要点gydF4y2Ba
MSC电动车可能刺激增加抗菌活性在细菌性肺炎。gydF4y2Ba
增加抗菌活性与LTB增加有关gydF4y2Ba4gydF4y2Ba生产。gydF4y2Ba
MSC电动汽车可能会增加LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba通过转移生产miR145靶细胞。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
人类间充质干细胞(MSC)细胞外囊泡(EV)可以减少细菌性肺炎的严重程度,但对其抗菌活性机制。在当前的研究中,我们发现细菌引起的间隙MSC EVgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaC57BL / 6小鼠肺炎与高水平的白三烯(LT) BgydF4y2Ba4gydF4y2Ba在受伤的肺泡。更重要的是,废除了MSC EV的抗菌效果cotreatment LTBgydF4y2Ba4gydF4y2BaBLT1拮抗剂。确定MSC EV LT代谢的作用,我们测量了MSC电动车对一个已知的影响磷酸腺苷磁带,多resistance-associated蛋白1 (MRP1),并发现MSC EV抑制MRP1信使rna,蛋白质,泵功能LPS-stimulated Raw264.7细胞体外。LTB的合成gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba从英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba有竞争力,MRP1 LTC射流泵吗gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。抑制MRP1 LTB将会增加gydF4y2Ba4gydF4y2Ba生产。此外,政府的非特异性MRP1抑制剂(mk - 571) LTC减少gydF4y2Ba4gydF4y2Ba随后增加了LTBgydF4y2Ba4gydF4y2BaC57BL / 6小鼠水平与急性肺损伤,增加整体的抗菌活性。我们之前发现MSC EV的生物效应是通过转让其内容,如信使rna和蛋白质,微rna,靶细胞。在最近的研究中,mir - 145击倒废除MSC EV MRP1的抑制的作用在体外和体内抗菌作用。总之,MSC EV抑制MRP1活动通过mir - 145转让,从而导致增强的LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba通过LTB生产和抗菌活性gydF4y2Ba4gydF4y2Ba/ BLT1信号。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
白细胞三烯(LTs)是一个家庭的脂质介质与急性和慢性炎性疾病相关。他们在宿主防御行动,细胞间通讯和信号转导。LTs包括LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba和半胱氨酰LTs (CysLTs (LTC)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba有限公司gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,LTEgydF4y2Ba4gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。CysLTs inflammatory-related疾病的发病机制中发挥重要作用。在哮喘,他们调解支气管狭窄,支气管多动症,水肿,嗜酸性粒细胞(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba最初被确定为活化剂的粒细胞(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和已知起到广泛的促炎作用(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。多项研究已经证明了LTB的抗菌效果gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,这可能是介导通过增强吞噬作用和抗菌药物的释放(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba可以增强宿主防御肺炎和败血症(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。LTs主要发生在白细胞的生物合成。在回应刺激(免疫和炎症信号),花生四烯酸(AA)从膜磷脂中解放出来,通过磷脂酶催化的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(中国人民解放军gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然后转换成LTA AAgydF4y2Ba4gydF4y2Ba通过5-lipoxygenase的作用。从英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba有两个竞争导致LTB的合成代谢途径gydF4y2Ba4gydF4y2Ba或LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba通过酶LTAgydF4y2Ba4gydF4y2Ba水解酶(LTAgydF4y2Ba4gydF4y2BaH)或LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba合酶(LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba,分别。LTCgydF4y2Ba4gydF4y2BaMRP1跨质膜运输,也叫ABCC1,随后转化成有限公司吗gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和LTEgydF4y2Ba4gydF4y2Ba在细胞外空间。gydF4y2Ba
MRP1属于磷酸腺苷盒式运输机总科和多药耐药性蛋白1(凋亡),也种代号为ABCB1的命名或22。MRP1是∼190 kda膜蛋白和功能作为运输车。LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba是一个特别的高亲和性MRP1的衬底(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),和LTC MRP1是主要的射流泵gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。在LT-mediated炎症,MRP1在LTC中起着至关重要的作用gydF4y2Ba4gydF4y2Ba版本(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。令人惊讶的是,老鼠缺乏gydF4y2BaMrp1gydF4y2Ba更耐药细菌性肺炎与野生型小鼠相比gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。由于缺乏gydF4y2BaMrp1gydF4y2BaLTC的表达式,流出gydF4y2Ba4gydF4y2Ba受损和胞内LTC吗gydF4y2Ba4gydF4y2Ba积累(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。LTC积累gydF4y2Ba4gydF4y2Ba会使LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba从而增加本公司的可用性gydF4y2Ba4gydF4y2Ba为本公司gydF4y2Ba4gydF4y2Bah .英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba因此变得更可用LTB转换gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,导致增强的LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba版本(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。此外,英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2BaH,也可以释放到细胞外空间,具有显著的氨肽酶活性对matrikine proline-glycine-proline (PGP) (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。PGP是产生的细胞外基质(ECM)胶原蛋白,通过酶如基质金属蛋白酶9 (MMP),其次是prolyl乳沟的肽链内切酶(PE) (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。PGP的英国网球协会的退化gydF4y2Ba4gydF4y2BaH帮助促进炎症的决议(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。英国网球协会的细胞外作用gydF4y2Ba4gydF4y2BaH在抑制炎症PGP退化一直在报道各种肺部疾病(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
人类MSC细胞外囊泡(EV)一直在研究各种急性肺损伤模型作为一种减少炎症的治疗,因为他们的能力,减少肺通透性,减少细菌性肺炎(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。然而,抗菌活性的机制MSC电动汽车在很大程度上仍是个未知数。MSC-derived EV是小成的囊泡来自细胞内multivesicles或从初露头角的质膜。MSC和MSC EV含有大量蛋白质和RNA。RNA组件由MSC电动车主要是小RNA(< 100个基点),包括大鹏(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。大鹏调节基因的表达和功能不仅在细胞内转录但可以被转移到目标细胞介导基因表达和调节细胞功能(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。mir - 145被发现在MSC细胞(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),MSC条件培养液(厘米)(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),MSC-derived液(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),它是十大最丰富的大鹏检测(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。最近发现mir - 145直接调节MRP1的表达在乳腺癌(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)和胆囊癌症(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在最近的研究中,我们假设mir - 145在MSC电动汽车可以减少MRP1表达在白细胞和随后提高LTB的生产gydF4y2Ba4gydF4y2Ba提高抗菌活性。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
间充质干细胞细胞外泡隔离和表征gydF4y2Ba
人类MSC是来自美国国立卫生研究院的存储库获得德州农工大学健康科学中心(寺庙,TX)。人类骨骨髓来源MSC从三个不同的捐赠者段落3 - 8被用于这项研究。这些人类MSC特征(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。他们对成骨的能力、脂肪形成的和chondrogenic谱系分化之前。流式细胞术结果显示细胞> 99%显示标准的MSC表面标记如CD105, CD90、CD73, CD44和存在。他们的表型和功能符合所有的标准定义的MSC国际社会的细胞疗法(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。正常成人肺成纤维细胞(NHLF)作为细胞控制(瑞士巴塞尔Lonza集团)。gydF4y2Ba
电动汽车得到的上层清液MSC和NHLF使用超速离心法如前所述(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。短暂,MSC或NHLF直到支流然后血清饥饿培养48 h在CM没有新鲜的边后卫但含有0.5% BSA (MP生物医学,LLC,梭伦,哦)。隔离EV, MSC的厘米或NHLF在3000转离心20分钟去除细胞碎片,然后在100000×gydF4y2BaggydF4y2Ba(贝克曼库尔特,沥青,CA)沉积物的EV 1 h在4°C。电动汽车是在PBS洗,然后提交给第二个超速离心法resuspended之前根据最终的细胞计数后48 h血清饥饿每1×10(10μlgydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞)。gydF4y2Ba
MSC电动汽车的特点是形态、大小、蛋白质、RNA含量和表面受体。MSC电动车电子显微镜检查的形态和大小近似。粒度分布(均值和模态)和MSC EV重组在PBS的浓度分析纳米粒子跟踪分析NanoSight NS300(莫尔文乐器,莫尔文英国)。这种方法计算大小基于布朗运动的跟踪和粒子浓度的观测逐帧的基础上由高灵敏度sCMOS相机。数据分析与NTA2.3软件。MSC的内容总蛋白质和RNA的电动车被BCA量化蛋白质测定,免疫印迹和rt - pcr。描述表面分子,MSC EV和PKH26染色荧光标记(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)或FITC-conjugated CD44或CD9 (BD生物科学,圣何塞,CA)制造商的指示。FITC多发地同型的免疫球蛋白被用作控制。MSC电动车被贴上PKH26分离出电动车从蛋白质碎片。检测CD44或CD9 MSC EV, BD FACSAria融合特殊订单(SORP)细胞分选仪(BD生物科学)与100 nm喷嘴和ND过滤器1使用。 The threshold was set on the SSC 200. Collected data were analyzed by FACSDiva software (BD Biosciences). For fluorescence detection, we used a 586/15 band-pass filter for PKH26 and 525/50 band-pass filter for CD9, CD44, and their IgG controls. An unstained sample was used to detect autofluorescence and set the photomultiplier for all the considered channels. The instrument was rinsed with particle-free rinse solution before running samples and between each sample to eliminate the background. Standard silica beads (Apogee Mix for Flow Cytometer; Apogee Flow Systems, Hemel Hempstead, U.K.), with a similar refractive index of vesicles, were used as internal size standards and to determine the gate for analysis.
急性肺损伤的模型和评估gydF4y2Ba
C57BL / 6雄性老鼠(10 - 12周,∼25克;杰克逊实验室,巴尔港,我)被用于实验。机构的动物保健和使用委员会加州大学,旧金山,所有实验协议获得批准。老鼠第一与氯胺酮麻醉(90毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)(i.p)。gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2Baendotoxin-induced急性肺损伤。gydF4y2Ba
急性肺损伤是引起气管内的(IT)的非致命性的滴剂剂量的内毒素gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO111: B4 (Sigma-Aldrich) 4毫克/公斤;MSC(750000细胞/老鼠)同时得到治疗。PBS是作为承运人控制和NHLF细胞控制(750000细胞/鼠标)。在不同的实验中,mk - 571(开曼化工、安阿伯、MI), MRP1的非特异性抑制剂,是灌输(注射)在剂量的内毒素滴剂后15日35岁或者50毫克/公斤。老鼠牺牲在12、24、48 h。mk - 571是一个有限公司gydF4y2Ba4gydF4y2Ba拮抗剂和MRP1抑制剂(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎。gydF4y2Ba
急性肺损伤是它滴剂诱导的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaK1应变(1.5×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaCFU)。四小时后,MSC EV输液注射90μl MSC EV /鼠标(1×10gydF4y2Ba10gydF4y2Ba粒子)。NHLF电动车作为消极的控制。在不同的实验中,除了MSC EV治疗,LY293111(开曼化学),LTB的抑制剂gydF4y2Ba4gydF4y2Ba受体1,被灌输的剂量(i.p) 18毫克/公斤。在额外的实验中,Reversan (Sigma-Aldrich),特定的MRP1和凋亡抑制剂后被灌输(i.p)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba滴剂的剂量40毫克/公斤。老鼠牺牲在24或28 h。gydF4y2Ba
在实验的最后,支气管肺泡灌洗液(BALF)从肺部收集评估白细胞计数,细胞因子的水平,细菌负荷,蛋白质含量和组织学。白细胞总数和微分得到使用Hemavet HV950FS(科学,迈阿密湖泊、FL)。鼠标MIP-2,嗜中性粒细胞趋化因子(KC) TNF-αLTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba和铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba
4gydF4y2Ba/ DgydF4y2Ba4gydF4y2Ba/ EgydF4y2Ba4gydF4y2BaBiotrak酶免疫分析法系统(通用电气医疗集团生命科学,白金汉郡,英国)。组织学分析,从每组小鼠肺部固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡,切成5-μm部分,沾染了)。gydF4y2Bamir - 145模拟和antagomir实验gydF4y2Ba
27gydF4y2Ba)。简而言之,MSC EV孵化了Lipofectamine RNAiMAX-prepared mir - 145 antagomir或者antagomir消极的控制根据协议。的混合然后在37°C的环境中24小时后跟超速离心法粒转染MSC EV。剩余antagomir或antagomir控制与PBS被洗MSC EV。然后cocultured Antagomir-transfected MSC EV和Raw267.4细胞。Raw267.4细胞被播种在six-well盘子和处理有限合伙人(100 ng / ml)和90μl MSC EV (1×10gydF4y2Ba10gydF4y2Ba粒子),pretransfected mir - 145 antagomir或消极的控制。gydF4y2Ba
多药耐药性分析gydF4y2Ba
荧光多药耐药性分析工具包(Abcam,剑桥,英国)是用来确定MRP1的活动。小鼠Raw264.7细胞(Sigma-Aldrich)被播种到96 -平明确底部的黑墙微型板块和孵化24小时有或没有与LPS刺激(100 ng / ml)。细胞被对待MSC厘米,MSC厘米删除EV (CM上层清液),MSC EV(2.5剂量的5和10μl,相当于3、6和12×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba粒子的MSC EV), mk - 571: 1μl(0.001毫米)和2μl(0.002毫米),或MSC EV转染mir - 145 antagomir或其消极的控制。mir - 145受体激动剂实验,Raw267.4细胞使用mir - 145模拟或其消极的控制。总共有100μl MDR染料溶液的添加到每个在37°C和孵化2 h在黑暗中。细胞内的荧光强度,作为一个指示器的MDR coincubation后泵的活动,是衡量FLUOstar最适条件荧光板读者(BMG Labtech卡里,NC)的激发波长490 nm和发射波长525 nm)。gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2Ba细菌量化gydF4y2Ba
BALF中细菌生长gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎或上层清液的主要文化人类单核细胞的接触gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌有或没有MSC电动车被CFU计数量化。磅琼脂板上培养的样本(TEKnova,霍利斯特,CA)一夜之间在37°C。单独的殖民地(CFU)被计算在内。gydF4y2Ba
吞噬作用的GFP-labeledgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌通过Raw267.4细胞gydF4y2Ba
Raw267.4细胞被播种在six-well板和mir - 145处理模拟或其消极的控制和有限合伙人24 h。洗后,细胞与GFP-labeled孵化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(1×10gydF4y2Ba7gydF4y2BaCFU /好[25922绿色荧光蛋白;美式文化收藏])90分钟。洗后,细胞内的荧光强度是衡量FLUOstar最适条件荧光板读者裂解后的细胞。gydF4y2Ba
MRP1免疫印迹分析gydF4y2Ba
RNA隔离和rt - pcrgydF4y2Ba
总RNA分离MSC电动车使用RNeasy迷你包(试剂盒科学、日耳曼敦、MD)。隔离后,RNA样本处理DNase我在室温下60分钟。RNA的质量评估与NanoDrop nd - 1000紫外可见分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)根据制造商的指示。用于rt - pcr引物是人类Ang-1和KGF (SABiosciences试剂盒,瓦伦西亚,CA)。rt - pcr检测中进行了使用上标三世一步法rt - pcr协议描述的制造商(SABiosciences试剂盒)。cDNA放大,一个初始逆转录步骤(30分钟52°C)随后变性步骤(94°C 2分钟),然后由40周期的变性(20年代94°C),退火30年代(60°C),和扩展30年代(68°C),其次是5分钟伸长的72°C。gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba基因扩增是作为内部控制。放大DNA产品运行在1.4%琼脂糖凝胶,和乐队可视化使用溴化乙锭。gydF4y2Ba
定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba
的平均周期阈值(Ct)值两个技术复制用于计算与特定的基因表达分析。的平均Ct值内部控制GAPDH或U6数组是用来计算ΔCt值样本,这种组合的参考基因显示最低的SD组间。GAPDH或U6就用来计算ΔCt值为特定的基因表达分析。最初的数据分析都使用了2gydF4y2Ba−ΔΔgydF4y2BaCt方法。gydF4y2Ba
英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2BaH量化gydF4y2Ba
MSC EV和mir - 145转染antagomir或消极控制24 h。90μl (1×10gydF4y2Ba10gydF4y2Ba粒子)MSC EV当时cocultured Raw267.4细胞six-well板块与LPS刺激(100 ng / ml)。英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
数据提出了均值±SD或中位数和四分位范围(差)。Shapiro-Wilk正常测试和与Dallal-Wilkinson-Lillie Kolmogorov-Smirnov测试gydF4y2BapgydF4y2Ba值被用来确定值的高斯分布。比较两组之间用学生gydF4y2BatgydF4y2Ba测试参数(数据)或Mann-WhitneygydF4y2BaU -gydF4y2Ba测试(非参数数据)。对比以上两组用单向方差分析与Bonferroni调整(用于参数数据)或与邓恩克鲁斯卡尔-沃利斯检验校正(用于非参数数据)进行多重比较测试。一个gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有使用GraphPad Prism 6.0执行统计分析软件(GraphPad,圣地亚哥,CA)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
MSC EV的隔离和表征gydF4y2Ba
电动汽车被从人类骨骨髓来源的条件培养基分离MSC。人类MSC血清饥饿48 h。serum-starved MSC在电动汽车的可行性隔离(台盼蓝排斥)> 95%。条件培养基收集,MSC电动车使用超速离心法分离(如前所述)(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。扫描电镜显示,隔离技术产生均匀的球体颗粒的大小∼200海里(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。NanoSight从多个样本分析显示MSC EV平均尺寸是227±25 nm,和模式大小是146±22纳米浓度为1.2±0.2×10gydF4y2Ba11gydF4y2Ba粒子每毫升或1.2±0.2×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba每μl粒子(gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MSC电动汽车的总蛋白质和RNA含量分别为1.1±0.3μg (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和0.9±0.4 ng /μl EV (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5),分别为(gydF4y2Ba补充图1 cgydF4y2Ba),它会变成一个范围在先前的研究中发现的浓度(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。通过rt - pcr, MSC EV mRNA表达检验1和角质细胞生长因子,由MSC分泌的可溶性因子,已知参与MSC在急性肺损伤的治疗效果(gydF4y2Ba补充图1 dgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。基于先前的剂量反应实验(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),90μl MSC EV /老鼠(1×10gydF4y2Ba10gydF4y2Ba粒子)在体内实验中使用的最佳剂量。gydF4y2Ba
液CD9是一种已知的标记,CD44是一个关键的质膜受体参与贩卖MSC (gydF4y2Ba40gydF4y2Ba);我们之前证明MSC EV CD44表达与免疫印迹分析(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。流式细胞术,我们标记MSC EV PKH26量化只有包围的囊泡和排除蛋白碎片。流式细胞仪分析显示> 73%(74±8)的MSC EV表达CD44、和< 0.3%(0.3±0.4)表示CD9 (gydF4y2Ba补充图1 egydF4y2Ba),这表明大部分电动汽车微泡。此外,类似于父母MSC, MSC EV表达CD44表面,有助于将MSC电动汽车纳入目标细胞在先前的研究(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MSC EV MRP1 LPS刺激人类单核细胞中的蛋白质含量的下降gydF4y2Ba
确定MSC EV抑制MRP1表达式和活动,我们培养的正常成年人血液单核细胞刺激与有限合伙人或没有MSC EV。免疫印迹分析表明190 kda带对应于MRP1蛋白质使用马伯特定MRP1(22)没有交叉反应(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。控制相比,MSC EV抑制MRP1人类单核细胞,蛋白质含量与吞噬作用的增加有关gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MRP1功能试验gydF4y2Ba
以确定MSC EV抑制MRP1泵功能,使用荧光MDR分析工具包。PGP(凋亡)和MRP1 ABC转运蛋白家族成员;他们是细胞膜蛋白质和函数作为ATP-dependent药物外排泵。这个MDR化验的工具包使用荧光染料MDR指标来分析这两个泵的活动。疏水性荧光染料迅速穿透细胞膜,成为被困在细胞。在凋亡和/或MRP1-expressing细胞,这种染料是由耐多药转运蛋白挤压,从而减少细胞的荧光强度。然而,当凋亡和/或MRP1泵活动被抑制,其细胞内染料不能抽出,从而增加细胞内荧光强度。一只老鼠巨噬细胞细胞系Raw267.4,高度表达MRP1和LPS刺激后,本试验中使用。我们培养Raw267.4与LPS刺激有或没有MSC厘米或MSC EV。类似于MRP1蛋白表达、管理MSC厘米下调MRP1泵活动Raw267.4细胞就是明证增加细胞内荧光强度与PBS (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。MSC厘米包含电动汽车有较强影响抑制MRP1泵活动与CM删除EV(名为CM上层清液)超速离心法但含有可溶性因素(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。MSC电动车也抑制MRP1活动剂量依赖性的方式(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)在剂量为2.5、5、10μl(相当于3、6和12×10gydF4y2Ba8gydF4y2BaMSC EV)的粒子。然后我们MSC EV mk - 571相比,非特异性MRP1抑制剂,MDR泵试验。MSC EV(5μl,等于6×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba粒子)也有类似的影响抑制MDR泵活动mk - 571(2μl,等于0.002毫米)(gydF4y2Ba图2 fgydF4y2Ba)。我们还研究了miR - 145的作用,转染的EV miR - 145 antagomir (miR抑制剂合成降解miR - 145)。类似于电动汽车gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 fgydF4y2BaEV转染与米尔-控制显示,荧光强度增加(gydF4y2Ba图2 ggydF4y2Ba)。然而,与mir - 145 EV转染antagomir废除了这一效应。相比之下,Raw264.7细胞转染mir - 145模拟(合成mir - 145)显示增加荧光强度相对消极的控制(gydF4y2Ba图2 hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MSC或MSC EV治疗LTB增加gydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平BALF的小鼠急性肺损伤gydF4y2Ba
我们测量LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平与急性肺损伤从有限合伙人或老鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌。基线水平的LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba在BALF很低但与LPS刺激或增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌(数据未显示)。MSC或MSC EV治疗后急性肺损伤导致LTB显著升高gydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平相比,BALF PBS治疗(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。LTB水平gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在MSC或MSC EV治疗组明显高于与NHLF或NHLF EV组相比,这是作为细胞控制。LTBgydF4y2Ba4gydF4y2BaMSC治疗后血浆水平增加(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。我们还测量了CysLTs (LTCgydF4y2Ba4gydF4y2BaDgydF4y2Ba4gydF4y2BaEgydF4y2Ba4gydF4y2BaBALF)水平与急性肺损伤从有限合伙人或老鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌。没有明显差异CysLTs水平在所有的群体。gydF4y2Ba
铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba比在急性肺损伤小鼠与MSC或MSC EVgydF4y2Ba
类似于LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba、基线水平的铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在BALF很低但与LPS刺激或增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌。不像LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba铂族元素的水平gydF4y2Ba2gydF4y2Ba脂质介质,由MSC分泌,消炎知道持平后BALF MSC或MSC EV治疗相比,接受pbs老鼠与有限合伙人或受伤gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(数据未显示),这是符合我们之前的研究(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。然而,铂族元素的比值gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(毫微克每毫升)/ LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(每毫升沙克)与MSC治疗或减少MSC EV (gydF4y2Ba补充图2 a、2 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MRP1抑制剂减少肺损伤gydF4y2Ba
mk - 571,一种常用的非特异性MRP1抑制剂,在LPS-induced管理急性肺损伤小鼠肺损伤期间证实MRP1活动的重要性。与接受pbs相比,LPS-injured老鼠,mk - 571管理显著降低白细胞和中性粒细胞计数(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)和促炎细胞因子(TNF-αMIP-2, KC)水平(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba),并演示了BALF中蛋白质含量下降的趋势(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。这些结果表明,MRP1抑制mk - 571有明显的抗炎作用。gydF4y2Ba
LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平BALF中发现几乎所有组在12 h,而高水平的LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba观察只有在mk - 571治疗小鼠与接受pbs相比,LPS-injured小鼠在24小时(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。相比之下,CysLTs水平都在12 h组高于24小时(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)。接受pbs相比,LPS-injured老鼠,mk - 571管理显著降低CysLTs生产12 h (gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)。这些结果表明,mk - 571可以抑制MRP1-mediated LTC运输gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,从而降低CysLTs和增加LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba生产。CysLTs促炎脂质,可以增加血管通透性。gydF4y2Ba
Reversan,更有选择性的MRP1抑制剂用于小鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎。管理Reversan显著降低细菌菌落计数(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)和白细胞总数和中性粒细胞计数(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2BaBALF中)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎。gydF4y2Ba
管理MRP1抑制剂(mk - 571和Reversan)以类似的方式表现为硕士或硕士电动车与急性肺损伤小鼠,这表明MSC或MSC EV可能共享一个共同的机制与mk - 571或Reversan(即。,抑制MRP1活动)。类似于MSC或MSC EV治疗,铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba比低mk - 571治疗小鼠虽然不是统计学意义(gydF4y2Ba补充图2摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
LY293111, LTBgydF4y2Ba4gydF4y2BaBLT1拮抗剂,抑制MSC电动汽车的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌的水平gydF4y2Ba
以确定MSC EV的抗菌效果被LTB介导gydF4y2Ba4gydF4y2BaLY293111,特定的LTB拮抗剂gydF4y2Ba4gydF4y2BaBLT1,接种于小鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎治疗MSC EV。gydF4y2Ba
老鼠感染gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌,和4 h后,MSC EV单独或连同LY293111管理到老鼠。MSC EV治疗显著降低BALF的细菌菌落计数与PBS治疗。然而,MSC电动车管理一起LY293111废除这一效应(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。MSC EV治疗也减少了总炎症细胞和TNF-α和MIP-2 BALF中由LY293111废除cotreatment (gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
mir - 145调节MRP1的表达gydF4y2Ba
我们下一个决定是否MSC MSC EV下调MRP1活动通过mir - 145的转移。我们第一次cocultured LPS-stimulated Raw267.4细胞与MSC预处理或没有mir - 145 antagomir。实时PCR显示gydF4y2BaMRP1gydF4y2Ba信使rna表达降低与MSC治疗。然而,MSC对MRP1抑制的影响被废除MSC预处理时,mir - 145 antagomir (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
确认MSC电动车对MRP1抑制的影响是由于转让由MSC EV mir - 145,我们和mir - 145转染MSC EV antagomir coculture之前或消极的控制。电动汽车降低了mir - 145水平mir - 145 antagomir (gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。更重要的是,与PBS治疗相比,MSC EV转染与负控制显著降低MRP1表达式,而MSC和mir - 145 EV击倒(mir - 145 antagomir)未能这样做(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。这些结果表明,mir - 145的转移从MSC EV目标Raw267.4细胞造成压制gydF4y2BaMRP1gydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba
然后我们决定如果增加mir - 145表达Raw264.7细胞调控的表达gydF4y2BaMRP1gydF4y2Ba。Raw267.4细胞转染和mir - 145模拟或消极的控制。实时PCR表明,mir - 145水平显著增加了mir - 145模拟(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba),并相应地MRP1表达减少(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba)。我们的研究结果表明,gydF4y2BaMrp1gydF4y2Bamir - 145的目标,mir - 145负监管gydF4y2BaMRP1gydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba
mir - 145模拟的吞噬作用增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌通过Raw267.4细胞gydF4y2Ba
我们检查是否增加mir - 145表达增加对GFP-labeled Raw267.4细胞的吞噬能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌。Raw267.4细胞转染mir - 145模拟显示增加荧光强度比模拟负控制(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
击倒mir - 145的MSC EV抑制MSC电动汽车的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌的水平gydF4y2Ba
我们下一个决心mir - 145 antagomir治疗是否会影响MSC EV的体内抗菌活性。MSC电动车使用mir - 145 antagomir或消极的控制管理gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Bapneumonia-injured老鼠。所示gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba,它管理gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌导致显著的细菌负荷在BALF 28 h,这是减少与MSC EV疗法。然而,antagomir预处理MSC EV CFU计数增加三倍以上MSC EV -控制治疗。此外,MSC EV的有益影响治疗减少白细胞总数和中性粒细胞计数和BALF中TNF-α水平和蛋白质浓度被废除,mir - 145 antagomir治疗(gydF4y2Ba图7罪犯gydF4y2Ba)。因此,击倒mir - 145的MSC EV显著降低MSC EV的体内抗菌和抗炎作用。我们的研究结果表明,mir - 145水平呈负相关MRP1的mRNA水平(gydF4y2Ba图6 a egydF4y2Ba)、蛋白质功能(gydF4y2Ba图2 ggydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba)和吞噬作用(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。MSC电动车在急性肺损伤的治疗活动是介导通过mir - 145 (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba通过下调MRP1函数。gydF4y2Ba
MSC在细胞外LTA EV的效果gydF4y2Ba4gydF4y2BaH和MMP-9表达式gydF4y2Ba
细胞外的英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2BaH可以减少炎症,降低PGP,通过酶如MMP-9 ECM产生胶原蛋白。我们测量LTAgydF4y2Ba4gydF4y2BaH和MMP-9 Raw267.4受伤细胞的上清液中的蛋白质含量与MSC coincubated EV(使用mir - 145 antagomir或消极的控制)。英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在MSC EV - H是在14 H控制与PBS相比治疗组(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)。MMP-9蛋白质水平被发现在所有三组升高超过24小时(数据没有显示)。然而,在24 h, MSC治疗EV -控制显著降低gydF4y2BaMMP-9gydF4y2Ba信使rna表达和表现出降低的趋势MMP-9蛋白表达(gydF4y2Ba补充图3 b, 3 cgydF4y2Ba)。增加本公司的影响gydF4y2Ba4gydF4y2BaH和减少gydF4y2BaMMP-9gydF4y2Ba表达式被废除MSC EV时使用mir - 145 antagomir (gydF4y2Ba补充图3 a - cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
我们的研究表明,(gydF4y2Ba1gydF4y2BaMSC和MSC电动车管理导致了LTB显著升高gydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平的BALF LPS-induced急性肺损伤gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在小鼠肺炎(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba);MSC EV小鼠有显著的抗菌活性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎、由LTB介导的部分gydF4y2Ba4gydF4y2Ba活动通过BLT1受体(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba),这是被击倒mir - 145 (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba);MSC EV治疗减少MRP1 mRNA表达(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba),蛋白质含量(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba),泵活动(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)(这些影响被击倒废除mir - 145) (gydF4y2Ba无花果2 g。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba);类似于MSC EV,管理MRP1抑制剂(mk - 571或Reversan)减少大量炎症细胞(gydF4y2Ba4无花果。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)、细菌(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)和LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba),随后LTB增加gydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)对小鼠急性肺损伤(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba);类似于MSC EV, Raw267.4细胞转染与miR145模仿降低了MRP1 mRNA表达(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba),MRP1泵活动(gydF4y2Ba图2 hgydF4y2Ba),和增强吞噬活动gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细菌(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)。综上所述,我们的研究首次透露,据我们所知,MSC EV抑制MRP1表达式通过转让mir - 145,导致减少细胞外的LTC水平gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和增强LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba生产增加了LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平,然后通过LTB介导增加抗菌活性gydF4y2Ba4gydF4y2Ba/ BLT1信号(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们和其他调查人员证实了MSC的治疗效果或MSC电动车在炎症和感染(急性肺损伤模型gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。我们表明,MSC EV减少总细菌负荷小鼠(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)和体外灌注人类肺(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)受伤gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎。然而,MSC EV的抗菌活性的机制在很大程度上仍未知。最近的研究已经证明了LTB的重要抗菌效果gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在肺炎和败血症(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。这些研究为我们提供了生物学基本原理假设MSC的抗菌效果或MSC电动车在急性肺损伤是通过增加LTB部分gydF4y2Ba4gydF4y2Ba活动。高水平的LTBgydF4y2Ba4gydF4y2BaMSC EV-treated BALF中检测到gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎小鼠和MSC-treated LPS-induced急性肺损伤小鼠(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。MSC EV治疗还显示改进的细菌清除率gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎小鼠。然而,这种效应被废除cotreatment LY293111 (gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba),这表明LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba/ BLT1轴是一个关键因素在MSC EV的抗菌效果。gydF4y2Ba
确定MSC或MSC EV MRP1表达减少,从而增加了LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平,我们首先研究了MSC电动车对MRP1体外蛋白表达和功能。免疫印迹分析表明,MRP1表情LPS-stimulated单核细胞减少MSC EV治疗后(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba),这是与抗菌活性增加有关(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。MDR试验表明,MSC厘米或孤立的MSC EV胞内荧光强度增加LPS-stimulated Raw267.4细胞,导致从减少MRP1泵活动(gydF4y2Ba图2汉英gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
然后我们管理mk - 571小鼠LPS-induced急性肺损伤探索MRP1的抑制是否影响LTs的生产。类似于MSC EV,管理mk - 571抑制炎症细胞的大量涌入和降低BALF中促炎细胞因子剂量依赖性的方式(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。LTC的流出gydF4y2Ba4gydF4y2Bamk - 571治疗后受损的CysLT水平下降12 h (gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba),这是与LTB增加有关gydF4y2Ba4gydF4y2Ba水平在24小时(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。Reversan,更有选择性的MRP1抑制剂用于小鼠gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎。类似于MSC EV, Reversan显著降低细菌菌落计数和BALF中炎症细胞的浸润(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)。mk - 571或Reversan管理行为以类似的方式MSC或MSC电动汽车,这表明他们可能共享一个共同的机制(即。MRP1的抑制)。然而,与mk - 571相比,导致更高的LTB MSC EV治疗gydF4y2Ba4gydF4y2BaLPS-injured或水平gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在小鼠肺炎(gydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。这表明MSC和MSC EV MRP1抑制可能有更强的影响比mk - 571或有其他机制MSC或MSC电动汽车可能会加强LTB的生产gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。MDR泵试验表明,MSC电动车也有类似的效果,mk - 571抑制MDR泵活动(gydF4y2Ba图2 fgydF4y2Ba)。因此,可能会有一些其他参与LTB信号gydF4y2Ba4gydF4y2Ba生产。我们之前证明本身MSC分泌LL-37 (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),与广谱杀菌活性肽。LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba众所周知,与LL-37交互。LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba可以触发释放LL-37 BLT1-dependent。同时,LL-37会引起酶的易位5-lipoxygenase细胞核周围的膜,从而促进LTB的生产gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。LL-37还可以增强LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba全身的吞噬作用(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。在最近的研究中,MSC EV-suppressed MRP1活动与增强LTB的生产gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba可能与协作方式LL-37抑制炎症,减少细菌增长(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
尽管LTs分泌主要由白细胞、治疗与MSC, MSC EV, mk - 571减少了大量炎症细胞(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),这是与LTB增加有关gydF4y2Ba4gydF4y2BaBALF中水平(gydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。有几种可能性LTB的原因gydF4y2Ba4gydF4y2Ba较低的水平可高白细胞数。研究表明,MSC能抑制中性粒细胞凋亡,延长生存白细胞,增强其功能(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),可能导致增强抗菌活性,降低免疫细胞的贩卖受伤的肺泡。此外,实际的LTB转换gydF4y2Ba4gydF4y2Ba可能的结果gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba细胞生物合成。LTB的合成gydF4y2Ba4gydF4y2Ba通过个人从AA酶需要两个步骤。一旦英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba是由炎症细胞,它可以被转移到本公司gydF4y2Ba4gydF4y2Ba生成LTB H-containing细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba或LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba生成LTC S-containing细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba52gydF4y2Ba),可能减少LTB的总产量gydF4y2Ba4gydF4y2Ba中性粒细胞。此外,AA之间也可以转移细胞(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
MSC和MSC对急性肺损伤EV显示出类似的保护作用在体内和体外都通过减少炎症和肺通透性,增强抗菌活性(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。理解的机制,我们研究了细胞内的活动或水泡mir - 145,因为它被发现在MSC和MSC EV (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),它是为了调节MRP1表达式(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。qPCR和泵活性测定,MRP1 mRNA表达和MRP1泵功能LPS-stimulated Raw267.4细胞表达下调与MSC EV治疗,这种效应是被击倒mir - 145 (gydF4y2Ba无花果2 g。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。MSC EV治疗改善细菌清除率gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎小鼠,这种效应被废除mir - 145击倒(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。在确证,Raw267.4细胞,转染miR145模仿,降低了MRP1 mRNA表达(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba),降低泵的活动(gydF4y2Ba图2 hgydF4y2Ba)和改进的细菌清除率(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)。我们的数据表明,mir - 145是一个关键调节器MRP1的表达和功能,符合最近的研究(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),mir - 145直接监管MRP1表达式通过增加MRP1信使rna降解目标其3′未翻译的区域gydF4y2BaMrp1gydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba
细胞外的英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2BaH据报道,帮助促进炎症的分辨率不同肺疾病通过PGP的退化,通过MMP-9从ECM生成胶原蛋白(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。我们之前显示MMP-9水平显著降低BALF的MSC-treated急性肺损伤小鼠与控制(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。在目前的研究中,我们表明,MSC EV治疗导致LTA增加gydF4y2Ba4gydF4y2BaH水平和减少MMP-9 mRNA的表达。这些影响是依赖mir - 145 (gydF4y2Ba补充图3 a - cgydF4y2Ba)。增加细胞外的英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2BaH和减少MMP-9可能参与MSC EV的抗炎效应(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
PGH AA也可以代谢gydF4y2Ba2gydF4y2Ba通过环氧酶的酶,然后转换为铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba多药耐药性和运输外通过蛋白质4。抑制铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba可能会降低细菌生长。最近的一项研究表明,脂肪tissue-derived MSC对的保护作用gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba肺炎是部分通过抑制铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba随后增加巨噬细胞吞噬作用(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba)。在我们的研究中,铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2BaMSC EV治疗后水平并没有改变gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba肺炎在老鼠身上,表明治疗效果可能不是由于降低了铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba水平。仍然是有争议的铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba是有益的或感染起着消极的作用(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)。先前的研究表明,LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba可以增强,而铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba可以抑制肺泡巨噬细胞吞噬作用的细菌(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba通过夏令营)(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。此外,其他研究已经表明,铂族元素增加gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba比例增加gydF4y2Ba婴儿利什曼虫gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba)。MSC和动力都可以影响运输ABC蛋白表达和功能(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba)。例如,铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba可以诱导gydF4y2BaMRP1gydF4y2Ba信使rna表达人类支气管上皮细胞(gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba)。因此,铂族元素之间的比率gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba可能反映了MRP1水平和整体的抗菌活性。我们的数据表明,减少铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba比例与MSC的治疗效果或MSC EV (gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。铂族元素的重要性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba在炎症和感染MSC治疗需要进一步研究。gydF4y2Ba
目前的研究也有一些局限性,需要进一步的研究:1)我们不能排除这种可能性,其他目标基因(s)gydF4y2BaMrp1gydF4y2Ba可能参与了MSC通过mir - 145 EV的治疗效果。最近,筱原和他的同事们(gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba)表明,mir - 145在癌症电动车可以针对HDAC11,促进il - 10表达和M2巨噬细胞极化。我们以前的研究表明,MSC或MSC电动车管理可以上调il - 10信使核糖核酸或蛋白表达(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。是否有一些MSC EV mir - 145和il - 10之间的联系生产需要调查;2)LY293111 BLT1的对手,只是部分减少了MSC EV的抗菌和抗炎活动(gydF4y2Ba图5汉英gydF4y2Ba),建议其他LT-derived因素可能参与抗炎的效果。我们和其他人最近发现人类msc提升解决LPS-induced小鼠脓毒症急性肺损伤或以下幼童腹壁薄弱部分通过专门的分泌proresolving脂质介质如lipoxingydF4y2Ba4gydF4y2Ba或resolvin (gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba68年gydF4y2Ba)。Lipoxin一gydF4y2Ba4gydF4y2Ba是直接来自英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,并在无菌和消炎感染性损伤的动物模型gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba)。研究正在进行电动汽车是否来源于msc可以生成专业proresolving脂质介质,与母细胞相似,和他们如果有什么角色总体治疗效果;3)耐多药泵试验评估凋亡和MRP1函数,不是MRP1孤单。MSC EV凋亡活动的影响在整个治疗效果需要探索。gydF4y2Ba
总之,MSC EV抑制MRP1表达式中mir - 145的转移,导致增强的LTBgydF4y2Ba4gydF4y2Ba生产,随后通过LTB增加细菌吞噬作用gydF4y2Ba4gydF4y2Ba/ BLT1信号。这代表了一个之前从未描述机制MSC和MSC EV的抗菌活性。gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
作者没有利益上的冲突。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢Airan刘博士的帮助与MSC EV分析,博士Hyungsun Lim与动物实验寻求帮助,和史蒂芬博士Gennai援助与MSC EV的准备。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这项工作是由格兰特hl - 113022国家心脏,肺和血液研究所美国国立卫生研究院(J.W.L.)。gydF4y2Ba
本文包含的在线版本gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本文中使用的缩写:gydF4y2Ba
- AAgydF4y2Ba
- 花生四烯酸gydF4y2Ba
- BALFgydF4y2Ba
- 支气管肺泡灌洗液gydF4y2Ba
- 厘米gydF4y2Ba
- 条件培养基gydF4y2Ba
- CtgydF4y2Ba
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- CysLTgydF4y2Ba
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- 细胞外基质gydF4y2Ba
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- 细胞外囊泡gydF4y2Ba
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- 它gydF4y2Ba
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- 英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2BaHgydF4y2Ba
- 英国网球协会gydF4y2Ba4gydF4y2Ba水解酶gydF4y2Ba
- LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba
- LTCgydF4y2Ba4gydF4y2Ba合酶gydF4y2Ba
- 凋亡gydF4y2Ba
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- MSC条件培养基gydF4y2Ba
- MSC电动车gydF4y2Ba
- MSC细胞外囊泡gydF4y2Ba
- NHLFgydF4y2Ba
- 正常成人肺纤维母细胞gydF4y2Ba
- 铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba
- 前列腺素EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba
- PGPgydF4y2Ba
- proline-glycine-proline。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2018年11月26日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2019年7月30日。gydF4y2Ba
- 版权©2019年由美国免疫学家协会有限公司gydF4y2Ba
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