文摘
疗法针对炎症显示不一致的结果在特发性肺纤维化(IPF)。Aerosolised干扰素(IFN) -γ已被建议作为一种新型的治疗。主机呼吸道微生物的变化相关的炎性环境和可能与疾病进展相关。在这里,我们评估是否治疗aerosolised IFN-γ在IPF影响下呼吸道微生物或宿主的免疫表型。
IPF患者参加一个aerosolised IFN-γ试验进行了支气管镜检查在基线和后6个月。16 s rRNA测序的支气管肺泡灌洗液(BALF)被用来评估肺微生物。生物标记被Luminex试验测量等离子体,BALF和BAL细胞上清液。compPLS框架被用来评估分类单元之间的关联和生物标志物。
IFN-γ治疗并没有改变α或β多样性的肺部微生物和一些分类发生变化。虽然在等离子体生物标志物的变化,有一个增加IFN-γFit-3减少配体,IFN-α2和interleukin-5 BAL细胞上清液,减少肿瘤坏死factor-βBALF中。多个微生物类群之间的相关性常见口腔黏膜和宿主炎症生物标记物被发现。
这些数据表明,与宿主的免疫相关的肺部微生物组是独立在IPF语气和可能潜在的机械作用。
文摘
降低气道微生物和免疫学的语气在IPF相关联,独立于IFN-γ治疗产生影响http://ow.ly/cTDo30bsJiN
介绍
特发性肺纤维化(IPF)是一种进步的,不可逆转的特发性间质性肺病与平均2 - 3年的生存。然而,进展的速度不同个体之间,很难预测1]。不断发展的知识这种疾病的发病机理表明,环境因素会导致重复损伤肺泡上皮异常修复过程和疤痕。共病的存在条件,如肺气肿和gastro-oesophageal返流性疾病,可能会影响下呼吸道细菌和负面影响预后的IPF (2- - - - - -6]。随着调查下气道的微生物使用文化无关的技术,观察性研究表明,在IPF细菌增加负担和分类的差异(7,8]。然而,降低气道疾病的微生物的作用过程知之甚少。
一些疗法已被证明改变IPF的自然历史。肺移植延长IPF患者的生存期,但这个选项主要由捐献器官的供应是有限的。移植后生存差IPF相比与其他慢性肺疾病(如。囊性纤维化)。Pirfenidone (anti-fibrotic和消炎药)和nintedanib(一种羟吲哚衍生物抑制信号从血小板源生长因子(PDGF)受体,血管内皮生长因子(VEGF)受体和纤维母细胞生长因子(FGF)受体)已被证明缓慢下降的用力肺活量(1]。干扰素(IFN) -γ是一个从内部产生辅助1型(Th1)与抗炎细胞因子,anti-proliferative,免疫调节和anti-fibrotic函数(9]。尽管外生IFN-γ被证明是有效的在体外和IPF的动物模型10- - - - - -12),两个随机安慰剂对照试验使用皮下IFN-γ[9,13没能证明其IPF患者的治疗中获益。吸入IFN-γ比肠外IFN-γ(可能更有效14]。我们进行了第二阶段试验与IPF科目,并表明,吸入IFN-γ可以安全地送到肺实质和肺功能在整个审判过程中都保持稳定(15]。使用支气管镜的样本获得纵向试点研究,我们探讨可能的机制下呼吸道微生物群与宿主相互作用。我们评估肺微生物之间的关联和本地/系统性宿主免疫表型临床试验期间aerosolised IFN-γIPF患者。
方法
研究设计和参与者
前瞻性队列研究的目的是评估的有效性aerosolised IFN-γIPF患者。10个病人年龄在40至70年之间,与IPF诊断在过去的一年里,为(见纳入和排除标准的补充材料)。基线评估进行了包括体检、心电图、血氧饱和度的6分钟步行试验的测试脉搏血氧测量和(6 mwt)。肺功能测试(击球)数据较前5个月和前胸部高分辨率计算机断层扫描(HRCT)进行了综述。基线支气管镜检查患者同意后执行。吸入IFN-γ剂量100µg交货通过nebuliser三次每周至少80周(补充图S1)。击球时获得月度,重复胸部HRCT和支气管镜检查在6个月。数据被存储在一个安全的数据库,医疗信息的保护。支气管镜检查和标本处理细节描述的补充材料。这项研究是在ClinicalTrials.gov注册(NCT00563212)。
定量和测序的细菌16 s rRNA-encoding基因
DNA提取背景和非细胞BAL样品使用离子交换柱(试剂盒、希尔登,德国)。图书馆准备和测序进行16 s rRNA基因扩增子编码的V4地区Illumina公司MiSeq平台(美国Illumina公司,圣地亚哥,CA)如前所述[16,17]。香农指数计算评估α多样性(在示例多样性)。主坐标分析被用来想象β多样性差异(样本多样性之间)。比较α,或分类组间基线,我们使用非参数(Mann-Whitney)测试。评估α多样性的变化随着时间的推移,我们利用Wilcoxon rank-sum测试。β多样性比较是基于PERMANOVA(置换多元方差分析)。
测量的生物标志物
在活的有机体内炎症是评估BAL细胞计数,细胞差和测量的生物标志物。47个生物标志物测定Luminex平台上(美国Billerica的微孔,MA)在BALF中,等离子体和平衡细胞上清液(RPMI媒介文化24 h后)。测量水平的生物标记被认为是用于分析数据高于最低标准> 50%时样品的进一步细节(见补充材料)。生物标记被归类为Th1(集落刺激因子(gm - csf)、IFN-γ白介素(IL) 2、白介素和肿瘤坏死因子(TNF) -β),Th2 (IL - 4、IL-5、IL - 6、IL-9 IL - 10, IL-13和gm - csf), Th17 (IL-1βIL-17, IL - 6和fractalkine)和IPF (IL-1β、IL-17 IL-13,转化生长因子(TGF) -β,单核细胞化学引诱物蛋白(MCP) 1, IFN-γ,PDGF-AA和PDGF-AB-BB)。
统计分析
为了避免微生物的相对丰度数据的分布假设,我们使用非参数单变量假设检验的方法。对于微生物协会与离散的因素,我们使用要么Mann-Whitney测试(在两类)或克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析(两个以上类别的情况下)。成对的统计数据(Wilcoxon符号秩测试)被用于张后比较连续的协变量。与连续变量的测试,我们使用非参数斯皮尔曼相关测试。这些测试是在R利用Hmisc包(https://cran.r-project.org)。评估16 s组之间的差异数据,我们使用线性判别分析(LDA)效果(LEfSe)方法(18]。分类特征与LDA得分> 2.0表示为进化分枝图,由LEfSe与默认参数。调整为统计虚假的关联,从成分文物,多重共线性和重复测量设计,我们使用了compPLS框架,概述了在Ramanan等。(19),属之间显著的线性相关性的评估相对丰度和生物测量。在这些网络我们强调与Th1相关资料,Th2, Th17和IPF免疫反应20.]。序列可从国家生物技术信息中心序列读取存档(www.ncbi.nlm.nih.gov sra;加入SRP095188)。
结果
队列
受试者参加本研究和治疗从2008年6月到2009年12月。患者登记在4周的筛查。所有患者随访至少80周的80 - 130周。所有患者完成> 90%的计划。三个病人诊断证实了开放肺活检检查由一个独立的肺部病理学家其余临床标准会见了一致的胸部HRCT扫描。组织病理学诊断证实了通常的间质性肺炎(摘要)获得了40%的受试者和肺动脉高压基于回波多普勒被发现在60%的受试者。表1提出了人口、临床和击球数据。平均年龄是69岁,80%的男性和50%抽过烟。40%的病人接受N乙酰半胱氨酸治疗。所有的患者接受免疫抑制治疗。击球时显示一个限制性的模式,减少意味着(四分位范围)肺活量% pred(60 - 77%)(71%),肺的一氧化碳扩散能力% pred(39.5 -56.5%)(47.5%)和6 mwt (420 (287 - 490))。
评价肺的微生物
16 s rRNA BAL样本基因测序得到的中位数(四分位范围)7611(7017 - 9211)(最低4582)读取每个样本。技术-控制产生更少的读取(2959 (1628 - 4291);p < 0.001)。三个最丰富的操作序列中发现分类单位技术负面的控制:Chitinophagaceae_550392,Betaproteobacteria_247441和Nocardioidaceae_1088254(相对丰度12.3%(6.1 - -18.5%),12.3%(-18.4% - 5.1)和11.9%(5.9 - -17.9%),分别)。这些三个类群被发现在任何给定BAL样本> 0.01%。图1展示了聚类分析的基础上,最丰富的类群在任何给定的样本(> 5%)为所有BAL样本。符合之前的观察,样本集中在两组:一个富含属常见上呼吸道,等普氏菌,链球菌,韦永氏球菌属和梭菌属,第二个富含属一般描述为背景分类单元(假单胞菌,Acidocella和黄杆菌属)[21,22]。检查干扰素治疗对肺的影响微生物评估α和β多样性的变化。图2一个和b显示无显著差异在α或β多样性BAL样本之间的基线和post IFN-γ治疗。在每个主题(在评价UniFrac距离与IFN-γ治疗后)和不同学科之间显示了一个无意义的趋势更大程度的相似性在对象(图2 c)。然而,广泛的距离是指出在不同的科目。这表明,在一些科目低气道微生物保持弹性,微生物在其他学科经历了多个分类组成的变化。然后我们使用LEfSe IFN-γ治疗后评估分类变化。图2 d显示了一个进化分枝图展示很少有明显的分类变化。具体地说,与基线相比,一个属带注释的秩序放线菌目丰富IFN-γ治疗后,只有两个属带注释的家庭吗Lachnospiraceae和秩序MIZ46 IFN-γ治疗后下降。值得注意的是,这些变化发生在属相对丰度较低(< 1%)。
对宿主的免疫表型的评价
对宿主的免疫表型,我们测量BAL细胞差异体外生物标志物的生产。每个矿山生产> 6.8×106细胞。肺泡巨噬细胞的细胞差异显示优势(78.0%(69.0 -91.2%))与嗜中性BAL细胞微分(> 10%)出现在50%的样品(表1)。补充表S1显示了生物标志物水平BALF中细胞落下帷幕体外生物标志物生产,在等离子体水平基线和post IFN-γ治疗。正如所料,IFN-γ浓度BAL从检测水平增加到294 (161 - 1467)pg·毫升−1帖子IFN-γ治疗。此外,IFN-γ生产通过平衡细胞体外也从基线检测水平提高到28 (46)pg·毫升−1在细胞上清液。体外BAL细胞生产eotaxin FGF-2 IFN-α2和VEGF降低,虽然是一个无足轻重的趋势下降引发的生产,TNF-βPGDF-AA。更少的变化观察等离子体生物标志物之一。IL-7在基线和低水平文章中无法IFN-γ治疗,而sIL-2Ra从察觉基线IFN-γ治疗后低,但可测量的水平。
微生物与宿主免疫表型之间的相关性
我们检查了相对丰富的类群和之间的相关性在活的有机体内血浆及BALF的生物标志物水平体外生物标志物的生产平衡细胞。我们发现上呼吸道微生物群的分类群特征,如罗思氏菌属,韦永氏球菌属,普氏菌,梭菌属和链球菌往往共存。然后我们确定在基线有多种积极的和消极的分类单元之间的相关性识别和测量BALF中生物标志物,BAL细胞上清液和等离子体(补充图S2)。我们发现少了重要taxa-biomarker等离子体生物标志物之间的相关性与BALF或BAL细胞上层的生物标记。这表明粘膜炎性表型紧密相关的较低气道类群比系统性炎性表型。最重要的正相关性发生生物标记和分类群之间通常被认为是上呼吸道共生体,等普氏菌,韦永氏球菌属,罗思氏菌属和链球菌。帖子IFN-γ治疗,一组不同的类群生物标志物水平有显著相关性(补充图S2)。然而,类似于预处理相关性,大多数显著正相关性仍与上呼吸道的分类群特征。
然后我们使用compPLS占重复测量IFN-γ治疗后评估特定类群是否直接相关,在调整了固定效应和多重共线性,与生物标记分组内四个免疫档案:Th1、Th2, Th17或IPF。图3表明,上呼吸道类群呈正相关,与每一个不同的生物标记免疫档案都在地方层面(BALF和BAL细胞上清液)和系统性水平(等离子体)。例如,在落下帷幕,Porphyromonas口服共生体,IL-1β水平呈正相关,il - 6,两对Th17细胞因子重要分化和细胞因子TNF-βTh1通路的特点。Dialister另一个口头共生体呈正相关,il - 4水平,IL-9和il - 10,典型的Th2细胞因子,以及和TNF-β- 2细胞因子参与Th1-mediated炎症。其他细胞因子与先前IPF描述的重要角色,如MCP-1 IL-17, PDGF-AB-AA,也与类群中落下帷幕。例如,PDGF激活成纤维细胞在肺纤维化IL-17与TGF-β[23]。补充表S2显示了与这些预定义的免疫学相关类群的摘要概要(Th1、Th2 Th17和IPF)。最丰富的类群确定口服共生体,等普氏菌,Parvimonas,罗思氏菌属和Porphyromonas。综上所述,交互的数据支持口服共生体中降低气道与宿主的免疫反应。
讨论
我们的研究试图评估的影响吸入IFN-γ肺部微生物群,粘膜和系统性炎性表型的IPF患者。符合先前公布的数据,大部分的主题与IPF较低气道微生物群富含口腔微生物。重要的是,尽管IFN-γ没有显著改变下呼吸道微生物群,有相关性口腔微生物降低航空公司和炎性表型,本地和系统性。数据支持主机之间的紧密互动,降低气道IPF的微生物群。
IPF疾病肺损伤和异常的组织修复先天和适应性免疫发挥作用在纤维化的发展(20.]。Th1、Th2细胞因子的表达之间的平衡是一个重要的决定因素的疾病进展在肺纤维化的炎症阶段24]。Th1生物标记,如IFN-γ,可以改善肝纤维化的程度在博来霉素小鼠模型中,促进其考虑潜在的治疗这种疾病(25]。然而,Th2生物标记,如IL-5,也可以加强纤维化26]。在我们的研究中,IL-5水平减少BAL细胞一样浮在表面的一些炎性和pro-fibrotic生物标记,如IL-13 IL-17 PDGF-AA。有趣的是,PDGF是一个必需的元素在成纤维细胞的细胞分裂23]。激活的il - 6与纤维母细胞增殖有关。在我们的研究中,落下帷幕,上层清液il - 6水平治疗后下降了aerosolised IFN-γ。抑制il - 6与减少有关肺纤维化小鼠模型(27]。相比之下,没有IL-13水平显著降低,IL-17, PDGF-AA和il - 6在体循环从我们的主题。这些数据表明,吸入IFN-γ可以改变多种免疫学和组织修复途径降低气道粘膜。
与最近的进步文化无关的技术,降低气道的角色意识的加强微生物群在宿主的免疫反应在多个疾病(28]。在IPF,推测慢性下呼吸道微生物定殖的可能导致肺泡上皮损伤其余疾病进展(29日]。发挥作用的微生物一直怀疑反复性肺泡上皮损伤和异常的伤口愈合导致纤维化过程IPF的特征。因此,最近的研究已经开始看细菌病原体的潜在作用发展的纤维化肺病。之前比较BAL IPF患者样本与正常受试者相比,肺和慢性阻塞性肺疾病(COPD)显示,在IPF有细菌的增加负担下航空公司(7]。此外,有直接相关性较低气道细菌负担和肺功能的下降。在一个大型多中心试验,葡萄球菌和链球菌与发展有关的疾病在IPF (8]。在一个双盲随机安慰剂对照试验、复方磺胺甲恶唑是IPF患者每天两次的12个月里,从而改善生活质量得分和降低死亡率(29日]。在我们的研究中,降低气道微生物群的多样性的IPF患者治疗期间没有明显改变aerosolised IFN-γ。然而,分类组合下气道的微生物群与多个显著相关免疫途径可能发挥作用在IPF的肺实质损伤和修复过程。在健康的吸烟者,我们已经表明,较低的气道与常见类群微生物丰富上呼吸道与一个独特的免疫档案的特点是Th17表型和反应迟钝的toll样受体416]。我们也注意到,这种独特的肺部微生物(pneumotypeSPT“supraglottic主要类群”)与一个独特的基因组潜力和代谢组概要文件。符合我们之前的调查,我们在IPF表明,通常分类群特征为口服共生的存在于较低的航空公司和与预先确定免疫相关配置文件(Th1、Th2 Th17和IPF)。此外,最近的一项调查表明,中断降低呼吸道微生物群与主机转录组差异和纵向随访期间(这种联系仍然显著30.]。虽然致病的协会是超出了我们的研究范围,数据表明,肺部微生物群可能代表这种疾病的发病机制中的一个重要环境因素通过促进肺损伤,或改变受伤的肺组织的修复过程。这个协会的确切机制仍然需要阐明关注微生物代谢物和宿主的相互作用。有些早期的慢性阻塞性肺病的人,我们已经表明,微生物代谢是一个潜在的抗炎治疗目标(31日),提高的可能性,但也可能是一个潜在的治疗目标在IPF防止进一步的肺组织损伤。
有几个限制在我们的研究中。IPF队列,绝大多数的受试者与HRCT诊断,没有活组织检查。相反,在一个相似的临床,HRCT被发现有90%的组织病理学诊断的阳性预测值摘要(32]。虽然我们是病人至少80周,样本量很小只有10个病人了。然而,这是一个试点研究主要旨在评估治疗的可行性和安全性吸入IFN-γ需要两个支气管镜检查。很少有纵向研究评估下呼吸道微生物群,没有在IPF我们是知道的。未来的研究将需要一个更大的群体和非侵入性方法的使用评价降低呼吸道微生物群和生物标志物。此外,由于我们缺乏安慰剂对照组,观察到的微生物和生物标志物的变化进行解释时需要特别谨慎。抽样与支气管镜检查仅限于只有一个网站和空间变化(特别是IPF优先影响低肺实质)可以不追究33]。我们无法评估上呼吸道微生物群,因为我们没有与此同时收集口腔样本。因此,我们不能控制交叉污染和口腔分泌物。尽管污染微生物群与口咽可以发生在支气管镜检查,最近的数据表明,降低气道微生物调查的抽样文物相对较小(21,33- - - - - -35]。在这个调查中,我们利用非细胞BAL描述下呼吸道微生物群。因此,它是可能的,细胞相关的微生物是弱势36),进一步影响程度的背景浓缩由于低气道细菌负荷降低。此外,尽管我们在测序运行包括技术控制,落下帷幕前获得的样本抽样支气管镜的环境适应我们的协议控制,这也可能是重要的微生物生物量较低的研究样本(22,37]。
总之,吸入IFN-γ与小降低呼吸道微生物群的组成的变化。重要的是,多个微生物之间的相关性被发现和肺粘膜炎症和纤维化的生物标记。这些协会维护当考虑IFN-γ治疗multiomic模型。综上所述,这些数据表明,降低呼吸道微生物组是独立与宿主免疫相关的语气和因此可能会提供一个新颖的治疗目标IPF的治疗。
补充材料
披露的信息
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M.H.巴蒂尼00008 - 2017 _badri
r .公寓00008 - 2017 _condos
b·卡普尔00008 - 2017 _kapoor
Z.D.库尔茨00008 - 2017 _kurtz
m·莱斯科00008 - 2017 _lesko
L.N.西格尔00008 - 2017 _segal
g . Smaldone00008 - 2017 _smaldone
确认
作者的贡献:概念和设计:g . Smaldone r .公寓L.N.西格尔。收购数据:y . Li L.N.西格尔。分析和解释数据:j . Wang m·莱斯科M.H.巴蒂尼,卡普尔,吴人,y, r·邦Z.D.库尔茨,L.N.西格尔。起草或修订的文章:j . Wang m·莱斯科M.H.巴蒂尼,吴人,Z.D.库尔茨,r .公寓L.N.西格尔。手稿的最终批准:j . Wang m·莱斯科M.H.巴蒂尼,卡普尔,y, g . Smaldone Z.D.库尔茨,r .公寓L.N.西格尔。
脚注
可以从本文的补充材料openres.ersjournals.com
这项研究是在注册www.clinicaltrials.gov标识号NCT00563212。
支持声明:这项研究是由美国国立卫生研究院拨款K23 AI102970 (L.N. Segal)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
利益冲突:披露可以找到与这篇文章openres.ersjournals.com
- 收到了2017年1月18日。
- 接受2017年4月14日。
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