文摘
肺气肿的特点是肺泡结构,反映在弹性反冲和气体交换。成纤维细胞中发挥关键作用的维护结构,当前作者提出,他们的扩散可能会持续受损的肺肺气肿。
用培养的外植体、肺成纤维细胞来源于肺切除10肺气肿患者(平均一秒钟用力呼气容积(FEV1)40%预测)和10 (FEV控制病人1,95% pred)。倍增时间(DT)测量了4天在标准条件下(10%胎牛血清)之前和之后的低温贮藏。此外,在七个样品每级组总人数翻倍(PDL)确定。
在肺气肿,意味着±扫描电镜DT是33.6±2.8 h与24.8±1.4 h控制。DT的差异在低温贮藏后保存。组织也在不同的初始斜率PDL情节在长期文化(35天)。然而,中值(范围)最大PDL组之间没有显著差异(13.8 (7.4 - -22.6)与20.2 (11.2 - -25.5))。
当前的作者,因此,建议减少增殖率在体外肺气肿患者的肺成纤维细胞反映了一个持久,固有细胞更换和维护的失败在这个疾病,可能与衰老和早产。
这项研究支持了Landesversicherungsanstalt (LVA),柏林和Hansestadt,汉堡,德国,并从阿斯利康的部分资金,德国。
肺泡壁的破坏和减少合成弹性反冲和表面积肺肺气肿的标志,被认为是与中性粒细胞炎症和损失蛋白酶/ antiprotease和氧化剂和抗氧化的平衡1,以及细胞凋亡内皮和上皮细胞2。系统性因素如一个贫穷的营养状态3也可能增强肺气肿所显示饥饿的啮齿动物实验4,5。
肺肺气肿的起始和进展密切相关,有毒物质,如香烟烟雾的吸入1。除了已知的基因由α预期1抗胰蛋白酶缺乏症1,它是未知的因素解释了观察,只有少数的吸烟者患肺气肿1。此外,有疾病,如囊性纤维化、广泛的气道炎症,嗜中性和相关的生化改变长期维护的时候,没有引发肺气肿作为一般的结果。此外,从当前知识消炎干预措施的影响的证据在人体的疾病似乎弱6。这表明,除了炎症,其他因素可能需要在肺肺气肿的发病机制。
肺的完整性依赖于细胞外基质成分,但也对产生这些化合物的成纤维细胞,并提供结构支撑7。结构变化后不久在肺细胞损伤凋亡诱导代理人建议高周转率的实质细胞应对物理和化学应力发生在肺泡的环境8,9。因此,肺泡隔内稳态,因此结构维护可能断裂,细胞替代的恶化。基于这一当前作者提出,一个正常和气性肺之间的差异可能是一种内在的成纤维细胞的增殖活动。这将提供一个部分的解释显然自给的疾病的进展,和潜在的临床印象,许多肺气肿患者似乎提前老化。如果应该有一种内在的障碍在扩散,与正常人的差异应该在标准条件下变得明显,不保留现有的炎性环境在活的有机体内10,11。当前的作者,因此,从实质切除肺组织标本分离出成纤维细胞相比,没有肺气肿患者和细胞增殖率和课程的文化。
材料和方法
病人
总共10中度到重度肺气肿患者(慢性阻塞性肺疾病的全球倡议(黄金);IIb阶段活动花絮和)1,10位病人临床、形态或功能慢性阻塞性肺疾病(COPD)的迹象或肺气肿列入研究(表1⇓)。除了一个病人接受了肺部肿瘤切除手术,所有患者吸烟者除了两个没有慢性阻塞性肺病患者。之间没有区别肿瘤大小或分段组。诊断考虑病人的历史,症状,胸片(肺气肿:n = 5,控制:n = 7)、计算机断层扫描(肺气肿:n = 8,控制n = 5),组织学结果,呼气煤层瓦斯曲线,以及抵抗循环和肺恶性通货膨胀决定人体体积描记仪。一氧化碳扩散能力是可用的病人(肺气肿:n = 5,控制n = 3)。在每个病人信息的一致性,表明慢性阻塞性肺病的存在与否与重要的肺气肿,反映在之间的分离功能数据组(表1⇓)。研究经当地伦理委员会批准,所有患者把他们的书面知情同意。
肺成纤维细胞
切除标本的宏观的容颜是检查和pleura-free实质样本取自周边,肺切除的非癌变区域。病人表现出巨大的炎症或可见明显的肺转移被排除在外。样本在汉克的缓冲盐水洗(表达载体;德国卡尔斯鲁厄),切碎的手术刀(1 - 2毫米2)和转移到25厘米2文化菜(Sarstedt;德国Nurnbrecht)主要外植体培养在37°C,调湿室5%的二氧化碳。细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),含10%胎牛血清(FCS);一批研究中使用),100 U·毫升−1青霉素、µg·100毫升−1链霉素,µg·50毫升−1庆大霉素(所有细胞培养试剂和抗生素得到fromInvitrogen)。文化主要是成纤维细胞达到融合之前终止。细胞trypsinised,一个整除resuspended介质+ 10%二甲亚砜,储存24 h−80°C,然后转入液氮。另一个整除被转移到新的培养瓶(播种密度4000个细胞·厘米−2)。样本进一步增长至少2周在标准DMEM没有抗生素。没有文化上有细菌或真菌污染这一时期的迹象。
扩散分析
扩散是通过测量两个主文化)后(3 - 4人口倍增。成纤维细胞被转移到24-well菜(4000个细胞·厘米−2手动)和细胞数量确定后24、48、72和96 h。在每个时间点的平均从3井。的意思是细胞数对数转换和线性回归斜率计算推导出倍增时间(DT)。在冻存细胞增殖也决定。扩散实验∼解冻后1周,避免累积的主要增加人口相比,实验用新鲜细胞倍增。
免疫细胞化学
细胞通过两个被播种到显微镜载玻片上,一夜之间孵化。采用免疫分析幻灯片之前在冰冷的丙酮固定,脱水和pre-incubated蛋白质块(Dako;德国汉堡)。洗后,幻灯片被抗体孵育anti-vimentin (Dianova;德国汉堡),anti-pan细胞角蛋白(Dako) anti-smooth肌肉肌动蛋白(Dianova)和anti-CD45 (Dianova)。染色是使用设想以及执行新的碱性品红染色试剂盒(Dako)根据制造商的指示。对比染色后,幻灯片安装,至少400个细胞得分为每个抗体。
测定细胞凋亡和坏死
细胞通过两个被播种到盖玻片和种植前2天染色Annexin-V-Fluos染色设备(罗氏公司;德国曼海姆)根据制造商的指示。荧光细胞的数量每视野决心和细胞的总数相同的字段被光学显微镜计数。
在进一步的细胞样本,可行性评估trypsinisation后用台盼蓝排斥。此外,收集上层的文化/ 3天后确定乳酸脱氢酶(LDH)的浓度。
长期的细胞培养
每组细胞的七个主题被解冻,播种在标准密度到通道。连接成纤维细胞的数量是由上层的细胞计数。从两个通道,每25厘米细胞被播种在100000细胞2与普通介质的变化,培养1周,收获与胰蛋白酶、清点,转移到下一个通道。人口翻倍确定和每周使持续直到收获细胞数量低于100000年最初播种的。每周获得倍增的总和最大人口翻番水平(PDL)。最初的增长曲线的斜率是来自第一个35天(通道6)的文化。遵循同样的步骤额外使用1%而不是10% FCS实验研究。
数据分析
由于偏态分布的细胞数量和中间值,四分位范围(差)为描述和选择Mann-Whitney紫外线测试是用于比较的组。最初的陡度人口翻倍曲线被重复测量方差分析,组间比较事后根据Newman-Keuls比较。统计假定值< 0.05被认为是重要的。
结果
两组患者在肺功能显著不同但不是在年龄和体重(表1所示⇑)。肺成纤维细胞可以从全部切除。大多数细胞后,通过两个主要文化显示典型的成纤维细胞形态和波形蛋白阳性。CD45 +细胞百分比的文化从肺气肿患者和对照组没有显著不同,中值(差)值为0.13(0 - 0.75)和0 (0 - 0)%。也是一样的百分比cytokeratin-positive细胞,各自的值为1.1(0.4 - -3.8)和0.6 (0.4 - -1.2)%。细胞-平滑肌肌动蛋白。也没有显著差异在可行性通道,值为95(93 - 97)和98年(97 - 98)%。
倍增时间和细胞凋亡/坏死
成纤维细胞的DT肺气肿患者显著高于对照组(p < 0.001,表1⇑、无花果1、2⇓⇓)。在两个肺气肿患者和一个控制病人,低温贮藏后细胞进一步实验的人数不足但DT的差异是有统计学差异(p = 0.05,表1所示⇑)。相应地,DT和post-storage前显著相关(r = 0.66, p = 0.004)。之间没有显著相关性供者年龄和DT,无论是在整个组患者(r = 0.11)也在组(肺气肿,r =−0.15;控制,r = 0.04)。此外,所花费的时间在初级文化扩散实验开始前组之间没有显著差异。成纤维细胞的DT两不吸烟对照组略低于这个群体的平均价值。在两组之间没有显著相关性函数变量(表1⇑)和DT观察。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/24/4/575/F1.medium.gif)
均值±扫描电镜细胞的成纤维细胞数量从10肺气肿患者(♦)和从10控制病人(•)在96 h的文化。数据来源于一式三份文化24-well菜肴。纤维母细胞增殖显著不同群体之间(方差分析,p = 0.004)。
肺成纤维细胞的倍增时间(h)文化研究在初选后立即通过文化和未存储在液氮中。值明显不同组(Mann-Whitney紫外线测试,p < 0.001)。
凋亡细胞的平均百分比确定onday 3增殖化验的0.5(0 - 0.6)%肺气肿和控制患者的0.8 (0.1,1.7)% (ns),LDH的浓度在细胞培养上清液是59(56 - 70)和58 (56 - 70)U·L−1(ns)。
人口翻倍水平
从每组七个病人,细胞被纳入长期文化(10% FCS)和人口翻倍确定每周直到停止扩散。块PDL与时间显示一个陡峭的曲线早期的通道和一个压扁随着时间增加(图3所示⇓)。最初的陡度是较小的文化肺气肿患者与控制患者相比(p < 0.001,方差分析,图3所示⇓)。事后比较显示,人口倍增在0天组没有差异(p = 0.94)和第七天(p = 0.17),但14天,21日,28和35 (p = 0.01, p = 0.0003, p = 0.0002, p = 0.0002,分别;图3⇓)。
)人口翻倍级别(PDL)块个人纤维母细胞文化从七控制病人(——)肺气肿患者和7 (- - -)。细胞数量确定一周一次和细胞种植到收获细胞的数量低于种子细胞的数量(100000)。b)结果的方差分析分析的初始部分PDL曲线。为了确保可比性,数据通道6(35天),在所有文化还复制,用于分析。
42天,四个文化从肺气肿和五个控制患者仍然激增,49个三到五天,56三,四天,和63两个和一个,天文化分别激增(图3所示⇑)。中值(范围)最大PDL是13.8(7.4 - -22.6)天肺气肿患者的成纤维细胞和20.2(11.2 - -25.5)天控制患者(p = 0.070,单侧)。实验用培养基的1% FCS,中值(范围)最大PDL是1.8(0.0 - -2.6)和3.8(0.8 - -13.1)天,分别(p = 0.032,单侧)。
讨论
在这项研究中培养的肺成纤维细胞的增殖率从肺气肿患者相比,控制病人被观察到。相应地,人口倍增的时间进程的初始斜率在长期文化较低。也有减少倾向的总人口数量倍增。细胞凋亡和坏死的发生率低,似乎不太可能,这些利率的差异占增殖率的差异。目前的研究结果表明在肺气肿纤维母细胞表型的改变。因为这是维护在体外外的炎性环境在活的有机体内,它似乎是一个持久的和这些细胞的本构特性,符合这一假说的减少成纤维细胞的细胞替代肺气肿的能力。
它最近表明,中断的原因之一的肺泡隔内稳态平衡肺气肿可以增加肺泡壁细胞凋亡水平2,9,8。虽然这些作者主要集中在上皮和内皮细胞2,当前作者选择研究肺纤维母细胞、纤维母细胞可能是基于假设的另一个关键球员肺气肿的发展。成纤维细胞是主要的细胞类型在间质中找到12和他们的主要角色之一是维持肺泡间隔的完整性由细胞外基质成分的人事变动7。两个最近的报告是符合这一假说和目前的结果,建议在肺气肿纤维母细胞表型的改变。在六名病人的样本总体,Nobukuniet al。11发现了一个倾向减少基线条件下扩散在肺气肿。同样,Noordhoeket al。10分析了成纤维细胞来自16个病人,使用bromo-deoxyuridine合并和DNA含量在天3和5的结果的措施。与当前作者的研究,也有疾病的严重程度的差异,以及在培养基中,但是有一个基线条件下减少扩散趋势,符合本研究的观察。
倍增时间的不同团体之间进行评估后,细胞通过两个主要文化(图1、2⇑⇑)。还发现在同一患者细胞冷冻保存后,导致一个小倍增时间和传播的四分位,虽然组之间的区别是维护。群体内部纤维母细胞增殖率之间没有联系和功能参数。这并不出人意料,因为肺功能代表了整体损伤的测量和很可能与疾病进展的多种因素影响。人口翻倍实验(图。3⇑),最初的斜坡也不同,进一步支持了断言扩散率之间本质上不同的肺气肿和控制。当前作者还发现一个趋势较低的最大自由人民党肺气肿患者的成纤维细胞,尽管大型群体内部的差异性。甚至这是统计学意义在使用中含有1% FCS施加刺激增长,10% FCS少。组间年龄分布非常相似,这是不可能因素本身有显著的影响。在健康受试者中,复制寿命之间的关系在文化和供体年龄似乎并不存在13,尽管有证据表明,细胞从捐赠者与各种疾病相比,文化展览缩短寿命与正常nondiseased捐助者14。
容易设定,减少扩散率和倾向较低的最大自由人民党在肺气肿反映了,可能是当地,男女童衰老的细胞。相反,它可能是推测,长期需要修复由于香烟烟雾诱发损伤已经使用了一些有限的成纤维细胞分化的能力。高数量的pack-yrs肺气肿患者可能是部分负责。如果间充质细胞的老化,如成纤维细胞在肺气肿的发病机制中发挥作用,洞察这可能有助于治疗策略的发展由于增加干细胞研究领域的知识和组织工程。尽管在人体试验只是一开始,一些结果在肺气肿动物模型表明,肺可以刺激增长,如。由视黄酸衍生品的使用15,16。然而,也有可能其他的表观遗传变化比衰老参与或负责肺气肿的增殖率下降。在这些论点Conversley,谨慎是必需的,有怀疑复制衰老在体外模拟的事件发生在活的有机体内17。
类似于之前的调查人员的实验10,11化验,本研究主要文化后定义良好的条件下进行。它可能认为观察到的组织之间的差异是由于细胞的主要产物过程中产生的差异。意识到这种潜在的偏见,当前作者旨在规范的组织文化,最后细胞密度和主要文化尽可能多的时间。的主要文化团体之间没有差别,尽管显示最大的两种文化(包括肺气肿患者)翻倍,在初代培养也花了最长的时间。是合理的期望成纤维细胞显示较慢的扩散在通道两个增速放缓主要文化。不幸的是,它不可能监控单个细胞的分裂而令人不安的培养条件。因此,在这两个科目的可能性较低数量的细胞的组织样本,因此不得不接受更多分歧在进入后续扩散试验之前,不能被排除。然而,当这两个病人的数据被排除在分析,倍增时间仍在统计上显著的差异(p = 0.003)。
检查翻倍的差异是基于不同的扩散,而不是死亡的速度的差异,细胞生存能力和坏死和凋亡细胞的比例在指数增长和融合性的文化进行评估。在所有情况下,坏死和凋亡细胞的数量较低,高可行性和LDH水平没有显著差异在浮在表面的观察,表明潜在的细胞死亡组之间的速度差异小,不太可能导致细胞数的时间进程的差异。
所有实验进行了培养基中含10% FCS从一个批处理,以保证可比性。通常,10% FCS用于标准文化化验,但众所周知,扩散取决于数量的血清18。当前作者选择10% FCS扩散分析可以更准确地执行,由于更大的细胞数量的变化。然而,10% FCS必须被视为一个强大的非特异性刺激成纤维细胞,这必须考虑的解释结果。在长期的实验中人口也评估低于1% FCS倍增。而对照组仍显示人口翻倍,尽管有限,几乎没有任何肺气肿患者的成纤维细胞增殖。这可能反映了细胞之间的不同刺激的反应。在先前的研究中,成纤维细胞与对照组反应更大程度上与interleukin-1β刺激通过增加扩散和转变增长factor-β1通过减少扩散,与肺气肿患者10。
总的说来,目前的数据表明,肺气肿患者的成纤维细胞显示降低扩散率与细胞对照组相比,文化。这些差异是在标准条件下维护离体的外的炎性环境遇到了比起现场肺成纤维细胞,他们提出一个持久的变化。任何放缓的扩散的速度,如果或刺激,应会妨碍细胞替换,从而加重组织破坏和组织更新之间的不平衡。此外,当前人口翻番水平提供了证据表明数据反映男女童老化因素参与这个过程。还需要进一步的研究来阐明背后的分子机制,也许表观遗传改变成纤维细胞表型的肺气肿。
确认
作者要感谢所有病人在他们的合作和支持他们的研究,在一个情况下,完全可以理解,他们主要关心的是不同的。此外,k . Paasch的技术帮助和b Feindt。
- 收到了2003年12月30日。
- 接受2004年6月23日。
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