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基本原理尽管潜在的重要角色在成人non-cystic纤维化(CF)支气管扩张感染疾病进展,降低航空公司的细菌种类出现在这些病人很差的特征。
目标提供一个全面的横断面分析,细菌含量降低呼吸道样本non-CF支气管扩张患者使用微生物文化无关。
方法成对诱导痰及支气管肺泡灌洗样本,来自41个成人non-CF支气管扩张患者,被16 s核糖体RNA基因焦磷酸测序分析。评估物种的分布和传播使得“核心”和“卫星”细菌种类为这个病人组定义。微生物群特征与临床相关疾病的标志。
测量及主要结果140个细菌物种,包括那些与呼吸道感染有关,更广泛的机会性感染。物种组成的一组核心的物种,发现经常在丰度高,被定义。核心的物种包括那些目前在支气管扩张与感染有关,如铜绿假单胞菌,流感嗜血杆菌和链球菌引起的肺炎许多物种,不太可能通过标准诊断监测报告。其中包括属的成员韦永氏球菌属,普氏菌和奈瑟氏菌属。核心的相对贡献和卫星集团提出了一个低水平的随机物种收购。细菌多样性显著正相关在1 s (FEV用力呼气量1)和细菌群落组成相似性与FEV显著相关1、中性粒细胞计数和莱斯特咳嗽评分。
结论成人患者下呼吸道微生物群的特点non-CF支气管扩张与疾病严重程度的临床标记显著相关。
- 呼吸道感染
- 支气管扩张
- 细菌感染
来自Altmetric.com的统计
关键信息
关键问题是什么?
下呼吸道微生物群在non-cystic纤维化支气管扩张反映疾病进展的临床措施?
底线是什么?
之间存在着显著相关呼吸道微生物群组成和呼吸道疾病的严重性,cough-specific症状和气道炎症。
为什么要读吗?
我们描述一个呼吸道微生物群之间的关系和临床疾病的措施,可以提供一种新的生物标志物,也可能表明因果相互作用
介绍
Non-cystic纤维化(CF)支气管扩张(以下称为支气管扩张)是一种慢性气道疾病的特点是异常破坏和膨胀的大型航空公司、支气管和细支气管。1由于黏膜纤毛的清除功能障碍相关,涉及建立一个恶性循环持续细菌殖民化,支气管粘膜的慢性炎症,和进步组织的破坏。2支气管扩张是经常与慢性和脓性痰,多个发作和进行性呼吸困难,可以成为禁用。1 - 3而支气管扩张会导致各种公认的目的,它通常被认为是特发性。
细菌物种的数量已经通过传统诊断支气管扩张降低呼吸道感染培养的检测;特别是铜绿假单胞菌,流感嗜血杆菌,链球菌引起的肺炎,金黄色葡萄球菌和莫拉克斯氏菌属复活,4某些物种有被证明与临床相关疾病的标志。例如,P绿脓杆菌CF,加速肺功能下降,对预后也有一个不利的影响在non-CF支气管扩张。5,6
由于细菌感染的作用,在维持慢性疾病和急性加重的发生率,获得更好的理解之间的关系气道细菌物种和支气管扩张是很重要的。通常部署,诊断微生物培养适合某些呼吸道病原体的检测。然而,其他细菌物种,特别是那些标准诊断条件下耐火材料增长,可能没有被报道。文化无关的应用技术,检测和识别细菌物种基于核酸序列签名表明物种之间可能存在的巨大差异,文化,和总池的物种存在于低气道样本。7特别是,下一代测序方法的引入导致了细菌物种的详细描述与降低航空公司的呼吸环境,包括CF,8 - 14和慢性阻塞性肺疾病。15 - 17日
重要的是,如此详细的微生物描述还允许气道的微生物群的定义一个特定的条件。的细菌,微生物群是指整个池占领一个给定的身体。微生物群的特点可能临床重要性不同于其复合物种。例如,微生物群的多样性存在于成人患者CF的降低航空公司已被证明是相关的肺功能。9进一步,通过评估患者人群中的分布和分散的微生物群,可以归类的物种发现作为“核心”是常见的在患者和一般丰富或“卫星”,这是罕见的病人通常组和低丰度的检测。这样meta-analytical方法应用了以前在CF肺部感染的背景下,9,12允许鉴定细菌种类特性的一个子集的条件。
我们假设文化无关的应用分析样本与支气管扩张降低航空公司的成年人将揭示的存在不同的细菌微生物群,和微生物群的特征检测与临床疾病的措施。
为了测试这些假设,16 s rRNA基因454焦磷酸测序分析应用于DNA提取支气管肺泡灌洗(BAL)和诱导痰液样本41成人支气管扩张。
材料和方法
祝福的研究是一个12个月的双盲,随机,安慰剂对照研究的小剂量红霉素non-CF支气管扩张患者至少两个感染性肺发作前12个月。18在基线,子群的41名患者没有额外的证据(non-bronchiectasis)慢性呼吸道疾病与一群健康志愿者(包含和排除标准的全部细节保佑研究中,当前子组和对照组中提供在线数据补充)。支气管扩张患者和对照组终身不吸烟者(< 2 pack-year历史),18 - 85岁没有哮喘或特异反应性史,近期呼吸道感染(4周内)或条件,可能影响支气管镜检查的安全性能。支气管扩张患者没有(non-bronchiectasis)急性或慢性呼吸道疾病的证据并没有接受系统性皮质类固醇。大环内酯物所有人都天真并没有研究中的患者接受nebulised抗生素。
正常对照组没有呼吸道疾病的证据,没有使用任何的历史bronchoactive药物和正常肺量测定法(在1 s (FEV用力呼气量1)、用力肺活量(FVC)和FEV的比率1:FVC躺在正常的预测范围内,没有明显的急性吸入支气管扩张剂反应(BD),并没有证据表明小气道阻塞)。全部细节的纳入和排除标准提供的两组在线数据补充。这项研究是板牙人类研究伦理委员会的批准,布里斯班,和所有科目提供了书面知情同意。归纳了病人的细节表1,网上所示的全部细节补充表S1和诊断微生物数据网上所示补充表S2。对照组在网上显示的细节补充表S3。
降低气道样本集合
一个完整的描述中使用的方法的集合BAL中提供了样本在线数据补充。痰诱导4.5%食盐水进行48 h和支气管镜检查前5天之间,使用前面描述的方法。19第一次收集样本存储在−对后续的分子分析80°C,和随后的三个样本(10年、15年和20分钟)汇集和处理测定non-squamous细胞计数(见在线数据补充全部细节)。所有迅速落下帷幕和痰样本冷冻−80°C,随后运往伦敦国王学院在干冰进行处理。
焦磷酸测序
细菌tag-encoded FLX扩增子焦磷酸测序(bTEFAP)如前所述。12中提供了一个完整的描述方法在线数据补充。获得的序列数据已经提交给科学研究协会数据库,由国家生物技术信息中心主办,在研究加入SRA066194数量。
统计分析
为了避免潜在的偏见之间的多样性比较当地社区由于不同数量的每个样本序列,20.一个随机重采样方法,使用三个指标的多样性(类群丰富度(年代*),Shannon-Wiener指数(H′)和辛普森的补充索引(1−D))如前所述。12细菌物种所有样品检测分割成核心和卫星物种群体,泊松分布的测试进行了描述。9回归分析,确定系数(r2),残差和意义(p)计算使用Minitab软件(V.14.20,一款统计软件,大学公园,宾夕法尼亚州,美国)。箱线图生成使用XLSTAT计划(V.2011 Addinsoft,巴黎,法国)。荟萃分析,利用对冲的d效果大小测量,如前所述。12
Bray-Curtis定量群落相似性指数和随后的平均连锁聚类的社区档案进行使用过去(古生物学统计项目,V.2.16),可用来自奥斯陆大学的网站链接(http://folk.uio.no/ohammer/past)。相似的百分比(傻笑)分析是用来确定每个物种的贡献来观察到的样本之间的相似性。傻笑分析如前所述27使用社区分析包(V.4,双鱼座环保有限公司、莱英国)。曼特尔曼特尔和部分测试表现如前所述22使用XLSTAT计划。
结果
病人
成对BAL和诱导痰液样本收集从41支气管扩张患者(见表1人口统计)。目的是特发性(63%),感染性疾病(10 24%)和粉红色(4 10%)。标准的文化痰报道P绿脓杆菌在11个科目(27%),H流感嗜血杆菌在12个(29%)和“正常呼吸道菌群”的余数。
PCR扩增
PCR扩增达到38的41诱导痰液样本DNA提取和对应的41 15 BAL样本DNA提取。四个对照组样品PCR阳性细菌信号提供。没有实现从盐水中提取控制放大。
16 s rRNA基因焦磷酸测序
平均每2753 16 s rRNA基因序列样本(SD±1326),与140年不同的细菌种类检测(见在线补充表S4)。大多数物种的发现与呼吸道感染有关,机会性感染更一般的,或口腔的同桌的人群,包括有氧和厌氧物种(见在线补充表S4)。发现的物种包括支气管扩张通常与慢性感染有关的:H流感嗜血杆菌34的38诱导痰液样本中,检测出(89.5%),P绿脓杆菌在25个(65.8%),年代肺炎在31个(81.6%),年代球菌在7(18.4%)和M复活在10个(26.3%)。培养检测P绿脓杆菌和H流感嗜血杆菌与文化无关序列检测被确认在所有情况下,在15和22名患者,分别。
焦磷酸测序也进行积极的四个健康控制样本细菌PCR获得的信号(两个BAL样本和两个诱导痰液样本)。由于小数量的控制样品的序列数据得到,不可能比较物种分布,获得了支气管扩张样本。然而,细菌类群中确定控制样本,和他们的相对丰富,网上所示补充表S6。符合支气管扩张的分析样本,从痰液样本获得更多的序列与落下帷幕。在痰液样本,低的相对水平S肺炎/ pseudopneumonia(分别为0.15%和1.36%的序列)H流感嗜血杆菌/ 56(分别为0.59%和3.87%)被检测到。未发现其他bronchiectasis-associated物种。
识别“核心”细菌物种
泊松分布测试是用来确定哪些物种发现随机或随机分布在患者,根据其在诱导痰检测样品(见在线补充图S1)。分区的过程提供了一个客观基础物种分为核心和卫星物种组,分别。核心集团是由86种与卫星组(54种图1)。会员的核心和卫星组表示物种中发现在线补充表S4。傻笑的细菌群落相似性分析病人是用来识别那些对观察到的相似的贡献最大的物种。列出了这些物种在减少的贡献,表2。再一次,这些物种(所有核心组成员)代表的混合物与口腔呼吸道病原体和物种,与观察到的样本之间的相似度的最大贡献的存在H流感嗜血杆菌。
箱线图比较意味着多样性的痰样本为所有社区和核心和卫星物种组所有患者(n = 38)。三个多样性的措施:(一)物种丰富度,辛普森(B)的补充索引(一维)和(C) Shannon-Wiener指数(H′)。每个盒子的顶部和底部边界显示75和25日四分位值,分别和线在每个盒子代表50四分位值。胡须的结束标志着最低和最高的多样性值在每一个实例。
比较样本类型
细菌多样性分析诱导痰液样本和BAL样本进行评估的程度两种样品都具有可比性。箱线图比较意味着多样性所示图2。荟萃分析被用来概括所有14成对样品使用对冲的影响' d效果大小测量,12治疗不同样本相互独立的两个样本类型(BAL和痰)作为单独的组内样本。总体样本类型对多样性的影响没有表现出显著的影响在任何使用的多样性的措施(图2)。此外,在个体样本多样性高度可变,BAL和痰液样本配对的荟萃分析显示显著的正面和负面的影响所有多样性措施通过样本类型(见在线补充图S2)。
箱线图比较和分析之间的多样性的一个子集配对BAL和痰液样本(n = 14)。三种措施的多样性;(一)物种丰富度,(B)(1 -辛普森的补充索引D),Shannon-Wiener指数(H)。每个盒子的顶部和底部边界显示75和25日四分位值,分别和线在每个盒子代表50四分位数(媒体)值。胡须的结束标志着最低和最高的多样性值在每一个实例。(D)整体分析的三个措施使用对冲的多样性d影响大小测量之间BAL和痰液样本。列表示效果和误差代表标准错误(SE)的影响大小(n = 14)。交叉的SE酒吧零表示样本类型之间的多样性无显著影响。
与临床相关的细菌群落多样性和相似性措施
发现细菌群落多样性有积极与肺功能(FEV线性相关1),如测量之前和之后,政府BD (图3)。这种关系适用无论分析“所有检测到的细菌”,“核心物种”或“卫星物种”。壁炉架测试被用来确定细菌群落组成相似性(Bray-Curtis相似性度量)与不同的临床疾病的措施。曼特尔显著相关(测试)观察群落组成相似性和FEV之间1(前后BD)无论在“所有检测到的细菌”分析,“核心物种”或“卫星物种”。之间的显著相关性也发现“所有”或核心物种与莱斯特咳嗽评分(LCS),分别痰中性粒细胞计数和性别。曼特尔总结统计显示显著的相关性表3。除了性别,所有其他临床措施被发现co-correlated(见表S5在线补充),反映出他们的共同与呼吸道疾病的关系。部分透露,FEV壁炉架测试1、LCS和痰中性粒细胞数量和性别保持显著的细菌群落组成关系当控制相互影响的临床测量(见在线补充表S6)。
细菌物种丰富度和肺功能之间的关系(在1 s (FEV用力呼气量1%))(A)所有社区,核心组(B)和(C)卫星种群。关系是给pre-bronchodilator (BD)和post-BD值。在每种情况下线性回归线路已经安装。pre BD:所有社区,r2F = 0.20,1,36= 8.72,p = 0.006;核心组,r2F = 0.18,1,36= 7.69,p = 0.009;和卫星群,r2F = 0.20,1,36= 8.87,p = 0.005。邮政BD:所有社区,r2F = 0.14,1,36= 5.69,p = 0.022;核心组,r2F = 0.12,1,36= 5.09,p = 0.030;和卫星群,r2F = 0.11,1,36= 4.20,p = 0.048。
讨论
本研究的目的是描述细菌微生物群与支气管扩张患者的更低的航空公司,并调查之间的关系是否存在微生物群组成和临床疾病的措施。之前解决这些目标,重要的是要考虑样本的方式获得较低的航空公司。保护刷或平衡方法往往是首选由于减少潜在收购上呼吸道细菌。然而,痰诱导微创与支气管镜检查相比,更适合重复抽样。这里介绍的横断面研究代表的一部分,持续的时间研究,评估的相对执行两种抽样方法的适用性。提取物诱导DNA样本被发现产生积极的PCR扩增信号比摘录相应BAL样本更频繁(分别为93%,37%)。比较各自的提取物通过焦磷酸测序获得的细菌多样性报道表明,虽然灵敏度的方法不同,其内容没有明显不同。鉴于诱导痰液提供的更大的覆盖范围,这些样本用于描述微生物群。
这里介绍的焦磷酸测序数据揭示不同气道微生物群,与研究报告的其他慢性呼吸道疾病。8 -文化诊断微生物是专为特定病原体的检测的临床意义,因此,物种报道的数量是有限的。高频率的检测与呼吸道感染有关的物种通常支气管扩张患者的报道,包括P绿脓杆菌,H流感嗜血杆菌,年代肺炎,年代球菌和M复活支持他们的临床重要性。此外,更高频率的检测P绿脓杆菌和H流感嗜血杆菌而培养诊断微生物似乎表明他们的流行,和他们的潜在贡献疾病,还可能比之前认为的更大。在的情况下H流感嗜血杆菌进行比较时,一些必须注意培养和分子检测的报告是基于前水平升高与健康人相比,而不是单独的存在(一样的其他物种,如年代球菌和某些链球菌)。然而,的情况P绿脓杆菌的大小差别是巨大的,其分子的检测分析仅在14个病人(34%)进行了研究。的临床意义尚不清楚,尽管他们可能是重要的考虑到我们最近的研究表明一个特定的子群的好处红霉素治疗受试者基线铜绿假单胞菌感染(通过标准的文化基础技术)。18此外,分子的检测方法H流感嗜血杆菌在这个研究中83%的支气管扩张患者(由文化这一比例为29%)是一个了不起的新发现的临床意义需要进一步评估。
在多样的细菌物种报道,这是可能的,基于分布和分散,归类物种为核心或卫星内微生物群。核心种群鉴定这是大大大卫星种群,对大多数物种目前守恒在患者样本。核心的相对大小和卫星组的成员也预示着一个低水平的随机物种收购,和潜在的选择性气道环境。贡献了大部分的细菌种类的细菌群落相似性,由傻笑的分析,包括许多物种被认为是相关的呼吸道病原体和在某种程度上,支气管扩张,包括H流感嗜血杆菌,P绿脓杆菌和肺炎。然而,有趣的是,许多核心的物种,做出重大贡献的相似性,以前没有与支气管扩张有关。例如,属的成员韦永氏球菌属,奈瑟氏菌属,普氏菌所有核心微生物群成员做出了巨大的贡献。在每种情况下,这些物种不太可能通过标准诊断报告微生物是受雇于气道的分析样本。此外,这些物种通常在文化无关的分析报告CF下呼吸道感染。9,10,23,24
更高的临床意义的多样性细菌物种出现在较低的航空公司比此前认为的支气管扩张患者可能超越个别物种的致病性。细菌多样性之前的研究已经证实,成人CF与肺功能呈正相关肺部感染,9在低多样性可以反映等病原体生长的吗P绿脓杆菌。与先前的研究,在这里,我们报告一个显著相关细菌多样性和细菌群落相似性和FEV之间1。
通过展示,气道中性粒细胞炎症还与细菌群落相似性,我们的数据扩展的结果之前的研究已经表明气道炎症之间的关系和潜在的致病细菌负荷的物种,25的存在P绿脓杆菌在痰。26因此总细菌的社区,而不仅仅是特定的假定的病原菌,在支气管扩张中性气道炎症有关。
同样,LCS之间的关系最近描述和痰细菌负荷的致病菌26现在可以扩展到细菌群落相似性。看到这个标志和LCS之间牢固的关系(但不是每天痰生产或圣乔治呼吸问卷分数)了,咳嗽症状特别的引人关注的可能性都与特定的气道细菌社区。
观察气道微生物群之间的关系特点和措施呼吸道疾病的严重性,cough-specific症状和气道炎症反映在先前的研究报告看在其他情况下呼吸道疾病,比如CF,细菌群落组成被发现与临床疾病进展的标志。10,13这样的关系应该发现non-CF支气管扩张患者持续存在,分析气道微生物群可能的疾病进展的程度,并可能因此有可能作为一种疾病生物标志物。
这项研究有一些局限性,应考虑。下面描述的核心呼吸道微生物群来源于组样本进行了分析,并在多大程度上代表了广泛的支气管扩张患者的人口并不成立。例如,分析基于病人的一个子集愿意并且能够安全地进行支气管镜检查可能有所不同,从更广泛的人口non-CF支气管扩张患者。此外,相对温和的平均气道阻塞病人组时应考虑比较微生物群数据与那些来自其他患者群体。事实上,由于疾病的微生物群特征和标记之间的关系描述,我们会认为考试的支气管扩张患者相似,根据严重程度分层,或其他疾病方面,可能报告的一系列核心微生物群类型。
这项研究集中在定义核心降低气管与支气管扩张相关的微生物群,并检查作为致病微生物群的潜在作用的实体。然而,这并不是贬低的潜在贡献特定病原体的呼吸道疾病,如non-tuberculous分枝杆菌物种或真菌。评估这种病原体的相对贡献,和特定的微生物群组成,疾病进展在这个上下文现在必须通过纵向研究调查,特别是横跨临床重要事件,如急性加重。
执行分析的方式也应该被考虑。在这里,细菌检测是基于提取的总DNA。其他的研究专注于检测气道细菌利用propidium monoazide治疗样本限制的贡献不能存活细菌DNA或细胞外,12或者分析基于反向转录rRNA。27这样的方法可以特别有用,当有大量细菌种群被研究的挑战,例如,通过抗生素治疗。是觉得这里虽然总dna的分析方法,作为呼吸道微生物群的一个初始的横断面调查,将提供最好的机会与日益增长的文献,重点研究支气管扩张相关细菌和降低气道疾病更广泛的微生物群。
在这里,我们报告一个成分之间的显著相关性下呼吸道微生物群non-CF支气管扩张患者呼吸道疾病的严重程度和临床措施。微生物群特征的程度反映了各种疾病,临床方面和核心微生物群的程度随病人的人口统计,现在需要进一步调查。此外,重要的是定义微生物群之间的关系特点和临床关键事件,如发病时间的恶化和产生的抗生素治疗,或由特定病原体感染。微生物群的潜力发挥的因果作用在疾病进展也值得调查。
引用
补充材料
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补充数据
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- 数据补充1——在线补充
脚注
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