糖结合凝集素的频率(MBL)2基因结构变异相似在成人(└)和儿科(□)军团。A为野生型等位基因,O为任何突变(B、C、D)。B) MBL血清水平与之显著相关MBL-2单倍型(P <0.001)。每个单倍型组的血清水平在成人和儿童组类似,与YA / YA组,其中水平在成人显著较高的除外。数据以均数±表示扫描电镜。* * *:p < 0.001。
血清MBL水平与上述因素有显著的相关性MBL-2单体型(图1 b⇑;p < 0.001)。蛋白质水平最高的是两个野生型结构等位基因的患者,最低的是两个结构突变的个体和带有x -启动子突变的杂合子。除了YA/YA单倍型的成年人显著(p<0.001)升高(3858±221 ng·mL)外,成人和儿童的水平相似−1),而非儿科队列(2959±139 ng·mL)−1)。结果,成人纯合子-足够A / A的受试者显著着(P <0.05)更高水平的比A / A的孩子。
肺功能,感染和炎症标记物
不同的结果相对于所述成人和儿科受试者中观察到,因此,这些基团分别列出。
成人
肺功能
A mean of 6.1±0.2 lung function recordings (range 1–13) was available on 273 haplotyped adults over a period of 6.5±0.2 yrs. Mean FEV1与被显著相关MBL-2haplotype, the lowest values being observed in individuals possessing two structural mutations (fig. 2a⇓;方差分析p < 0.05)。平均植被覆盖度也呈现类似的模式(图2a)⇓)。在杂合子中,这两个参数都没有显著降低。无论纯合子组还是杂合子组,均未见低表达的x -启动子多态性对肺功能的影响(表1)⇓)。在12年的研究期间,O/O单倍型受试者的FEV年下降速度也最快1基线的(2.2±0.5%与的A / A组中1.3±0.1%和A / O组中0.7±0.1%,P <0.001;图。 2b⇓)。氧饱和度(93.2±2.1%)明显低于杂合子(96.0±0.2%)或野生型纯合子(96.0±0.2%);图2 c⇓)。这反映在对补充氧的需求上,O/O组最高(O/O 20%;/ 3.7%;A / O 1.1%;p<0.01)。
a)在成人中,两组用力呼气量均为1秒(FEV)1;□)、用力肺活量(└)明显不同跨三个mannose-binding凝集素(MBL)2单倍型组(A/A: n=163;A / O: n = 99;O / O, n = 11;方差分析p < 0.05)。O/O单倍型组最低(*:p<0.05)与其他组织;#:P <0.05与/主题)。杂合子的值与野生型无明显差异。b) FEV年下降率1对所有成年患者进行了计算,这些患者每年至少有两次肺功能记录。在有3个或3个以上记录的地方进行线性回归,数据以基线值下降百分比表示。MBL组之间的比率差异显著(p<0.001),有两个突变的组下降最快(A/A: n=144;A / O: n = 85;O / O: n = 11)。c)患者有两个突变体MBL-2等位基因(O/O)显著降低经皮氧饱和度(***:p<0.001)与其他组织;A / A: n = 145;A / O: n = 89;O / O: n = 10)。
感染和炎症
大多数成人人群(86.7%)的经历了反复培养阳性的铜绿假单胞菌,但未见显著链路与MBL-2单体型;由于未受感染的个体数量有限,因此没有尝试在MBL状态的基础上进一步分析这种影响。共有18名成年人在招募时被感染洋葱伯克霍尔德菌和另外38名患者从其他英国中心招募。无显著影响MBL-2观察到(A/A 57.1%, A/O 39.3%, O/O 3.6%;未感染:A/A 60.0%, A/O 36.1%, O/O 3.9%;p = 0.8)。总共有40.1%的患者需要至少一次住院治疗注射。2002年抗生素;O/O患者接受的手术数量最多注射。courses (fig. 3a⇓;P = 0.015)。Most recent CRP (obtained at annual assessment) was significantly raised in this group (fig. 3b⇓;(p<0.05),总循环白细胞计数有相似趋势(图3c)⇓;p值= 0.06)。
一个)的平均数数注射。2002年,不同甘露糖结合型凝集素-2单倍型的抗生素使用情况不同,O/O型成年人所接受的抗生素数量最多(*:与其他两组相比,p<0.05;A / A: n = 166;A / O: n = 103;O / O: n = 10)。b) O/O成年患者c反应蛋白(CRPs)明显升高;*:与其他两组比较p<0.05;A / A: n = 166;A / O: n = 103;O / O: n = 11)。c)外周血白细胞计数也有类似的趋势(方差分析p=0.06; A/A: n=159; A/O: n=100; O/O: n=11).
O/O组的临床劣势不能解释为这些患者的年龄明显大于其他单倍型组(A/A: 29.3±0.7岁,A/O: 30.4±0.8岁,O/O: 31.4±3.4岁);方差分析p = 0.5)或有一个代表比例的患者拥有Δ/Δ雌性生殖道突变之中此组(A / A:50.7%,A / O:43.3%,O / O:55.6%; Fisher精确检验p = 0.7)。然而,为了证实该发现,从11 O / O对象的数据是与对年龄,性别和匹配A / A对照雌性生殖道基因型(表2⇓)。为每名O/O个人寻找两名A/A受试者;然而,在一例50岁的>患者中,只有一个足够接近的匹配是可用的。O/O组的肺功能平均值明显低于A/A组(FEV)1:47.6±4.8%与66.1±5.7%,p = 0.02;FVC: 64.8±4.7%与84。7±3.4%, p<0.01) and significantly higher CRP levels (25.3±7.2 mg·L−1与10.7±1.9 mg·L−1,p < 0.02)。
与甘露糖结合凝集素血清浓度的关系
尽管关系密切MBL-2单元型和MBL蛋白水平,有后者和肺功能(p值= 0.17)之间没有直接的逆相关。To explore this discrepancy, lung function was compared between groups divided on the basis of MBL serum level into upper, middle and lower quintiles, where a significant pattern emerged (p<0.05; fig. 4⇓)。FEV最高1和中间的五分之一组中观察到FVC值,其中上部和下部的五分之一组展示肺功能下降。
![图4.-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/24/5/798/F4.medium.gif)
为探讨甘露糖结合凝集素水平与肺功能的关系,将成年患者按上呼吸道(
),中间(└)和血清水平低(□)的五分之一。显著差异,看到了在一秒两个用力呼气量(FEV1;P <0.05)和用力肺活量(FVC; P = 0.02),具有最高肺功能在患者中观察到的中间的五分之一组中使用。
儿科
肺功能
一共有191名儿童有他们的肺功能至少有一次测量,与其他人太年轻了,执行动作。As none of the O/O children was >12 yrs old, all comparisons were made for lung function obtained between the ages 7–11 yrs (mean age A/A: 9.7±0.2 yrs, A/O: 9.7±0.2 yrs, O/O: 8.6±1.0 yrs; ANOVA p=0.3). Neither mean FEV1nor FVC was reduced at this stage in children possessing the O/O haplotype (fig. 5⇓,而x -启动子多态性没有影响(数据未显示)。
![图5. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/24/5/798/F5.medium.gif)
无显著影响mannose-binding lectin-2 genotype was seen on forced expiratory volume in one second (□) and forced vital capacity (└) between the ages 7–11 yrs (all recordings were presented as means for each individual). A/A: n=113; A/O: n=67; O/O: n=6.
感染和炎症
总的来说,85.1%的儿童经历过至少一种积极的文化铜绿假单胞菌有28.8%的人有提示慢性感染的粘液样表型。对于整个群体来说,感染是不可避免的铜绿假单胞菌在首次肺功能测定前,两组肺功能测定均有显著不良影响1(87.2±1.7%与96.1±2.2%;FVC(95.2±1.4%)与101.3±2.1%;p值= 0.02)。然而,有感染率,年龄或粘液转换之间没有关联MBL-2单倍型。到研究结束时,七个孩子已经经历了至少一个积极的文化洋葱伯克霍尔德菌。没有明显的趋势对于MBL单倍型(YA / YA:N = 3,YA / XA:n = 2时,YA / O:n = 1且XA / O:N = 1)。之间没有观察到差异MBL-2单倍型组曾经被承认为注射。抗生素或首次入院时的年龄(数据未显示)。目前的CRP和白细胞计数在三组中均无显著差异(数据未显示)。
讨论
在迄今为止所研究的最大的一组CF患者中,目前的作者报告称成人有两个异常的结构MBL-2等位基因显著降低了肺功能,降低了氧饱和度,增加了住院的要求。这可能与CRP升高引起的炎症水平升高有关,但似乎不是慢性细菌感染的结果。这些关联在儿童时期未被发现,这可能会引起有关CF肺疾病进展顺序或修改基因研究时机的问题。
之前有两项研究探讨了MBL状态对CF肺功能的影响2。与这些研究一样,本研究中缺乏mbl的O/O组人数较少,但每项研究中类似的发现为结论提供了支持。Gabolde等。3.匹配11 MBL缺陷型成人(O / O)与纯合足够的控制(A / A),并报道了缺乏MBL导致显著恶化肺功能。没有缺点见于杂合子。相比之下,Grred等。2报告有一种或两种结构MBL-2基因突变(A / O或O / O)导致FEV减值1和存活率降低。目前肺功能的研究结果同意由Gabolde研究等。3.,因为它是在这个大组的成人清楚地表明,结构杂合子具有正常肺功能。尽管这是目前观察到的一些杂合子有患者有两个变异等位基因看到的范围内,MBL蛋白水平。
野生型MBL是4-6亚基,各自基于通过胶原的三股螺旋相关联的三个相同的肽链中的聚合物性质。MBL-2结构基因突变会破坏这种聚合,因此拥有两个突变的结构等位基因的患者并不拥有这种形式的蛋白质17。然而,与野生型MBL的明显低或无水平的个人,低分子量的单体形式可以存在18,并可能在某些人体内高水平传播19。这种单分子形式的MBL通常不被常用的检测方法检测到,如本研究中使用的方法20.。虽然这种形式的MBL的的功能是未知的,目前的结果表明,无论是少量的野生型MBL,其可以在XA / YO个人,或高水平的单体MBL的可以看出,这可以在YO / YO可以看出的个人,可以是在确定与CF的患者肺功能临界
MBL是如何在CF中运作的还不清楚。与加博德形成对比等。3.,目前的作者是与Garred协议等。2MBL不会影响易感性铜绿假单胞菌或洋葱伯克霍尔德菌。这与当前作者先前的研究结果不符体外研究表明,高水平的MBL结合的临床分离洋葱伯克霍尔德菌以及随后补体的激活21。总之,这些发现可能表明细菌的补体介导的清除是不是在CF肺MBL行动的一个重要机制。然而,结合该水平不足以激活补体介导的杀菌作用可能足以调节到微生物侮辱宿主炎症反应,而目前的研究提供了一定的临床证据表明,这可能是在CF的情况下,MBL起着炎症反应复杂和不完全理解的作用5。低循环蛋白水平已被发现在不同的疾病设置都有利和不利22两相剂量反应已经被证实体外5。它将从当前数据出现的MBL,其存在于气道表面液体(ASF),可以是施加的抗炎作用。除了循环可用的蛋白以达到为O / O个人气道的低得多的水平,最近的数据表明该蛋白的突变体形式可以通过基质金属蛋白酶中存在的丰度在CF ASF是降解更敏感24,因此,缺乏mbli的个体可能受到双重损害。目前,作者正在通过直接测量支气管肺泡灌洗液样本中MBL和炎症细胞因子的水平进一步验证这一假设。
本研究提出了CF中修饰基因研究的两个重要问题。第一个问题涉及从我们的儿科和成人组得到的明显不同的结果。人们认识到O/O儿童组非常小(n=6),因此,本研究可能在检测儿童差异方面能力不足。这是修饰基因研究中一个反复出现的问题,该研究试图检验相当罕见的基因型的影响。没有明显的趋势,但目前的作者已经开始收集另一个儿科队列的样本,以增加数量。此外,尽管可能存在修饰基因的疾病阶段特异性效应,但同样可能的是,在较年轻的年龄组中更难以检测到任何效应。同时雀鳝等。2observed an MBL effect in individuals as young as 8 yrs old, most of the children in this study had well-preserved lung function, and low or undetectable levels of systemic inflammatory markers. Thus, with the clinical markers used in this study, any potential modifier gene must exert a very significant detrimental effect before that effect will be apparent, even in a relatively large cohort, such as that of the current authors. This may be become increasingly difficult, as children and adults with CF have significantly better health status than was usual in previous decades25。未来修饰基因研究应可能会被成人最初进行,在其中的轻重变化较大可能有助于群体在风险识别。另外,更敏感的临床指标,例如,在这种情况下,气道炎症的直接措施,可能会更有效。进行关于涉及炎症或急性期反应过程的蛋白的研究时的第二个重要点是关于从作用的能力来区分原因。患者的血清最低水平MBL具有低肺功能。然而,患者的最高水平也比那些具有中等水平较低的肺功能。这是假设,,而前组展示肺功能差为MBL缺乏的结果,后者以回应他们poorpulmonary状况有较高的蛋白质水平。这种假设受到thefinding野生型(纯合子足够)成人hadsignificantly高MBL水平比孩子的相应组的支持。这很可能是与响应增加蛋白质水平,以刺激最大容量的群,具有较高的水平可能反映了随着年龄的增加更先进的疾病状态。后续研究的年轻患者可能有助于确认这种假设。 It is suggested that grouping on the basis of nonvariable parameters, such as genotype rather than variable protein levels, may be more likely to yield clear, interpretable results.
除了增加的理解它们提供疾病发病机理的,变性剂的基因的研究正在以的治疗的新颖形式的发展进行。纯化的血清来源的甘露糖结合凝集素已经被给予患者,其中包括一个患有囊性纤维化谁似乎受益26。与重组蛋白技术的进步,甘露糖结合凝集素可以成为从各种疾病的患者缺乏的患者治疗选择。虽然目前的数据表明,在该疾病的不利影响仅限于那些患者与甘露糖结合凝集素2基因(囊性纤维化患者的3-4%)的2个异常拷贝,需要进一步的研究以检查的潜在作用的甘露糖结合在囊性纤维化凝集素治疗。
致谢
笔者想toacknowledge患者和家长同意的研究;M.哈德森允许进入临床数据库;S. Elborn,S. Conway和D.比尔顿用于从提供的样品洋葱伯克霍尔德菌感染的成年患者;M. Festing统计咨询意见;J.弗朗西斯和儿科CF诊所行政协助的同事;和L.萨默顿,S. Escudera加西亚和临床微生物实验室在皇家布朗普顿医院,伦敦,英国的工作人员,寻求技术支持。
- 收到了2004年5月10日。
- 接受2004年7月15日。
- ©ERS杂志有限公司