文摘gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba单细胞基因组研究面临的挑战在肾和其他固体组织生成一个包含罕见的高质量的单细胞悬液或difficult-to-dissociate细胞类型和是免费的RNA降解和artifactual转录应力响应。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba我们比较单细胞RNA序列(scRNA-seq)使用DropSeq平台single-nucleus RNA序列(snRNA-seq)使用sNuc-DropSeq DroNc-seq, 10 x铬平台在成年小鼠肾脏。我们验证snRNA-seq从小鼠肾脏纤维化的单侧输尿管梗阻(UUO)手术后14天。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba总共有11391个转录组比较中生成阶段。我们确定了十scRNA-seq集群的数据集,但肾小球细胞类型缺席,一个集群主要由artifactual离解gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba诱导应激反应基因。相比之下,从所有三个平台snRNA-seq捕获一个肾脏细胞类型的多样性,并不代表scRNA-seq数据集,包括肾小球足细胞、系膜细胞、内皮细胞。未发现应激反应基因。我们snRNA-seq协议取得了20倍更足细胞与出版scRNA-seq数据集(分别为2.4%和0.12%)。出乎意料的,单细胞和single-nucleus平台相当于基因检测灵敏度。进行验证,分析冻结14天UUO肾脏发现罕见的球旁细胞,小说近端小管和成纤维细胞细胞激活状态,以前阻力指标信号通路也许可以不明。gydF4y2Ba
结论gydF4y2BasnRNA-seq达到类似的基因检测scRNA-seq成人肾脏,也有实质性的好处,包括减少离解偏见,兼容冻结样品,消除dissociation-induced转录应激反应,成功的性能在纤维化肾发炎。gydF4y2Ba
最近取得了很大的进步在描述肾脏在开发中,体内平衡和癌症使用单细胞RNA序列(scRNA-seq)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba的高吞吐量和敏感性scRNA-seq使它非常适合全面地图形态变化的疾病,但三个限制防止更广泛采用这种变革性的技术分析肾脏疾病。首先,当前的协议不准确捕获所有肾脏细胞类型,因为离解本身可能损坏敏感细胞,同时,未能释放其他胶原基质包围。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba虽然抽样数量更大的细胞可以部分地克服这个限制,它可能不是在经济上可行。第二,当前酶和机械方法单细胞分离引入压力诱导转录工件。尽管cold-active蛋白酶有减轻这个问题容易分离胚胎肾,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba这不是工作在成人或病变的肾脏。此外,cold-active蛋白酶仍倾向的选择容易分裂的细胞类型。最后,与冷冻档案材料目前的方法是不相容的,复杂的分析组织可用性是不可预测或诊断时需要时间,肾活检。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
单细胞分离和甲醇固定gydF4y2Ba
肾脏C57BL / 6小鼠的碎成1毫米块刀片和孵化酶37°C的离解缓冲区包含250 U /毫升Liberase(罗氏)和40 U /毫升DNase 10分钟后,解决方案被转移到一个Miltenyi管,和gentleMACS D1程序运行(Miltenyi)。细胞进一步消化与磨碎一个额外的10分钟,通过添加10%的边后卫,反应停止。分离细胞被离心分离颗粒状(500×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟),洗两次,经过35 -gydF4y2BaμgydF4y2Bam过滤器(Falcon),颗粒状再次离心(500×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟)。细胞在PBS resuspended加上1% BSA和净化通过流式细胞仪优盖茨向前散射和散射。收集二百万个细胞/肾细胞固定。甲醇固定协议是改编自至上gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba总之,细胞resuspended在200年gydF4y2BaμgydF4y2Bal冰冷的PBS;100%甲醇(800gydF4y2BaμgydF4y2Bal) prechilled−20°C和添加到细胞悬液一滴一滴地。MeOH-cell混合物在冰上保持15分钟,然后转移到−80°C冰箱。经过7天的存储,细胞从−80°C到冰和颗粒状离心(2000×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟)在寒冷的房间。在PBS + 0.01% BSA细胞被洗两次,40 -过滤gydF4y2BaμgydF4y2Bam细胞过滤器(pluriSelect)、统计、稀释,DropSeq和加工。gydF4y2Ba
Single-Nuclei隔离gydF4y2Ba
原子核与原子核EZ裂解缓冲隔离(nuc - 101;Sigma-Aldrich)补充蛋白酶抑制剂(5892791001;罗氏公司)和核糖核酸酶抑制剂(N2615;Promega AM2696;生命技术)。样本使用Dounce切成< 2毫米块和均质均质器(885302 - 0002;金布尔Chase) 2毫升的冰冷的核EZ裂解缓冲,和他们孵化冰5分钟与一个额外的2毫升的裂解缓冲。通过40 -匀浆的过滤gydF4y2BaμgydF4y2Bam细胞过滤器(43-50040-51;pluriSelect),然后在500×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C。颗粒是resuspended和洗4毫升的缓冲区,然后,它孕育了冰5分钟。另一个离心后,颗粒在核resuspended暂停缓冲(BSA 1×PBS, 0.07%,和0.1%核糖核酸酶抑制剂),通过20 -过滤gydF4y2BaμgydF4y2Bam细胞过滤器(43-50020-50;pluriSelect)和统计。gydF4y2Ba
单细胞DropSeq、sNuc-DropSeq DroNc-seq, sNuc-10×gydF4y2Ba
我们用软光刻技术gydF4y2Ba9gydF4y2Ba制造DropSeq和DroNc-seq硅大师(材料科学与工程研究所的圣路易斯华盛顿大学),与聚二甲基硅氧烷微流控设备。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba设备测试使用正则DropSeq珠子和DroNc-seq珠子(ChemGenes)之前使用。上运行DropSeq甲醇固定细胞,我们跟着协议开发的McCarroll实验室(gydF4y2Bahttp://mccarrolllab.com/dropseq/gydF4y2Ba)。sNuc-DropSeq DroNc-seq,我们做了以下修改从原来的协议。首先,聚蔗糖pm - 400添加到核暂停缓冲而不是裂解缓冲。第二,细胞核被装载在一个集中的每微升200核sNuc-DropSeq DroNc-seq每微升300核。第三,每个进气道的流率进行调整。对于sNuc-DropSeq,我们使用15000年gydF4y2BaμgydF4y2Ba3000年石油和l / hgydF4y2BaμgydF4y2Bal / h的珠子和细胞核。对于DroNc-seq,我们使用13000年gydF4y2BaμgydF4y2Ba2000年石油和l / hgydF4y2BaμgydF4y2Bal / h的珠子和细胞核。第四,乳液在冰上保持30分钟前允许释放核RNA液滴破碎。这些更改之后,原子核紧身上衣率保持在6%以下根据物种混合测试运行实验。single-nucleus 10×铬(sn10×),我们跟着单细胞协议所提供的制造商(10×基因组学)来生成高质量的互补脱氧核糖核酸数据库。gydF4y2Ba
单侧输尿管梗阻手术gydF4y2Ba
所有老鼠实验显示进行动物实验指南发布的动物保健和使用委员会华盛顿大学。单侧输尿管梗阻(UUO)手术进行8-week-old C57Bl6小鼠作为描述。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba简单地说,与连续蒸发异氟烷麻醉实现(2%)使用麻醉系统RC2 (922100;VetEqip)在手术过程中。丁丙诺啡(0.05毫克/公斤),meloxicam(1毫克/公斤)和利多卡因(1%)被给予皮下注射达到镇痛。侧面切口后,右肾被曝光和释放perirenal脂肪组织,输尿管是绑在极低的水平使用两个4.0丝绸领带。伤口被关闭在斯台普斯。小鼠安乐死UUO手术后14天。gydF4y2Ba
生物信息学分析gydF4y2Ba
生物信息学分析的补充材料。gydF4y2Ba
数据可用性gydF4y2Ba
所有相关数据都存放在基因表达综合下加入GSE119531数量和RBK财团数据库完全可访问gydF4y2Bahttps://doi.org/10.25548/14-4KG6gydF4y2Ba。一个可搜索的数据库,包括基因表达投射到gydF4y2BatgydF4y2Ba分布式随机邻居嵌入(tSNE)图,也可以gydF4y2Bahttp://humphreyslab.com/SingleCell/gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
结果与讨论gydF4y2Ba
我们从8-week-old老鼠肾脏孤立的单个细胞,纯化的流式细胞仪消除细胞碎片,固定在甲醇,储存在−1周80°C,然后,DropSeq执行。此外,我们修改核隔离协议gydF4y2Ba11gydF4y2Ba对于肾脏,准备核悬浮液(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)从snap-frozen肾脏保存1周在−80°C,和执行single-nucleus RNA序列(snRNA-seq)。共有11391个转录组生成。gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba表明,对单细胞DropSeq (scDropSeq),大多数映射读取的其实,而对于single-nucleus DropSeq (snDropSeq) DroNc-seq,和sn10×,大多数intronic读取。跨平台映射读取的平均数量是类似但只有外显子和内含子读取包括(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。令人惊讶的是,平均每个细胞的基因检测数量也比较在所有四个平台,只要我们使用映射外显子和内含子写道,尽管核包含mRNA大大低于整个细胞(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。因为线粒体是胞质,我们只检测到使用scDropSeq线粒体转录,他们占所有的24% scDropSeq基因(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。减去线粒体基因后,所有三个single-nucleus技术实际上比scDropSeq取得优越的每个细胞的基因检测。映射的重要性其实和intronic读取snRNA-seq数据集如下的改进质量的改善非零读的比例在所有三个平台(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。较低的映射深度阅读,scDropSeq和DroNc-seq发现10% -25%比snDropSeq独特的基因/细胞或sn10×;然而,差异缩小在更高的深度阅读(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们比较无监督聚类结果使用一组匹配的上皮细胞和细胞核转录组。使用管状上皮细胞共同scDropSeq和DroNc-seq数据集,我们选择了1469最优细胞核对通过计算辍学加权皮尔逊相关性描述。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba单独使用其实读,我们可以确定的只有四个集群DroNc-seq数据集,数据集而scDropSeq取得了七个集群(gydF4y2Ba图1中,E和FgydF4y2Ba)。包含内含子改善DroNc-seq集群6细胞类型,但并没有改变scDropSeq集群的数量(gydF4y2Ba图1中,G和HgydF4y2Ba)。虽然比DroNc-seq scDropSeq产生了一个集群,这是一个工件在离解集群应激反应基因诱导表达。包括intronic读取改善集群凝聚力(平均在集群coclustering)和分离(平均coclustering区别与最近的集群)DroNc-seq但不是scDropSeq (gydF4y2Ba图1中,我和JgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba
环境mRNA在组织分离污染scRNA-seq数据发布。例如,高表达基因(例如,Slc34a1)从高度丰富的近端小管中可以检测到所有细胞集群在最近的数据集gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充图2一个gydF4y2Ba)。我们发现了类似的管状污染在我们的数据平台,虽然有点减少污染的程度相比,snRNA-seq scRNA-seq (gydF4y2Ba补充图2中gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们使用综合分析确定守恒的细胞类型使用不同的平台(scRNA-seq和snRNA-seq技术)生成批处理校正后与典型相关分析保持一致。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba我们确定了13个集群在合并后的数据集,包括足细胞、内皮细胞和肾小球膜,九个小管集群,一个巨噬细胞集群(gydF4y2Ba图2中,A和BgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)。这个数据集的比较与其他三个最近的肾脏RNA序列数据集证实我们的集群注释(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba突出每个细胞的来源到tSNE透露每个平台的相对贡献每个集群(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。所有三个核方法有更好的灵敏度检测足细胞,内皮细胞,间细胞(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。事实上,scDropSeq数据单独集群时,没有独立的足突细胞或内皮细胞集群,而这三个single-nucleus平台确定这些细胞类型(gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。我们从scDropSeq联合足突细胞获得的频率以及那些从公园gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并把他们与频率观察snRNA-seq数据集。这揭示了20倍足细胞从snRNA-seq相比scRNA-seq(分别为2.4%和0.12%;gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.02)(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们估计的数量差异基因检测在细胞和细胞核,问这可能如何影响结果的解释。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba最近描述分析方法后,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba我们发现大部分表达基因(9588;71.4%)显示出类似的检测(< 20%)在细胞核和细胞差异,只有452个基因(3.4%)被发现在至少25%比核,细胞和266个基因(2.0%)被发现在至少25%比细胞(核gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)。同样,只有5.0%(676个基因)的检测基因表达在细胞高度比原子核(褶皱变化> 1.5;调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05),863个基因表达(6.4%)高核的细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。例子scDropSeq基因丰富的数据集包括线粒体和核糖体基因以及热休克通路中的基因(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。令人惊讶的是,nucleus-enriched基因包括许多基因驱动细胞身份,如溶质运营商和转录因子,从大脑符合最近的一份报告。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba我们也可以发现长非编码rna优先与完整的细胞相比,核(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba
我们接下来问这些差异是否会改变细胞分类使用最近出版的鼠标使用DropSeq生成肾小球单细胞地图集。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba我们提取的足细胞、内皮细胞和系膜细胞(650细胞总数)从snDropSeq和DroNc-seq数据集,用随机森林模型选择的650个最优细胞肾小球细胞图谱。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba合并后的数据集聚集成三个不同的细胞类型(gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba),相当于贡献每个细胞和核数据集(gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba)。使用MetaNeighbor,我们验证每个肾小球细胞类型被scDropSeq有非常高的接收机算子特性曲线下的面积分数对应的细胞类型被snDropSeq和接收机算子特性曲线下的面积分数很低的其他两种细胞类型(gydF4y2Ba图3 ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba这表明我们snRNA-seq数据集复制细胞分类与高度的信心,尽管大量的一些差异基因在细胞核和完整的细胞。gydF4y2Ba
应激反应基因诱导蛋白水解过程中组织游离在37°C。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在我们scDropSeq数据集,一个全新的集群的基础上成立应激反应基因(gydF4y2Ba图3中,H和IgydF4y2Ba)。核分裂进行冰,防止新基因转录。我们可以发现丰富的应激反应基因表达在所有细胞的小鼠肾小球阿特拉斯,这是缺席由snDropSeq(生成的数据gydF4y2Ba图3 jgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba)。肾小球细胞类型之间的基因差异表达的比较表明,线粒体基因、热休克基因,与细胞凋亡相关的基因被发现在scDropSeq数据但缺席snDropSeq数据(gydF4y2Ba图3 kgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们验证snRNA-seq协议14肾脏纤维化和炎症UUO天;6147年single-nucleus转录组的生成sn10×平台,平均763个不同的基因和每核1206独特的分子标识符。无人监督的分析确定了17个独特的细胞簇tSNE (gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)。其中包括两个新颖的近端小管的数量,其中一个特点是由一个强大的增殖基因签名(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba);因此,我们注释这个集群激增近端小管细胞。它还表示损伤标记,包括Havcr1和Vcam1 (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。其他小说近端小管集群不是骑自行车,而是表达了强烈的细胞运动转录签名。我们注释这肉瘤近端小管集群。有趣的是,这个集群表达了一些损伤标记(Vcam1)而不是其他人(Havcr1),而且,它表达了许多分泌促炎细胞因子,包括巨噬细胞化学引诱物Ccl2,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba巨噬细胞增殖的细胞因子Il34,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba和中性粒细胞化学引诱物处于受控和Cxcl2。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba差异基因表达这两个小说之间近端小管细胞状态显示增殖集群是由细胞周期基因本体术语,而肉瘤集群的主要特征是调节细胞运动(gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba)。为例,rhoGEF Dock10肉瘤丰富的集群(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba),这个基因通过Cdc42通路调节细胞的形态发生。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba
我们可以发现罕见的肾小球旁器细胞的基础上表达Ren1以及内皮素受体(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)。有趣的是,肾小球旁细胞也表达了Hopx,成体干细胞的标志在小肠,大脑和毛囊。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba肾素谱系细胞足突细胞progentors已经被提议作为。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba我们还发现了两个截然不同的激活成纤维细胞的数量。其中一个表达甘露糖受体2,结合和内在化的胶原蛋白和变弱肾纤维化(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba其他激活成纤维细胞表达细胞类型tenascin C,最近已确定为一个促进肾纤维化的细胞外基质糖蛋白。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba这两种类型的细胞表达gydF4y2BaαgydF4y2Ba平滑肌肉肌动蛋白,这表明它们独特的肾myofibroblasts子集。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba
最后,我们分析了receptor-ligand双特异性的方式来说明snRNA-seq可以揭示意想不到的细胞间通信通路。我们发现已知(Bmp6、Pdgfd和Spp1)和小说(Sema3c Sema6a, Gpc, Slit3)信号的关系(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba图4 ggydF4y2Ba总结了这些阻力指标相声也许可以肾脏纤维化的通路。gydF4y2Ba
总之,snRNA-seq提供离解减少偏见和等效基因检测与scRNA-seq相比。这很重要,因为单细胞转录组costly-minimizing细胞数量而最大化细胞表示将减少开支。我们表明,尽管snRNA-seq丰富比例较小(< 7%)的比scRNA-seq不同的基因,其中很多是线粒体或artifactual应激反应基因,与细胞识别不受损。最后,我们使用snRNA-seq议定书纤维化肾发炎说明小说细胞状态和一种罕见的细胞类型,和我们的细胞间通讯地图,我们需要一个初始步骤的肾脏单细胞技术在解决一个重大的挑战:合成这些丰富的空间信息的数据集。gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
一个也没有。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充图1gydF4y2Ba。核准备从成年小鼠肾脏。gydF4y2Ba
补充图2gydF4y2Ba。比较管mRNA跨平台污染。gydF4y2Ba
补充图3gydF4y2Ba。的相关性结合单细胞和single-nucleus RNA-seq集群microdissected小管段RNA-seq,老鼠肾脏单细胞阿特拉斯,和鼠标肾小球单细胞地图集。gydF4y2Ba
补充图4gydF4y2Ba。由tSNE所有四个数据集的聚类。gydF4y2Ba
补充图5gydF4y2Ba。小提琴情节显示肾小球簇特异性标记的单细胞和single-nucleus联合数据集。gydF4y2Ba
补充图6gydF4y2Ba。立即早期基因表达的小鼠肾小球细胞scDropSeq生成的阿特拉斯。gydF4y2Ba
补充图7gydF4y2Ba。基因本体论肉瘤之间的差异表达基因增殖和近端小管集群。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
主要支持这项工作是陈从173970年格兰特的扎克伯格倡议。额外的支持来自美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK)赠款DK103740 (B.D.H.)和DK107374 (B.D.H.)和趋势,糖尿病并发症联盟(gydF4y2Bawww.diacomp.orggydF4y2Ba)赠款DK076169和DK115255。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
打印前在网上发布。出版日期可以在gydF4y2Bawww.jasn.orggydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本文包含以下补充材料在网上gydF4y2Bahttp://jasn.asnjournals.org/lookup/suppl/doi: 10.1681 / ASN.2018090912 /——/ DCSupplementalgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
- 版权©2019由美国肾脏病学会gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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