文摘gydF4y2Ba
在各种动物模型研究显示肺巨噬细胞的一个重要的角色在肺动脉高压(PH)的发病机制。然而,分子机制描述功能和肺巨噬细胞表型相对于时间定位和区分在很大程度上仍未知。在这项研究中,我们使用一个低氧小鼠模型PH值结合流式细胞仪量化和隔离肺巨噬细胞随时间从两个隔间和描述他们的电视节目通过RNA序列的方法。为了应对缺氧,我们发现早期巨噬细胞数量增加,局限于间质/血管周的隔间里,没有招聘的肺泡巨噬细胞室或居民肺泡巨噬细胞的数量的变化。主成分分析表明之间的整体基因表达显著差异肺泡间质巨噬细胞(IMs)基线和4和14 d后缺氧暴露。肺泡巨噬细胞在第四天,14和IMs在第四天共用一个守恒缺氧项目特征是线粒体功能障碍,炎性基因激活和mTORC1信号,而IMs 14天证明了一个独特的抗炎/ proreparative编程状态。我们得出这样的结论:血管重建的发病机制在缺氧PH值包括早期compartment-independent激活肺巨噬细胞向守恒的缺氧项目,随着compartment-specific项目以后的发展过程中。因此,利用时间-和compartment-specific肺巨噬细胞极化差异需要考虑治疗目标的巨噬细胞在缺氧的PH值和其他潜在的炎症性肺部疾病。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
单核细胞和巨噬细胞积累血管周的内/外膜肺血管重建的空间是一致的特性与肺动脉高压(PH),在人类和所有的动物模型(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。肺动脉高血压患者,外膜的巨噬细胞保持最突出的炎性细胞在血管壁内甚至在终末期疾病患者进行肺移植(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。研究在各种动物模型演示了一个关键角色血管周的巨噬细胞在血管重建过程中PH值(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。虽然是不为人熟知的角色肺泡巨噬细胞在缺氧的PH值(AMs),他们可以直接影响肺泡空间以外的细胞和组织,在他们的缺席,缺氧PH值减(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。然而,刺激促进巨噬细胞招聘和激活仍然不清楚的。我们最近报道在人类和动物模型的PH值外膜成纤维细胞可以招募,保留,并激活巨噬细胞,至少部分通过旁分泌il - 6,导致激活STAT3和HIF1信号和突出proremodeling基因的表达,包括精氨酸酶1 (gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。同样,Vergadi et al。(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)在缺氧小鼠模型PH AMs极化对一个稍微不同的表型,也增加表达的特征gydF4y2Ba__arg1gydF4y2Ba。血红素加氧酶1的超表达这些基因的表达在AMs和减毒缺氧PH值(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。这些数据支持的假设与proremodeling巨噬细胞表型中发挥关键作用的血管重建博士然而,功能性巨噬细胞表型的细胞通路适合促进血管重建的起始及延续和如何将这些通路不同相对于出现缺氧暴露和肺舱(肺泡与间质和血管周的)尚未确定。gydF4y2Ba
增加知识舱和有时限的肺巨噬细胞活化表型可以帮助治疗的设计减弱肺血管重建。更好的定义的主要障碍在肺巨噬细胞表型是很难隔离肺巨噬细胞间质和血管周的隔间。因此,最近的研究只侧重于描述AMs或依赖于使用体外方法,而缺乏充分概括体内微环境。在这项研究中,我们使用流仪测序方法结合RNA (RNAseq)缺氧小鼠模型的PH值分离从肺泡巨噬细胞和间质/血管周的隔间在不同时间点审问巨噬细胞极化相对于时间和隔间。一个时间进程的实验表明,巨噬细胞招聘发生早期低氧暴露(第四天)和限制间隙/血管周的隔间里,没有招聘的肺泡巨噬细胞室或居民AMs的数量的变化。RNAseq数据表明血管重建的发病机制在缺氧的PH值涉及早期compartment-independent激活肺巨噬细胞向守恒缺氧计划,而在之后的病程中,巨噬细胞分化揭示独特compartment-specific项目。这一发现的含义是,治疗的发展目标,PH值需要考虑这巨噬细胞激活的temporo-spatial方面。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
动物gydF4y2Ba
男性8-wk老C57B6老鼠出生在杰克逊实验室(缅因州)保持在模拟海平面高度1周后到达控制温度(22 - 24°C)在12 h光-暗周期。食物和水都可以随意访问。在海平面1周后,老鼠被放置在低比重的低氧室有一段时间的模拟在18000英尺高空缺氧如前所述(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。控制老鼠(normoxia)保持在海平面高度相同的光暗周期。兽医护理标准是根据机构的指导方针符合制度动物保健和使用委员会批准了协议。gydF4y2Ba
疣状gydF4y2Ba
从控制小鼠冷冻OCT-embedded 5μm cryosections (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和小鼠暴露于缺氧4 - 14 d (gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5)处理了间接immunofluorescent分析如前所述gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。简而言之,部分被固定在冷丙酮:甲醇(1:1),孵化主要鼠马伯反对巨噬细胞标记CD68(施用稀释;罗利AbD Serotec (NC)],检测通过使用alexa Biotin-Streptavidin系统- 594进行了荧光染料根据制造商的手册(分子探针/表达载体,弗雷德里克博士)。彩色部分是安装VectaShield包埋介质与DAPI(向量实验室,伯林盖姆,CA)和蔡司荧光显微镜下检查。图像是获得使用AxioVision数字成像系统。gydF4y2Ba
组织准备和流式细胞术gydF4y2Ba
支气管肺泡液体得到四连环灌洗后用1毫升PBS 2毫米EDTA。在染色细胞被洗,颗粒状和resuspended缓冲区,PBS Hyclone 1%的边后卫(通用电气医疗集团生命科学)。一个整除,与台盼蓝染色,通过血细胞计数器计数。肺组织,老鼠和吸入异氟烷麻醉,retro-orbitally注射4μl CD45 Ab(克隆30-F11;BD生物科学)。5分钟后,老鼠牺牲,灌注肺组织与PBS和剁碎。肺与胶原酶消化(40 U /毫升)(罗氏)和DNase我(10000 U /毫升)(热科学)30分钟在37°C,颗粒状350×gydF4y2BaggydF4y2Ba,细胞溶解红细胞裂解缓冲(eBioscience)在室温下5分钟,清洗,并通过70μm尼龙网过滤器,过滤和resuspended与染色PBS缓冲。染色之前,FcγR受阻anti-CD16 / CD32 Ab (BD生物科学)10分钟。细胞染色30 - 45分钟在4°C以下的结合Abs: CD45-APC-Cy7(克隆30-F11;BD生物科学)、CD64-AF647(克隆×54-5/7.1;BD生物科学)、CD11b-BV510(克隆M1/70;BD生物科学)、CD11c-FITC(克隆HL3;BD生物科学)Ly6G-EF450(克隆1 a8;BD生物科学),CD3-V450 (clone17A2;BD生物科学)、CD45R-V450(克隆RA3-6B2;BD生物科学)。流式细胞术之前,细胞通过40μm过滤器过滤,水洗,颗粒状,resuspended染色缓冲区或排序缓冲区(PBS 1毫米EDTA 25毫米消息灵通的pH值7 1%的边后卫)。 Flow cytometry analysis and cell sorting were conducted at the University of Colorado Cancer Center Flow Cytometry Core Facility using a Gallios 561 flow cytometer (Beckman Coulter) for analysis and XDP-100 (Beckman Coulter) cell sorters for sorting. FACS counting beads (BD Biosciences) were used to calculated absolute cell numbers during analysis. The sorting strategy involved exclusion of debris and cell doublets by light scatter and dead cells by DAPI (1 mg/ml). Cells were sorted into 1 ml HBSS (Thermo Fisher) with 1% Hyclone FBS. Purity checks were performed on all samples. Data were analyzed using Kaluza (Beckman Coulter) and FlowJo software (Treestar).
RNA提取、定量PCR和RNAseqgydF4y2Ba
RNA隔离和后续RNAseq细胞池从三个老鼠肺部和在生物一式三份。总RNA从流式细胞仪分离细胞混合使用试剂盒(Ambion)提取和RNeasy MinElute清理工具(试剂盒)。细胞细胞溶解在试剂盒,氯仿在1:5的比例添加,颗粒状12000×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟,水层和结合1:1和100%乙醇,并放在一个试剂盒MinElute列。RNA是进一步清理/ RNeasy MinElute协议(试剂盒)。使用NanoDrop RNA质量和数量进行了分析和生物分析仪。合成第一链cDNA执行使用一个iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad大力神,CA)。使用TaqMan探测和执行定量rt - pcr试剂(应用生物系统公司、大岛,纽约),根据制造商的指示。基因表达计算归一化后使用ΔHprt1 /Δ周期阈值方法。RNAseq图书馆准备和测序进行基因组学和微阵列安舒茨医学核心丹佛科罗拉多大学的校园。图书馆是构建使用NuGen热烈欢迎人类FFPE RNAseq多路复用系统套件定制mouse-specific除核糖体rna寡核苷酸。使用Illumina公司进行定向mRNAseq HiSEquation 2000系统,使用single-read 100周期的选择。gydF4y2Ba
生物信息学gydF4y2Ba
派生的序列进行了分析通过应用自定义计算管道组成的开源gSNAP,袖扣,R基因差异表达的序列比对,确定(CITES) (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。简而言之,读取生成映射到鼠标gSNAP基因组(mm10),表达式(每百万碎片每千碱基的外显子片段映射,FKPM)派生的袖扣,与方差分析和微分表达式分析了r数据分析通过使用试剂盒的聪明才智通路分析(IPA)(试剂盒,红木市,gydF4y2Bahttp://www.qiagen.com/ingenuitygydF4y2Ba)。利用RNA汇集从三个老鼠和执行生物实验一式三份(除了海平面,在生物复制),我们有99%的样本大小和力量gydF4y2BapgydF4y2Ba巨噬细胞的数量值< 0.05。异丙醇分析过滤数据集上执行的每个巨噬细胞的截止值集gydF4y2Ba问gydF4y2Ba< 0.05,绝对患病率从基线,FKPM > 5在任何一个比较。相应的海平面巨噬细胞作为基准进行比较,即。4点,海平面较低氧的一天。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
在缺氧暴露肺巨噬细胞招聘仅限于血管周的空间gydF4y2Ba
我们首先要确定肺泡巨噬细胞的数量和间质隔间随时间变化对缺氧的反应。使用定性组织学方法,我们证实缺氧暴露,CD68巨噬细胞早期积累(第四天)血管周的巨噬细胞的血管周的空间减弱14天(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。我们没有观察染色增加CD68在缺氧小鼠肺泡间相对于常氧小鼠(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。更加明确地量化居民和招募了肺泡内巨噬细胞和间质隔间随着时间的推移,我们下一个使用流式细胞仪的方法。C57B6J老鼠暴露在4、7、14日或者28 d低比重的缺氧(18000英尺)或海平面,在天的牺牲,肺组织保持酶的消化,巨噬细胞用流式细胞仪进行了分析。隔离不同的巨噬细胞的数量,我们使用流式细胞仪技术在肺巨噬细胞和单核细胞分为三个隔间:识别CD64的肺泡间隔gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD11cgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba,CD11bgydF4y2Ba罗gydF4y2Ba,i.v.-CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞,间质间通过识别CD64 + CD11cgydF4y2Ba罗gydF4y2Ba,CD11bgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba,i.v.-CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,血管内或通过识别CD64加边舱gydF4y2Ba昏暗的gydF4y2Ba,CD11bgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba,i.v.-CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。通过注射小鼠增长值CD45 Ab安乐死,前5分钟加边白细胞(注射CD45 AbgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞)无法刷新的血管可以被排除在外(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。剩下的增长值Ab CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba肺实质细胞,排除后死细胞,T和B淋巴细胞和中性粒细胞,巨噬细胞被定义为通过CD64的表情,然后进一步分为基于表达式的肺泡巨噬细胞和non-alveolar CD11c CD11b:肺泡CD11cgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba罗gydF4y2Ba和non-alveolar CD11cgydF4y2Ba罗gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba。虽然这些细胞是白细胞,因此表达CD45,他们不输液注射CD45 Ab染色(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。因为解决困难从血管周围间隙空间或peribronchoalveolar空间通过显微镜由于重叠的空间安排,以及无法区分基于细胞巨噬细胞表面标记在这些有时分开,我们集体在这些空间指的是巨噬细胞间质巨噬细胞(IMs)和将作为CD11b引用它们gydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba巨噬细胞。相反,我们将参考CD11c AMsgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba巨噬细胞。使用上述策略,我们观察到,在分析时间进程CD11b积累gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaIMs,最大4 d后缺氧和减少由14天之后到基线水平,进一步支持我们的组织学分析gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。一种半定量的方法证明了IMs的百分比增加附近的第四天,回到基线第十四天(gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。这一发现进一步证实了使用定量计数珠方法(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。虽然是一个互惠的AMs减少缺氧4 d后使用半定量的方法(gydF4y2Ba补充图1 cgydF4y2Ba),没有变化的是数字量化使用高度精确计数珠(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图1 dgydF4y2Ba)。此外,没有差异AMs支气管肺泡灌洗(BAL)流体量化通过计算珠子或血细胞计数器(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。重要的是,我们没有发现CD11bgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba阳性细胞在肺泡空间在任何时间点,这进一步证实了巨噬细胞的缺失招聘肺泡空间(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba),并解释了为什么AMs的数量并没有改变。因此,CD11cgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba积极的巨噬细胞是肺泡CD11b和空间限制gydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba积极的巨噬细胞似乎是招募和保持间隙空间。gydF4y2Ba
我和IM编程是独特的在基线和应对缺氧暴露gydF4y2Ba
我们未来雇佣RNAseq分析来获得一个客观的、全面的基因表达谱和信号通路在肺泡和IM子集在基线和对缺氧的反应。基于时间过程分析的结果如上图所示(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba),我们选择执行RNAseq 0天(即。,mice that remained at sea level), and on day 4 and 14 of hypoxic exposure. We used the strategy described in补充图1gydF4y2Ba因为它最清晰地定义在肺泡巨噬细胞和间质血管内舱舱和仔细地排除了任何细胞(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。主成分分析验证了先前的观察,天真CD11cgydF4y2Ba嗨gydF4y2BaAMs和CD11bgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba在基线(IMs是非常不同的gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。为了应对缺氧,IMs和AMs显著改变基因表达,并继续保持显著不同通过14 d缺氧。(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。有趣的是,PC1,分离的IMs AMs确定为20%,而PC2,缺氧暴露与海平面的分水岭,决心为17%,这表明海平面分开缺氧巨噬细胞的差异不如那些伟大的AMs和IMs(分开gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
肺巨噬细胞表现出独特的和共享的项目对缺氧的反应gydF4y2Ba
尽管这些巨噬细胞的整体基因表达显著不同子集在基线和应对缺氧,我们想要确定是否有任何共享两个巨噬细胞缺氧项目数量随着时间的推移。我们假设由于compartment-specific不同的微环境,AMs和IMs将展示独特的编程缺氧反应的变化。RNAseq识别差异表达基因的细胞群之间的数据(IM和我)和不同时间点之间(海平面、4和14 d缺氧),我们使用以下截止条件:FKPM≥5至少在一个条件和≥2倍在任何与错误发现调整的变化gydF4y2BapgydF4y2Ba值,gydF4y2Ba问gydF4y2Ba< 0.05。2672年所有成对的比较我们发现显著差异表达基因根据以上标准,和我们使用这些组的基因通路分析和功能注释的研究。我们生成了一个全球的热图显示所有2672个差异表达基因不同巨噬细胞之间的子集(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。热图显示三个重要发现:1)缺氧显著改变基因表达在IMs和AMs;2)共享和独特的基因表达谱在IMs和AMs缺氧反应观察;3)基因表达谱在AMs天4和14几乎是没有区别的,而IMs在第四天之间有显著的异质性和14。AMs共享大约三分之二的差异表达基因第四天至14,而不到一半的那些共享在IMs第四天至14,进一步表明AMs更保守基因表达缺氧反应相对于IMs (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。维恩图还强调,在AMs有越来越多的调节基因通过14天,而IMs展览最大upregulation基因在第四天,下降14天(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。结合数据所示的热图,这表明IMs进行极化转变与衰减之间的整体基因表达一天4和14。gydF4y2Ba
缺氧导致的早期compartment-independent激活肺巨噬细胞向守恒的缺氧程序后来compartment-specific项目gydF4y2Ba
音标是用来审问的主要途径和具体比较两个巨噬细胞内的编程更改子集(IMs和AMs)。异丙醇进行利用的2762个差异表达基因的热图(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba值< 0.05,褶皱变化≥2)。这个软件能够组织基因与一个已知的途径gydF4y2BapgydF4y2Ba值的百分比的反映基因数据库的路径,和gydF4y2BaZgydF4y2Ba分数,预测是否通路被激活或抑制。我们使用的非常重要的短裤:gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05和绝对的gydF4y2BaZgydF4y2Ba分数≥2。AMs的规范化途径和上游的监管机构主要是相同的在第四天,14增加极化的趋势在第14天,所反映的增加gydF4y2BaZgydF4y2Ba分数在几乎所有通路(越来越消极的或更积极的)天4至14 (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。相反,在IMs几乎所有顶尖的规范化途径和上游监管机构发现增加在第四天下降了14天(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。这是反映在一个绝对减少gydF4y2BaZgydF4y2Ba评分(正面或负面)在这些途径在第14天(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。此外,我们发现最差异表达途径和上游的监管机构主要是同样在AMs在缺氧时间进程和IMs在第四天,但是不是在天14 IMs (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。这些发现也明显AMs时直接从两个时间点相比,第四天IMs (gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba),14天IMs (gydF4y2Ba补充图2 bgydF4y2Ba)。综上所述,这些路径分析表明,在早期,肺巨噬细胞在这两个隔间都极化朝着一个共同的缺氧反应程序。在低氧暴露,AMs继续保持这种激活状态而IMs成为普遍减少炎症和事实上表达抗炎基因(见下文)。重要的是,许多规范途径和上游第14天的监管机构IMs是相对于基线抑制巨噬细胞。gydF4y2Ba
为了应对缺氧,AMs和早期IMs的特点是增加mTORC1信号和代谢的变化gydF4y2Ba
因为基因表达变化在AMs天4和14非常类似于在IMs在第四天,我们一起分组这三个子集,以确定定义假设缺氧的主要通路计划。为此,我们与所有主要的规范途径(创建数据表gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)和上游与绝对的监管机构gydF4y2BaZgydF4y2Ba截止2和一个gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05 (gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。此外,我们创建了一个正则路径表使用gydF4y2BapgydF4y2Ba截止值< 0.05的情况下有一个非常重要的途径gydF4y2BaZgydF4y2Ba分数不能计算(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。顶部一般正则路径之间共享的三个子集包括增加EIF2,ρ,和肌动蛋白细胞骨架信号以及细胞代谢的变化包括氧化磷酸化、线粒体功能异常和糖酵解(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。另外,胆固醇生物合成是非常重要的,但这似乎是唯一的AMs (gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。进一步检查常见的规范途径和上游监管机构显示一个更具体的缺氧程序被定义为激活先天免疫途径齐聚mTORC1信号增加(gydF4y2Ba5无花果。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。特定的上游监管机构包括抑制RICTOR / mTORC2 EIF2-AK2 MAP4K4和激活,兵,EIF4, mTORC1, MYC, FOXO1,兵,所有符合mTORC1激活,抑制mTORC2 (gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。的主要上游监管机构包括先天免疫激活HIF1, IFNG, IL1B, NFKB, STAT3 MYD88, TNF, TLR (gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba总结了交叉mTORC1、新陈代谢和先天免疫。为了进一步阐明个人描述这群巨噬细胞的基因,我们创建了一个表的所有差异表达基因(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba值< 0.05,褶皱变化≥2)群内共享的AMs在天4和14和IMs第四天,但不是差异表达在IMs D14 (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)。AMs天4和14 IMs在第四天分享upregulation中涉及一系列特定的基因通路分析上图:促炎/重构基因:Mif, S100a4, Thbs1, Il1b,亚兰。新陈代谢:Pkm Pgk1 Ldha。MTOR信号:Lamtor1 5 Eif4e。FKPM样本之间的值非常一致的生物样品和进一步验证这些数据(gydF4y2Ba补充图2摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
后14 d的缺氧,IMs重组抗炎和proreparative / proremodeling信号gydF4y2Ba
证明了在gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba,有一个相当大的相似性主要规范途径和上游的监管机构IMs天4和14与海平面控制相比。然而,我们想要确定哪些编程更改第14天IMs独有。所示gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba唯一的主要规范与绝对路径gydF4y2BaZgydF4y2Ba分数≥2 (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)在IMs在第14天不同的角色模式识别受体细菌和病毒在IM下调14天(gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−2.24)并在IMs在第四天不变。同样地,我们发现上游与绝对的监管机构gydF4y2BaZgydF4y2Ba分数≥2,不同于IMs在第四天(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。表示在gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba大多数的调节通路是抗炎,而下调促炎的途径。符合这些发现,当我们分析独特的特定基因差异表达我天14比4和14和IMs批AMs在天第四天,大量的促炎基因的差别我们发现对这些包括il - 6, Mapkapk2, Ccl2, Irf7 Fgfr1、Thbs1 (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)。FKPM价值观相似的生物中复制样品,进一步验证这个数据(gydF4y2Ba补充图2摄氏度gydF4y2Ba)。进一步验证这些发现,我们进行了定量PCR使用RNAseq几个基因数据集与缺氧肺动脉高压。我们表明,定量PCR数据(规范化次黄嘌呤phosphoribosyltransferase和第四天缺氧)很大程度上是符合RNAseq数据对应的基因(gydF4y2Ba补充图2 dgydF4y2Ba)。误差是由于相当大,不符合统计学意义重大的改变在次黄嘌呤phosphoribosyltransferase缺氧和intersample可变性(平均三个样本)。在我们的经验中,没有理想的看家基因缺氧暴露和RNAseq数据少得多的变量和不依赖于标准化看家基因。gydF4y2Ba
接下来,更具体地说地址编程更改,只有4和14 d之间发生缺氧,我们使用第四天IMs作为基准比较,第14天IMs(所有之前比较海平面巨噬细胞作为基线)。因为是微妙的差异,我们使用的截止条件gydF4y2Ba问gydF4y2Ba值< 0.2和褶皱的变化≥1.5最大化的途径(gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。再一次,我们发现编程变化预测抗炎和proremodeling /修复通路的激活和抑制那些促炎(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。因此,缺氧4和14 d之间,有一个编程转变IMs的表型表达抗炎和proreparative基因和通路。有趣的是,这种编程发生改变与血管周的巨噬细胞的数量明显减少,不仅代表了一种减毒表型从IMs在第四天,但一个完全独特的表型与天真的居民相比。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
缺氧细胞上的具体影响,驻留在肺部,及其随后的角色在肺血管重建和肺动脉高压的发展描述(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。此外,许多组织已经证明的重要性,单核细胞和巨噬细胞在缺氧肺动脉高压的发展(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。由于固有的困难识别和隔离肺巨噬细胞体内,没有人试图仔细表型项目,描述人类巨噬细胞或任何肺动脉高压的动物模型。使用肺动脉高压的缺氧小鼠模型,结合流式细胞术和RNAseq方法,据我们所知,我们目前首次详细描述基因表达谱和信号通路在肺泡巨噬细胞和间质/血管周的低氧暴露的时间进程。我们发现最初为了应对缺氧,肺巨噬细胞在间质和肺泡间隔显示一个守恒缺氧项目特征是线粒体功能障碍,炎性基因激活和mTORC1信号,而后来缺氧IMs重组过程中一个独特的抗炎/ proreparative状态。而相比其他编程天真的AMs和IMs在静止情况下,据我们所知我们是第一个报道直接比较疾病状态(一分之二gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。最大化我们的生物信息学数据的有效性,RNAseq执行在生物样品一式三份和三个集中老鼠每样本为我们的生物信息学利用严格的截止条件。虽然我们依赖音标的数据分析,我们更进一步确认之间的主要差异表达基因不同巨噬细胞群同意生物信息学方法,进一步证明FKPM值的一致性在多个基因在生物样本。gydF4y2Ba
在低氧大鼠符合我们之前的观察,我们发现缺氧导致的早期积累巨噬细胞间质/血管周的空间(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。虽然我们的流式细胞仪技术无法区分CD11b是否增加gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaIMs包括间质、血管周的或peri-bronchoalveolar巨噬细胞,我们赠送的组织学研究结果认为赞成这些巨噬细胞主要血管周的。我们的研究结果都符合并进一步扩展以前的观测Amsellem et al。(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)也报道总肺巨噬细胞没有变化,但F4/80增加gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血管周的小鼠巨噬细胞经过18 d的缺氧。虽然我们没有血统跟踪实验中,血管周的巨噬细胞数量的增加可能是由于循环细胞的招聘,而不是本地扩散(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。我们研究一个意想不到的和重要的发现是,我们并没有观察招募CD11b积累gydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba肺泡巨噬细胞的空间,我们也没有找到数量的增加居民CD11c AMs在缺氧的时间进程。因此,我们的研究挑战当前假设AMs数量的增加是由于招聘循环细胞(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。这个假设主要是基于发现单核细胞招聘趋化因子MCP-1被报道在整个肺组织和分泌增加了AMs进入肺泡空间和体循环缺氧,尽管后者可能不是真正的老鼠(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。据BAL巨噬细胞数量增加了他人,观察到的几小时内缺氧暴露在老鼠可能代表增加inflammation-induced lavagability,随着时间点选择在这些研究还为时过早解释招聘肺泡巨噬细胞的空间或细胞分裂发生(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。其他小组展示增加数量的AMs在应对缺氧量化AMs BAL流体在不同的时间点,但并不是在整个肺(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。因为只有一小部分AMs lavagable (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba),我们量化AMs在全部肺组织和使用计数珠子落下帷幕,提供最准确的方法(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。因此,我们的数据支持,AMs由单一居民定量细胞保持人口稳定在缺氧的时间进程。相反,IMs由单一的居民人口细胞基线,混合居住人口和招募细胞缺氧4 d后,和更多的同质人口与一些招募巨噬细胞重新编程细胞后14 d的缺氧。gydF4y2Ba
我们有些预期观察到AMs和IMs展示显著不同的基因表达谱在基线和缺氧暴露后,可能由于微环境的差异和个体发生(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。有趣的是,尽管大型整体IMs和AMs之间的基因表达差异,我们发现4 d缺氧暴露后,有大量的共享两者之间的基因表达谱,表明缺氧早期常见的反应模式。这一发现令人吃惊鉴于肺泡和间隙空间在缺氧的微环境暴露展示重要的差异对氧张力,剪切应力和血流量的变化,,和交互,这样人会期望compartment-specific反应。此外,IMs是居民和招募了细胞的混合人口在这个时间点。这个基因表达程序被激活的基因参与mTORC1特征信号,新陈代谢,和先天免疫。我们建议,如果是技术上可行,居民从招募了IMs在第四天,进一步的基因表达差异的两个明显的(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。随着缺氧时间进程的进行,AMs继续表现出相似的分化表型观察到第四天,而IMs进行编程的转变。随着IMs是减少数量的第四天至14,我们发现了一个以上的差别将对这些增加的炎症通路在第四天。有趣的是,这人口IM 14天显示转录概况特点是抗炎和proreparative通路的激活和失活的促炎。更重要的是,这种极化状态的缺氧IMs 14天不同于观察海平面居民巨噬细胞和由各种抗炎基因的表达特征,表明不同的抗炎表型。与天真的居民相比我在海平面,这不同的巨噬细胞显示一系列抑制促炎通路包括TLR,兵,并与抗炎通路的激活干扰素信号包括双特异性phosphatase-1 (DUSP1)、血红素加氧酶1,丝氨酸/苏氨酸激酶11日和肝x受体(LXR)。MAP激酶phosphatase-1,也称为DUSP1,似乎是重要的限制炎症反应和精氨酸酶表达在缺氧的PH值,作为其删除导致夸张的PH值和精氨酸酶I / II表达式全部小鼠肺(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。与此一致的是,精氨酸酶1 108倍增加在IMs第四天与海平面相比,只有22倍增加了14天(数据没有显示)。此外,DUSP1已被证明是关键限制LPS-induced巨噬细胞的炎症反应(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。Hmox1过度变弱缺氧PH值和似乎调解雷帕霉素的保护作用,MTOR抑制剂,在缺氧的PH值(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。丝氨酸/苏氨酸激酶11磷酸化,激活5′腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶的生成,导致主机mTORC1和HIF1a(差别的抗炎作用,包括对这些gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。关于LXRs在PH值而鲜为人知,macrophage-specific LXR信号是重要的抑制巨噬细胞激活和通过抑制巨噬细胞anti-fibrotic招聘和macrophage-induced释放il - 6 (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。虽然缺氧小鼠证明只有轻度肺血管重建,我们发现结缔组织生长因子,完善中介肺血管重建的PH值,在第14天激活IMs IMs(相对于第四天gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。我们假设协调抗炎和proreparative编程状态在IMs缺氧小鼠限制进步血管周的重塑在PH值的其他动物模型。gydF4y2Ba
PH值的低氧小鼠模型的特点是早期轻度炎症和肺血管重建明显减少整个肺部炎症,回国后第14天开始并完成解决装修normoxia (gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。考虑到这一点,我们推测,第14天IM偏振状态可能发挥重要的作用在调节肺部炎症,以应对缺氧,甚至采取行动抑制慢性non-resolving炎症和血管重建。未来的研究将会用来检验这个假设可能选择性耗尽IMs在缺氧暴露在不同的时间点。有趣的是,类似的抗炎和proresolving巨噬细胞表型被发现在其他纤维化模型,删除的巨噬细胞在纤维化阶段减毒纤维化,而在后来修复阶段促进纤维化(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。几乎相同的研究结果中也发现了博来霉素肺纤维化小鼠模型(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。此外,在人类糖尿病足溃疡、隔离炎性巨噬细胞预测是一小块没有治愈溃疡伤口而含有抗炎巨噬细胞更容易接受伤口愈合(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。因此,我们假设在严重缺氧的PH值形式的特点是持续的肺血管重建,包括野百合碱老鼠,初生牛犊,和一些人类血管周的巨噬细胞的极化未能转向抗炎表型类似于本研究中描述的一个(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
AMs和早期特征的低氧项目(第四天)IMs包括mTORC1信号的变化,代谢,和激活先天免疫途径,描述了关于缺氧和肺动脉高压(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。虽然先天免疫的作用通路包括NFKB IL1B, il - 6, TLR信号IFN-γ,HIF-1,和STAT3信号描述关于他们的角色在肺动脉高压,很少在PH值的上下文中被巨噬细胞(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)。我们之前证明体外成纤维细胞分离与PH极化初生牛犊和人类巨噬细胞通过旁分泌il - 6的表型特征的STAT3的表达,增加HIF1,精氨酸酶1 (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。mTORC1信号增加肺部和专门的肺动脉平滑肌细胞从动物模型和人类与酸碱及其变弱抑制实验(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba)。mTOR信号似乎与LPS激活巨噬细胞巨噬细胞极化的关键(M1)显示一个mTORC1 /糖酵解表型而il - 4激活巨噬细胞(M2)演示mTORC2表达增加,脂肪酸氧化(gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。在树突细胞,这TLR-induced糖酵解转变引起的被发现HIF1a依赖、没有和1型干扰素的生产(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。此外,mTORC1激活巨噬细胞的紧密联系与IL1B NLRP3 inflammasome激活响应有限合伙人(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)。虽然M1 / M2范式是过于简单描述体内巨噬细胞编程,我们的数据支持这一想法,缺氧AMs和早期IMs似乎倾向于一个M1-like程序的一个集成的网络信号一致的上下文中描述缺氧肺动脉高压(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
意味着我们的发现是,治疗的发展目标,PH值需要考虑巨噬细胞激活的temporo-spatial方面似乎有可能反对的角色发展的巨噬细胞缺氧博士更好的理解这可能促进试图利用修复在肺巨噬细胞功能或炎性巨噬细胞重新编程减弱血管重建。这只触及到了问题的表面理解巨噬细胞在缺氧的PH值的精确作用重要基本问题仍有待回答。例如,招聘循环单核细胞的血管周的空间显得为缺氧PH值的发展是必要的,然而,IMs和AMs的相对贡献的启动和维护肺血管重建仍然是未知的(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。整理的相对贡献AMs和IMs在缺氧的PH值,我们会采用转基因小鼠巨噬细胞可以干净地和有效地删除只在肺泡或间隙隔间,然而,这些老鼠(目前不存在gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。尽管如此,最近的证据显示我们可以区分居民从动脉招募巨噬细胞基于细胞表面标记(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。结合非常有效的巨噬细胞删除系统,即。,hCD68-rtTA-tetDTA (diphtheria toxin–mediated CD68 macrophage deletion), with the various known cell-surface markers that distinguish macrophage subsets should allow for the creation of transgenic mice that can answer these questions and many more in any mouse lung injury model (60gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
作者没有利益上的冲突。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢科罗拉多大学癌症中心的成员流式细胞仪核心寻求帮助与流式细胞术和基因组学和微阵列的核心与RNAseq援助。我们感谢彼得汉森援助与手稿和指导实验,用免疫染色和亚历克斯·麦肯的援助。最后,我们感谢肯尼斯·琼斯博士专业知识与RNAseq分析。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这项工作是由美国国立卫生研究院的资助1 r01hl114887-03和5 P01 HL014985-40A1 K.R.S. ()。流式细胞术和基因组学和微阵列共享资源得到美国国立卫生研究院的支持/国家癌症研究所科罗拉多大学癌症中心支持格兰特P30 CA046934。gydF4y2Ba
RNA-sequencing数据呈现在这篇文章中已经提交给国家生物技术信息中心基因表达综合(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)加入GSE87602数量。gydF4y2Ba
本文包含的在线版本gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本文中使用的缩写:gydF4y2Ba
- 我gydF4y2Ba
- 肺泡巨噬细胞gydF4y2Ba
- 落下帷幕gydF4y2Ba
- 支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
- DUSP1gydF4y2Ba
- 双特异性phosphatase-1gydF4y2Ba
- FKPMgydF4y2Ba
- 每百万碎片每千碱基片段的外显子映射gydF4y2Ba
- 即时通讯gydF4y2Ba
- 间质巨噬细胞gydF4y2Ba
- 异丙醇gydF4y2Ba
- 创新途径分析gydF4y2Ba
- LXRgydF4y2Ba
- 肝x受体gydF4y2Ba
- PH值gydF4y2Ba
- 肺动脉高压gydF4y2Ba
- RNAseqgydF4y2Ba
- RNA序列。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2016年10月4日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2017年4月12日。gydF4y2Ba
- 版权©2017年由美国免疫学家协会有限公司gydF4y2Ba
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