摘要
鼻病毒是在哮喘发作牵连重要的呼吸道病原体。通过该鼻病毒触发下呼吸道炎症应答的机制了解甚少,特别是它们感染下呼吸道的能力。支气管炎症细胞(淋巴细胞和嗜酸性粒细胞)募集已被证明。IL-8是一种强效的促炎趋化因子是趋化嗜中性粒细胞,淋巴细胞,嗜酸性粒细胞和单核细胞,并且可以是在病毒诱导的哮喘的发病很重要的。IL-8水平的增加已经在自然和实验性鼻病毒感染鼻样品中被发现。在这些研究中,我们检查因此鼻病毒的感染转化的下呼吸道上皮细胞系(A549)的能力,并且诱导的IL-8蛋白释放和mRNA诱导。我们观察到,鼻病毒类型9能够接受完整的病毒复制A549细胞,峰值病毒滴度发现接种后24小时。感染和增加的IL-8的表达,这是最大的感染后3至24小时后鼻病毒感染诱导的剂量和时间依赖性的IL-8释放长达5天。病毒完全抑制复制的UV失活,但仅减小IL-8蛋白的生产和mRNA诱导了一半,而预防病毒受体的结合被完全抑制病毒诱导的IL-8释放,表明所观察到的效应部分是由于病毒复制,部分是由于病毒受体结合。 These studies demonstrate that rhinoviruses are capable of infecting a pulmonary epithelial cell line and inducing IL-8 release. These findings may be important in understanding the pathogenesis of rhinovirus-induced asthma exacerbations.
鼻病毒是最常见的上呼吸道病原体,引起大多数普通感冒以及中耳炎、鼻窦炎和支气管炎的并发症。最近的研究也强调了这种病毒在诱导哮喘恶化中的重要性。最近的三项研究提供了证据,证明鼻病毒与社区成人和儿童哮喘的大多数加重有关(1,2),以及病情加重需要住院治疗(3.).
鼻病毒感染的生物学仍然知之甚少。鼻病毒侵染鼻上皮细胞(4),并引起与激肽产生相关的局部炎症反应(5)和,在特征受试者中,组胺(6).对鼻病毒感染的鼻黏膜细胞免疫反应的性质尚不清楚(7),尽管在鼻病毒感染的鼻分泌物中已证实中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量增加(8,9).在鼻病毒感染中,涉及这些炎症细胞招募和激活的细胞因子在很大程度上是未知的。IL-1、-6和-8水平的升高已经在来自实验鼻病毒感染的受试者的鼻腔清洗中得到证实(10.,11.,12.),在有上呼吸道感染症状的婴儿和幼儿的鼻吸出物样本中检测到IL-11,其中一些儿童有喘息症状(13.),我们最近也证实了野生型鼻病毒感染儿童鼻腔吸入物中IL-8和中性粒细胞产物髓过氧化物酶水平升高(14.).IL-8是一种有效的中性粒细胞化学助剂和活化剂。在鼻腔吸气IL-8和肌髓氧化酶水平之间以及肌释嗪酶水平和上呼吸症状严重程度之间的密切相关性,提出了对鼻病毒感染中的鼻腔病毒感染中的中性粒细胞介导的鼻腔感染炎症的重要作用。14.).
正常人对鼻病毒感染下气道反应的了解要少得多;事实上,关于鼻病毒是否会感染下呼吸道(15.).最近的两项研究已经在实验性鼻病毒鼻感染期间研究了正常受试者的下气道。第一个发现脊索病毒在较低气道灌洗细胞种群中的证据(16.),第二个找到了有标记的CD3+,CD4+,及CD8+支气管活检中淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润(17.).
嗜酸性粒细胞支气管粘膜浸润是哮喘发病机理的主要特征(18.),嗜酸性粒细胞浸润也涉及病毒诱导的哮喘加剧。实验性感染研究表明,在哮喘或过敏性鼻耳受试者中,单独或与并发过敏原攻击的鼻病毒感染引发的嗜酸性粒细胞渗透比正常受试者更长17.,19.).
鼻病毒感染引发哮喘加重的确切机制尚不清楚。然而,最近的一项研究表明,IL-8鼻腔灌洗水平与鼻病毒实验感染引起的支气管超反应性增加之间存在相关性,这表明IL-8的重要作用(12.).此外,IL-8与体外淋巴细胞趋化作用有关(20),以及在体内和体外对嗜酸性粒细胞的化学吸引和激活(21,22).
鉴于IL-8的病毒诱导的哮喘发作和最近地表明鼻病毒感染刺激的IL-8从转化的支气管上皮细胞系BEAS 2B的释放(推定的重要作用23),我们评估了鼻病毒感染肺上皮细胞系(A549)的能力,并研究了IL-8的释放机制。我们发现低级生产,但非胞菌菌病毒感染的上皮,导致IL-8 mRNA的延长释放释放IL-8蛋白和上调。IL-8的诱导仅部分依赖于病毒复制。
材料和方法
细胞培养
A549细胞,一种转化的肺泡上皮细胞系(24),从美国类型培养收藏(ATCC, Rockville, MD)。细胞每周分裂两次。俄亥俄海拉细胞从英国索尔兹伯里医学研究委员会普通感冒组获得,每周分裂一次。两种细胞系均在Eagle的MEM中,在37℃、5%的二氧化碳中培养。所有组织培养基(爱荷华大学癌症中心,爱荷华市,IA)含有10%热灭活胎牛血清(HyClone, Logan, UT), 4 mMl-谷氨酰胺,庆大霉素80 μg/ml。
病毒
鼻病毒血清型9是从医学研究委员会普通感冒科获得的,其特性通过特异性抗血清(ATCC)中和得到证实(25).鼻病毒9型被用于描述的所有研究和大量在俄亥俄州的HeLa细胞中繁殖。一个完整的细胞病变效应的发展后,病毒收获,澄清,等分,并在-70℃冷冻。病毒滴度,确定为低于上解冻的冷冻贮存等分试样的小瓶中,为2×10描述6组织培养感染剂量50% (TCID50)4/毫升。对于所有实验,新的小瓶病毒在37℃下迅速解冻,并且立即在多种感染(MOI)中使用,除非在何处。
病毒滴定
鼻病毒效价在96孔微量滴定板测定俄亥俄州的HeLa细胞单层来确定;125微升5%MEM加入到每个孔中,然后用100微升的HeLa细胞在5%MEM以3×105/毫升。培养皿在5% CO中培养2在37°C。汇合后(24-48 h),每孔加样品25 μl或其10倍稀释倍数(8个重复),培养5 d。细胞病理效应(CPE)是通过视觉评估和评估单层后固定在甲醇和0.1%结晶紫染色。TCID50如前所述计算值(25).
IL-8蛋白的测量
A549细胞在2×10℃培养6/ ml在12孔板中2ml培养基。24小时(当80%汇合)后,加入1或对照培养基的MOI的病毒,继续孵育6,24,48,72,96和120h。使用10倍稀释的病毒库存进行剂量 - 反应研究,并在24小时收获。在24和120h中研究了UV-和可溶性ICAM-1(SICAM) - 术病毒的影响。收获上清液并在-70℃下储存在等分试样中。通过特定ELISA(R&D,Minneapolis,Mn)测量IL-8蛋白。测定的敏感性为4.7pg / ml。
Northern分析IL-8 mRNA的测定
A549细胞在100 mm板中培养18 h,然后加入病毒,MOI为1。在1、3、6、24、48和96 h收获细胞。在24 h之前的时间点重复3到5次,在48和96 h点重复2次。根据制造商的说明,使用RNAstat (Tel-Test B, Friendswood, TX)提取全细胞RNA。RNA在25 ~ 50 μl水中重悬,在260 nm处吸光度定量。
在含有2.2m甲醛的1.5%变性的琼脂糖凝胶上分离RNA(每条泳道10μg)。26).大肠杆菌23s和16s核糖体RNA以M.W.标记。通过溴化乙锭染色的28s和18s核糖体RNA确认等于RNA负载。
IL-8 cDNA探针与部分IL-8 mRNA 5 '非编码区互补生态pGEM3Z的RI摘要,由Joost J. Oppenheim(国家癌症研究所,Frederick, MD)提供。探针(100 ng)用BRL (Gaithersburg, MD)随机引物DNA标记系统标记,10 μl [α-32P]CTP (DuPont-New England Nuclear, Boston, MA),遵循制造商的说明。使用Sephadex G-50色谱柱去除未结合的核苷酸。按照制造商的建议,将RNA转移到GeneScreen Plus (New England Nuclear, Boston, MA),然后紫外交联到尼龙膜上。在50%甲酰胺、1 M NaCl、10%葡聚糖、1% SDS、0.05 M Tris和1× Denhardt’s溶液中预杂交6 h。在含有100 μg/ml鲑鱼精子DNA (Sigma, St. Louis, MO)的新鲜溶液中,在42℃下与[α-32P]标记探针。杂交膜在室温下1× SCC中洗涤2次5分钟,在65°C下1× SCC/0.1% SDS中洗涤2次30分钟,在室温下0.1× SCC中洗涤1次15分钟。在−70°C下进行x射线自显像(XAR Kodak胶片,Sigma)。
鼻病毒失活
在1200 μJ/cm的紫外线照射下可实现病毒的灭活2紫外线灯30分钟。使用上述方法对灭活的确认通过微量滴定板测定进行。
通过测定新病毒蛋白的合成,研究了病毒的灭活[35蛋氨酸掺入和免疫沉淀如下。将活病毒和紫外线灭活病毒接种于107俄亥俄海拉细胞的MOI为1。吸附30分钟后,加入10 ml 10% MEM,在5% CO中孵育细胞2在37°C。孵育6 h后,用无蛋氨酸培养基(Sigma)替代培养基。三十分钟后,[35S]蛋氨酸(杜邦-新英格兰核)加至50 μCi/ml。继续孵育2 h,置冰。洗涤三次后,收集细胞微球,悬浮在1ml裂解缓冲液(1% Triton X-100 PBS)中。裂解液在−70°C下存储在250 μl等量中用于免疫沉淀。对250 μl裂解液进行免疫沉淀,将裂解液解冻,再加入750 μl裂解缓冲液。溶菌产物被用在4°C和孵化10分钟。减少非特异性结合,50μl葡萄球菌蛋白A /琼脂糖快流(σ)补充说,在4°C和溶菌产物激动1 h,蛋白A /琼脂糖颗粒状在12000 rpm microfuge 1分钟,和上层的移除。蛋白质/琼脂糖/多克隆Ab复杂(由添加5μl豚鼠多克隆anti-rhinovirus类型9 Ab(写明ATCC)葡萄球菌蛋白A-Sepharose 100μl,在室温下搅拌2小时)然后添加到上层清液,搅拌是一夜之间继续在4°C。过夜孵育后,在PBS中洗涤3次,加入50 μl样品缓冲液(24%甘油、5% SDS、12% β-ME、0.001 M溴苯酚蓝、1.5 M Tris-HCl pH 6.8)。95℃加热2 min,离心,去除葡萄球菌蛋白A/Sepharose颗粒。上清液上载10% SDS-PAGE凝胶,在30 mA下电泳。 Gels were fixed in 40% methanol, 10% acetic acid, and 3% glycerol for 1 h, then in EnHance (DuPont-New England Nuclear) for 1 h, and washed for 30 min in water. The gel was dried, and autoradiography was performed.
鼻病毒灭活也被预涂病毒与可溶性受体占据的病毒衣壳所有的受体结合位点进行。病毒原液以1:1的浓度毫克/毫升用重组sICAM-1的(由P. Esmon,拜耳公司,伯克利,CA捐赠)预温育在室温下30分钟。使用上述方法对灭活的确认通过微量滴定板测定进行。
鼻病毒对A549细胞的感染性
鼻病毒滴定。
A549细胞在2×10℃培养6在12孔板上的2ml培养基中,80%汇合后,在MOI为1的条件下接种鼻病毒。室温孵育30min,使病毒附着后,细胞洗三次,加入新鲜培养基。上清分别在6、24、48和72 h收获,并在−70℃保存。鼻病毒滴度测定采用微滴平板法,如前所述(25),包括鼻病毒9型中和抗血清(ATCC),以确认产生的病毒颗粒为鼻病毒9型。观察培养物,用结晶紫染色检测病毒诱导的CPE。
RT-PCR的鼻病毒基因组和复制链RNA分析。
A549细胞在2×10℃培养6/ ml的在2毫升在12孔平板中,并且当80%汇合,用鼻病毒以1的MOI在室温下接种孵育30分钟后,以允许病毒附着,细胞洗涤三次,和新鲜的加入培养基。然后上清液立即收获,并在6,24,48,72,96,和120小时,并储存在-70℃。总RNA从上清液使用Tryzol(Life Technologies)中,根据制造商的说明50-μL等分试样萃取。鼻病毒的基因组(正)和复制(负)链RNA如先前所述,使用RT-PCR和内部探针杂交进行检测(27).对于基因组链RT-PCR, RT步骤使用引物OL27, PCR方法如前所述(27),但探针杂交是根据制造商说明使用Amersham ECL试剂盒(Amersham, Aylesbury, U.K.)的非同位素标记进行的。复制链RT- pcr的方法相同,但RT步骤使用的引物为OL26 (27).
细胞内鼻病毒原位杂交复制分析.
将A549细胞置于100 mm板中培养,当融合度达到80%时,接种鼻病毒,MOI为1。室温孵育30min,使病毒附着后,细胞洗三次,加入新鲜培养基。然后在第6和24小时轻柔刮取细胞。细胞在PBS中洗涤,并在4°C中性缓冲福尔马林(NBF)中固定1小时。然后用PBS洗涤细胞三次,并在0.2 ml人血浆凝块中重悬(4).细胞凝块在NBF中固定24小时,石蜡块包埋。5微米切片与4种保守的鼻病毒特异性探针(28). 使用的探针序列为:PB4、CAG GGG CCG GAG GAC TCA AGA TGA GCA CAC GCG GCT;PB5,TGC AGG CAG CCA CGC AGG CTA GAA CTC CGT CGC CG;PB6,ACA CGG ACA CCC AAA GTT GGT CCC ATC CCG CAA;和PB7,ACA TCC TTA ACT GGG TCT GTG AAT TTA CTG GGG TCT。
鼻病毒新的蛋白质合成。
鼻病毒新病毒蛋白在A549细胞中的合成被[35如上所述,蛋氨酸掺入和免疫沉淀。活病毒接种到107MOI的A549细胞1,并与[35S]甲硫氨酸甲硫氨酸的培养基进行2小时和24小时进行。
鼻病毒感染A549细胞的活力
A549细胞在100 mm培养皿中培养,当80%汇合液以1的MOI接种鼻病毒时。在室温下培养30分钟以允许病毒附着后,将细胞洗涤三次,并添加新鲜培养基。然后在不同时间点将培养基从感染细胞和对照非感染细胞中移除。对上清液中分离的细胞进行计数,对平板上附着的细胞进行胰蛋白酶消化,然后进行计数,并测定台盼蓝排斥反应以评估活性。为了获得活性,在台盼蓝培养5分钟后计数300个细胞,并得出活细胞与死细胞的比率。
统计分析
数据表示平均值±SEM。使用双向重复措施的方差分析进行时间课程研究中的重要性测试,然后进行学生配对t在每个时间点测试。使用学生配对进行其他比较t测试。p≤0.05被认为是显著。
结果
IL-8在鼻病毒反应中的释放
为了确定A549细胞对鼻病毒的反应是否以剂量反应的方式释放IL-8蛋白,将A549肺上皮细胞在12孔组织培养板中培养至80%汇合,并与10倍稀释的鼻病毒9型培养24小时。然后收集上清液并分析IL-8。如图1所示⇓一个,肺上皮细胞系在应对鼻病毒时以剂量依赖的方式释放IL-8。MOI为1时IL-8释放量最大;没有在较高的MOIs进行研究,以确定这是否是最大的。所有额外的实验都是在这个剂量的病毒下进行的。
然后我们研究了来自A549细胞的IL-8释放的时间过程响应于鼻病毒。A549肺上皮细胞培养至80%汇合在12孔组织培养板中,并用鼻病毒类型9.上清液然后在不同时间点收集并测定IL-8孵育。有IL-8的响应于鼻病毒的时间依赖性释放。如图1⇑B, IL-8释放量在6 h时已高于控制值,并持续增加至120 h。培养未持续超过120 h。
IL-8 mRNA在鼻病毒应答中的诱导作用
为了确定鼻病毒诱导IL-8蛋白释放是否伴随着IL-8 mRNA表达的增加,我们使用Northern分析研究了鼻病毒诱导IL-8 mRNA的表达。A549上皮细胞置于100mm组织培养板上培养。加入鼻病毒9型,在1、3、6、24、48、96 h收获RNA。采用Northern blot检测IL-8 mRNA的存在。IL-8 mRNA在鼻病毒9型应答中诱导至24 h的时间过程如图2所示⇓.注意到对鼻病毒型9的一致响应,在1小时的mRNA中可检测到的mRNA和3至24小时。诱导IL-8 mRNA表达响应鼻病毒仍然存在于48小时,尽管与早期时间点相比减少。在96小时内未检测到诱导(数据未显示)。
失活的鼻病毒
随着鼻病毒复制循环被认为是6至8小时(29),我们希望研究观察到的IL-8蛋白的诱导是对病毒复制的反应还是对触发细胞内信号传导途径的病毒受体结合。为了研究这一点,我们使用了两种鼻病毒的灭活方法:UV失活,以消除鼻病毒复制并预先用溶解受体(SICAM-1)进行病毒,以防止病毒受体结合(30).
如上所述,在微量滴定板滴定测定中进行UV和SICAM灭活的UV和SICAM失活。在滴定测定中,鼻病毒9型的滴度为2×106TCID50/ml,而两种方法灭活的病毒的ml均为零,即使未稀释的灭活病毒储备也未观察到CPE。
通过免疫沉淀,还证实了UV光的病毒蛋白合成的灭活35在俄亥俄州海拉细胞中产生的s标记的新合成病毒蛋白。未经处理的鼻病毒9型在病毒接种后6至8小时内显示出新的病毒蛋白合成活性(图3)⇓,巷2),而紫外线灭活的9型鼻病毒完全没有新的病毒蛋白合成(图3)⇓,巷3).
IL-8释放和mRNA诱导响应于失活鼻病毒9型
为了探讨通过UV光的抑制病毒复制是否改变了IL-8蛋白释放和mRNA表达的鼻病毒诱导,将A549上皮细胞与UV灭活和活鼻病毒9型和单独的培养基一起孵育。在24和120小时收集上清液,用ELISA法分析IL-8的释放情况。在24小时收获RNA,并通过北方分析分析。
IL-8蛋白质释放和mRNA诱导如图4所示⇓和5。uv灭活鼻病毒9型和对照培养基导致IL-8蛋白释放量在两个时间点均显著低于活病毒。然而,与单独使用培养基相比,紫外线灭活病毒确实导致IL-8释放增加,IL-8水平约为9型活鼻病毒的一半(图4)⇓).
与活病毒相比,紫外灭活病毒在24小时诱导的IL-8 mRNA也更少,单独培养基诱导的mRNA也更少(图5)⇓). 同样,紫外线灭活病毒产生的信号约为活病毒的一半。
这些结果表明,IL-8的释放和mRNA的产生可能与病毒复制无关,可能是病毒受体相互作用的结果,或者是接种物中病毒以外的因素刺激上皮细胞的结果。为了研究这些可能性,将A549细胞与灭活的sicam和活的9型鼻病毒和单独的培养基一起孵育。在24和120小时收集上清液,用ELISA法分析IL-8的释放情况。与对照培养基相比,sicam灭活的鼻病毒没有显著诱导IL-8的释放(图6)⇓),而如前所观察到的活鼻病毒导致显著增加IL-8释放。
rhinovirus感染A549细胞
上述结果表明,IL-8蛋白和mRNA的至少部分诱导可能是由A549细胞中的鼻病毒复制产生的。然而,鼻病毒在低呼吸上皮中复制的能力是有争议的。为了探讨鼻病毒型9在肺上皮细胞系A549中复制的能力,我们进行了研究以研究新的病毒蛋白质生产,病毒RNA释放到细胞上清液,病毒RNA细胞内定位,以及功能性病毒复制单元的释放上清液。
新鼻病毒蛋白的生产
用免疫沉淀法研究了鼻病毒接种到A549细胞后新合成的病毒蛋白的生产35s标记的新合成病毒蛋白。俄亥俄海拉细胞孵育9型鼻病毒后的免疫沉淀35S-标记蛋氨酸2小时(感染后6-8小时;图3⇑,巷2)产生了一些新合成的病毒蛋白的强条带。与俄亥俄HeLa细胞孵育24小时(感染后6-30小时)也观察到类似的新蛋白合成(31).相反,当在完全相同的条件下与A549细胞一起孵育鼻病毒9型,在2-H之后没有可检测的新病毒蛋白合成(图7⇓,巷2)或24小时(图7⇓,巷3孵化项目。我们得出的结论是,在上述条件下,免疫沉淀不足以检测新的病毒蛋白,因此我们通过Western分析研究了病毒蛋白的生产。当将9型鼻病毒接种到Ohio HeLa细胞上24 h时,很容易检测到鼻病毒蛋白合成增加,但在同一时期内,将9型鼻病毒接种到A549细胞上时,没有观察到病毒蛋白的增加(数据未显示)。
鼻病毒RNA的产生
免疫沉淀反应和西方分析的蛋白质检测技术无法检测鼻病毒复制在A549细胞,我们选择使用更敏感的方法和研究鼻病毒RNA的上层清液的释放与rt - pcr检测A549细胞基因组和鼻病毒RNA复制链。
用鼻病毒接种A549细胞;在附着后,将细胞洗涤三次并加入新鲜培养基。在各个时间点收获上清液,进行基因组和复制链RT-PCR。在洗涤后加入新鲜培养基后,没有检测到的复制(-VE)链RNA(时间为零。8⇓);在接种后6 h,复制链RNA显著增加,然后逐渐下降,直到96 h,之后没有检测到复制链RNA。基因组(+ve)链的结果相似;然而,在0时刻有微弱信号存在,推测来自接种的病毒,在6 h病毒RNA再次显著增加,然后逐渐下降到120 h,只有微弱信号仍然可以检测到(图8)⇓).
原位杂交法检测细胞内鼻病毒复制
为了确保所观察到的增加的病毒RNA从A549细胞上清液没有任一病毒吸附到细胞表面,然后通过病毒未涂覆RNA的释放细胞的洗涤后或低效洗涤导致从病毒RNA的持续性的结果不活跃的细胞内复制的接种,我们调查采用原位杂交细胞内复制的鼻病毒。
将A549细胞培养,并用鼻病毒接种。然后将细胞在0,6,和24小时收获;重新悬浮在血浆凝块;固定的;并包埋在石蜡块中。切片然后通过原位杂交检查的基因组(阳离子)鼻病毒RNA的链。如图9⇓在未感染的对照细胞或接种和洗涤后立即收获的细胞中,没有检测到信号。在接种后6和24小时,细胞内鼻病毒RNA表达明显增加,表明细胞内正在产生新的病毒基因组RNA。
生产功能性鼻病毒复制单位
最后,我们研究了A549细胞组装功能性病毒复制单位的能力并将其释放到细胞上清液中。将鼻病毒9型接种到A549细胞上并吸附30分钟。在洗涤删除未附加的病毒后,加入新鲜培养基。在6,24,48,72,96和120小时收获上清液。通过如上所述的细胞上清液的微量滴定板滴定测定评估功能性病毒复制单元的产生。通过用鼻病毒9型特异性抗血管(ATCC)中和通过中和证实了传染性单位。在接种后,在6小时内,在细胞上的上清液中没有检测到感染病毒。接种后24小时在24小时内在A549细胞上清液中观察到峰值滴度(图10⇓); 在病毒接种后48小时,在上清液中仅检测到病毒复制,但此后未检测到。
鼻病毒感染A549细胞的活力
为了确定鼻病毒在A549细胞中的复制是否具有细胞毒性或细胞病理学作用,我们用鼻病毒感染A549细胞,观察CPE的发生。病毒接种后120 h观察A549细胞培养,未检测到任何与鼻病毒相关的CPE。单分子层也用结晶紫染色,在任何时间点均未见细胞层破裂。
此外,通过台盼蓝排除检查病毒感染对细胞活力的影响。将鼻病毒9型接种到A549细胞上并吸附30分钟。在洗涤删除未附加的病毒后,加入新鲜培养基。在24,48,72,96和120h处从感染和控制无感染细胞收获上清液和附着细胞。上清液中的分离的细胞是100%台盼蓝阳性,计数数量以评估单层的非活细胞的脱落。在没有时间点,受感染和无染色的上清液之间有任何区别(表I⇓).将贴附在平板上的细胞胰酶化并计数,并确定台盼蓝排除以评估其生存能力。在任何时间点上,被感染的附着细胞和未被感染的附着细胞之间的细胞活力没有任何差异(表I)⇓).
讨论
这些研究表明,鼻病毒9型可以感染转化的肺上皮细胞系A549,但感染是非细胞病变的、低级别的,并且在病毒接种24小时后出现自发流产。他们进一步表明,鼻病毒9型诱导肺上皮细胞系释放IL-8蛋白的时间和剂量依赖性延长。IL-8的释放与IL-8 mRNA的诱导有关。IL-8蛋白的释放和mRNA的表达部分依赖于病毒的复制,当紫外线灭活抑制病毒复制时,IL-8蛋白的释放和mRNA的表达降低了约50%。然而,防止鼻病毒与受体结合完全抑制了鼻病毒诱导IL-8蛋白释放。
已有多篇报道表明,呼吸道合胞病毒感染后,上皮细胞系释放IL-6、IL-8、IL-11和GM-CSF (32,33,34,35). Choi和Jacoby发现暴露于流感病毒的人气管细胞中IL-8基因表达增加(36).鼻病毒在促进下呼吸道促炎反应的作用得到了较少的关注,直到近年来,随着鼻病毒直到然后认为主要限于上呼吸道感染和普通感冒。最近的数据在成年人和儿童中含有大多数哮喘恶化的数据(1,2,3.)激发了人们对这类病毒及其感染下呼吸道和引起气道炎症的能力的新的兴趣。在这方面,鼻病毒诱导A549肺上皮细胞系的细胞因子蛋白和mRNA最近被证实与IL-6 (10.)和IL-11(13.);然而,这些研究没有检查细胞因子释放与鼻病毒感染这种细胞系的能力之间的关系。
其他呼吸道病毒(腺病毒,流感病毒,呼吸道胞外病毒,Parainfluenza病毒和CMV)可以感染下呼吸道。然而,证据表明,这种情况发生在鼻病毒并不决定。在体内研究中为这一假设提供了一些支持,在鼻病毒的小粒子气溶胶中已被证明产生气管咽喉炎(37). 喘息性支气管炎患儿痰培养的鼻病毒阳性率高于同时采集的鼻拭子(38).在实验性感染研究中,鼻病毒已从支气管灌洗液中培养(39),最近通过RT-PCR在支气管灌洗回收的细胞中证实了鼻病毒(16.).然而,在这两个研究从上呼吸道污染的鼻介绍支气管镜中的可能性不能排除。最后,鼻病毒与多种严重的下呼吸道疾病,如细支气管炎和肺炎(相关联的40,41,42),并已在少数个案报告的下呼吸道死后标本中分离(15.).
还有一些体外证据表明鼻病毒能够在下呼吸道上皮中复制。Subauste等人研究了转化的支气管上皮细胞系BEAS-2B,并在细胞颗粒的上清液和裂解液中使用病毒滴定法,对从细胞颗粒中提取的RNA进行RT-PCR,以证明鼻病毒基因组(+ve)链在病毒接种后的前24小时内增加,病毒滴度在感染后72小时内增加(23).有趣的是,BEAS 2B细胞的感染是非细胞溶解性的,对细胞活力没有影响。
在这项研究中,我们已经证明鼻病毒9型也能够启动转化肺上皮细胞系A549的生产性感染。这一点可以通过发现复制基因的释放来证明(−ve)将RNA串入A549细胞上清液,通过原位杂交证明细胞内复制,并将功能性病毒复制单位释放到上清液中。然而,感染级别较低,在微量滴度平板试验中,仅在纯上清液中检测到病毒,并且在伤害后24小时观察到的最大滴度为64 TCID50/毫升(图10所示⇑).类似于BEAS 2B细胞(23),在任何时间点都观察到A549细胞上的CPE;对细胞的活力也没有影响(表I⇑).然而,相比之下比阿斯2 b细胞,病毒复制的出现继续到最后时间点检查(72 h),感染A549细胞自发终止24小时左右。尽管如此,引发蛋白质释放指出增加了120 h后病毒接种(图1所示⇑B),而IL-8 mRNA的表达更接近于感染模式,在3至24小时早期达到峰值(图2)⇑),并在96小时后恢复到控制水平(数据未显示)。IL-8的延长释放可能是细胞功能改变的结果,导致IL-8蛋白释放持续一段时间,甚至在感染本身消失后。
紫外灭活病毒和活病毒均能触发IL-8蛋白的释放和mRNA的表达(尽管紫外灭活病毒的诱导率约为活病毒的50%;无花果。4⇑和5⇑)提示鼻病毒与其细胞表面受体ICAM-1结合可能是IL-8蛋白和mRNA增加的部分原因。另一种解释是,病毒库中含有其他活性化合物,如其他细胞因子。然而,对于可能的候选者,包括IL-1和TNF,对<5 pg敏感的检测结果为阴性(数据未显示)。此外,通过用sICAM预涂病毒来阻止病毒受体结合,从而完全抑制IL-8蛋白释放的诱导,这一事实表明,接种物本身不包含在这些条件下能够诱导IL-8蛋白释放或mRNA表达的其他刺激物质。鼻病毒引起ICAM-1交联的可能性可能是因为每个病毒颗粒都有60个受体结合位点(43).此外,已经证明了ICAM-1的交联通过AB导致细胞内信号(44)和细胞因子释放(45).因此,我们认为病毒与受体的相互作用是uv灭活病毒诱导IL-8 mRNA和蛋白释放的最可能的解释。而uv灭活病毒与活病毒在IL-8蛋白释放和mRNA诱导上的差异可能与病毒在肺上皮细胞系内复制有关。
鼻病毒诱导的肺上皮细胞系IL-8蛋白释放和mRNA表达的观察结果可能与人类鼻病毒感染有关,因为我们发现野生型上呼吸道病毒感染期间鼻吸出物中IL-8水平升高,其中大部分是鼻病毒引起的(14.).我们研究了学龄儿童在病毒诱发哮喘加重期间获得的鼻腔分泌物,发现鼻病毒感染时中性粒细胞髓过氧化物酶和IL-8水平升高。有趣的是,IL-8水平与中性粒细胞髓过氧化物酶水平之间以及髓过氧化物酶水平与上呼吸道症状的严重程度之间存在相关性,提示IL-8可能在鼻病毒感染中中性粒细胞的趋化和激活中发挥重要作用(14.).这些观察结果得到了哮喘受试者的实验性鼻病毒感染研究,在鼻病毒感染后观察到鼻IL-8水平增加(12.).这项研究也特别有趣,因为研究人员发现鼻腔IL-8水平与鼻病毒感染诱导的支气管超反应性增加之间的相关性,再次表明IL-8可能在鼻病毒诱导的哮喘加重的发病机制中发挥重要作用。本研究和Subauste等人报道的研究结果(23)表明,从下呼吸道上皮的鼻病毒诱导的IL-8释放可能是该趋化因子的重要来源。
嗜酸性粒细胞浸润是哮喘的一个重要特征(18.)),并且越来越多的证据表明嗜酸性粒细胞招生和激活在病毒诱导的哮喘加剧中也重要。我们发现从鼻病毒诱导的哮喘加剧儿童服用的鼻腔吸气中的嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白水平增加(L.M.Teran,M.C.Seminario,G.J.Gleich和S. Johnston,未发表意见)。Calhoun等人。在鼻病毒实验感染的存在下,展示了特征性鼻窦炎受试者中的过敏原诱导的支气管灌洗嗜酸性嗜酸性橄榄球菌数(19.).我们还研究了低气道细胞对鼻病毒感染的反应,使用实验诱导的鼻病毒感染在正常和哮喘受试者。在鼻病毒感染4天后,正常和哮喘受试者支气管粘膜嗜酸性粒细胞数量增加。然而,在哮喘受试者中,当受试者在6至8周后再次活检时,嗜酸性粒细胞浸润仍然存在,而在正常受试者中,嗜酸性粒细胞数量恢复到基线水平(17.).鉴于IL-8在嗜酸性粒细胞招聘和激活中的可能作用(21,22)事实上,它在这方面的作用可能在哮喘中上调(46),这一趋化因子可能在鼻病毒诱导的哮喘加重中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的招募和激活中发挥重要作用。
在实验鼻病毒感染研究正常和哮喘患者的一个突出特点是CD3数量的增加+,CD4+,及CD8+鼻病毒感染后4天支气管粘膜淋巴细胞(17.).IL-8也是一种淋巴细胞趋化剂(47);因此有可能从肺上皮鼻病毒诱导的IL-8分泌起着参与病毒诱导的哮喘的发病数种细胞类型的募集和活化的作用。然而,这种趋化因子在病毒诱发哮喘发作的作用进一步定义将使得在正常和哮喘患者IL-8水平和临床疾病的严重程度之间病毒感染的相互关系的评估来自临床研究(48).
脚注
- 已收到1997年11月13日。
- 接受1998年2月17日。
- 版权所有©1998由美国免疫学家协会