抽象的
流感病毒进入由其穗的受体结合结构域（RBD）介导的血凝素（HA）。禽类病毒对人类的适应与α2,6-而不是α2,3-连接的唾液酸（SA）受体相关的HA特异性。在此，我们通过降低α2,3-或增加α2,6-SA识别，定义流感亚型H5N1（禽）HA中的突变，其改变其对SA的特异性。RBD突变体用于发育疫苗和单克隆抗体，其中和新变体。基于结构的HA特异性的修饰可以指导在人适应的H5N1菌株的出现前可以评估的先发型疫苗和治疗单克隆抗体。
流感病毒对人类对人类的能力由几种病毒基因产品确定[评论（1）]。其中，病毒血凝素（HA）特别感兴趣;它与影响变速器的呼吸道中的特异性唾液酸（SA）受体结合（1-3.）。同时，它会影响对中和抗体的敏感性，免疫保护的主要决定因素（4.那5.）。HA内的受体结合结构域（RBD）由小于300氨基酸组成，位于病毒峰值顶部的外表面上（6.-10.）。SA绑定由由两个脊边界边界的腔介导（图。1A），由环220（氨基酸221至228），环130（氨基酸135至138）和氨基酸190至197的螺旋结构域（基于H3 A / AICHI / 2/68）形成（10.）。H1，H5和H3的结构已经先前描述（6.-10.），H1和H5 RBD与彼此相比表现出更大的结构和遗传相似性（图。1A）。
血凝素突变的结构和遗传基础。（一种）显示替代病毒血凝素的RBD。（B.[分别在紫色，薰衣草和绿色中的主要130和220环和190螺旋中的氨基酸序列和190螺旋中的氨基酸序列的比较。
为了定义改变受体识别的突变，我们最初关注H5和H1（A / South Carolina / 1/18）之间的差异，其识别α2,6-SA键，特别是氨基酸190,193和225（图。1B）。制备以产生假瘤的个体或组合突变，其中在某些位置处被氨基酸替换，由氨基酸的单字母代码描述（11.）例如，例如，在190（E190D）处取代谷氨酸的天冬氨酸。我们还使用先前提出的突变体来增加α2,6识别，Q226L，G228S（9.）。通过流式细胞术确认这些表面的表面表达（图S1a），并且在神经氨酸酶（Na）的COT转染后，产生假型的致脂素载体。进入293A肾上皮细胞，用荧光素酶报告者测量表达α2,3-和α2,6-SAS（图S1B）。E190D，K193S，G225D三重突变病毒显示出类似于野生型HA（图S1C）的条目，确认其功能完整;但是，不能使用该测定来定义受体特异性。
通过改性甘草微阵列方法分析了不同的SA特异性（12.）并通过重组的HA测定（13.）。对于Glycan阵列，已经用NA和纯化共表达（8.）。与野生型蛋白相比，E190D，K193S，G225D突变消除了大多数α2,3-连接底物的识别（图2，a与b）。重组的HA测定证实了三重突变体中α2,3-SA识别的损失，缺乏α2,6结合（表1A），也在Q226L，G228S中看到。分析先前描述的突变体（14.）也揭示了没有α2,6-SA的识别（表1B.）。最后，我们确定了增加α2,6-SA识别的突变（表1C.），特别是S137A，T192I变体，其改变了130环和190螺旋。在聚糖微阵列中证实了这种改变的特异性（表S1）。这些突变代表了HA可以适应其基材识别的替代方案;在上述实例中，它增加了人类适应的流感病毒的α2,6-SA结合虽然不相同。
Altered specificity of the triple-mutant H5 compared with wild-type KAN-1 H5 coexpressed with NA. Glycan microarray analysis of (A) wild-type or (B) triple-mutant HA purified after coexpression with NA was performed by a modification (18) of a previous technique (12) performed by Core H, Consortium for Functional Genomics, Emory University. Glycans with related linkages are grouped by color: selected glycoproteins (orange), predominantly α2,3-sialosides (yellow), α2,6-sialosides (green), α2,8 ligands (blue), or others (purple), as previously shown (table S3).
与野生型KAN-1 H5与Na共表达的野生型KAN-1 H5相比，改变了三突变体H5的特异性。glycan微阵列分析（一种）野生型或（B.）通过修饰进行使用Na的共表达后纯化的三重突变HA（18.）以前的技术（12.）由努利大学的核心H组成的Core H组进行。具有相关联键的聚糖通过颜色分组：选定的糖蛋白（橙色），主要是α2,3-唾液酸酯（黄色），α2,6-唾液酸苷（绿色），α2,8配体（蓝色），或其他（紫色），如前所述显示（表S3）。
甘草识别的特异性和野生型和突变体进入的疗效。来自泰国的H5突变体Kan-1，或VN1203和越南的VN1194，如方法（18.）。表明必须结合α2,3-和α2,6-SAS的能力由重新呈现的血血压测定法测定（18.） 为了 （一种）KAN-1突变体，失去α2,3公顷活动和相关对照，（B.）VN1203和先前描述的VN1194突变体（14.）， 和 （C）KAN-1突变体具有增加的α2,6-SA结合。如上所述测量野生型和突变体假型慢病毒载体的病毒进入（18.）。进入度如下：+，<25％的wt;++，25至50％的wt;+++，50至75％的wt;++++，> 75％的wt。H5（KAN-1）这里与Genbank序列相同，并且来自山田和同事的氨基酸186（N / K）不同（14.），VN1194突变体与N182K和Q192R相同（14.）根据另类编号惯例。
通过用野生型或三重突变病例接种小鼠和单克隆抗体（MAb）的小鼠接种小鼠分析具有改变的受体特异性的免疫原性和抗原性差异。每种MAb认可的突变体或野生型HA与Na具有差异特异性（图3A）。一种有效的H5特异性MAb，9E8，中和野生型H5，但对三重突变体伪病毒的活性显着降低（图3B.， 剩下）。相反，第二这样的单克隆，10D10中和两者在最大抑制浓度下等效，尽管在中间浓度下观察到较小的差异（图3B.， 中间）。用三突变体表达载体免疫后第三MAB，9B11分离，抑制了三重突变体但不影响野生型H5伪病毒（图3，B和C.， 正确的）。最后，尽管9E8更有效地中和野生型比S137A，T192I，另一种抗体11H12，但在两者上显示出相当的活性（图。3D），确认该突变体的差异抗原性。因此改变SA结合特异性改变的中和灵敏度并促进了引发有效中和mAb的疫苗的产生。
突变体H5N1伪病毒改变的中和敏感性。（一种）通过流式细胞术与用指定的mAb（蓝色）或同种型对照IgG（红色）确定与转染293T细胞中的Na共置于转染293t细胞中的粘附。（B.用指定的mAb评估中和敏感性。（C）显示所示的野生型和突变体的中和敏感性，其具有这些mAb（400ng / ml）（Nd，未完成）。（D.提出了野生型和S137a，T192i突变体的中和敏感性至mAb 9e8和11h12。
在本报告中，我们已经鉴定了禽H5血凝素中的突变，其改变其对SA受体的特异性，并且已经表明这种突变体可用于引发更有效地抑制这些变体的中和单克隆抗体。用前面显示的慢病毒进入测定测定中和灵敏度，以确定众多病毒的进入机制，包括艾滋病毒，严重急性呼吸道综合征（SARS），埃博拉和马尔堡出血病毒，最近，流感（15.-17.）。通过抗体抑制确定中和灵敏度（18.那19.）并与血凝集抑制相关，一种免疫保护标记物（表S2）（19.）。通过这种方法，检查了HA的特异性，独立于产生复制态病毒所需的分子适应，这使得允许鉴定几种具有改变的SA特异性的突变体。最近已经确定了其他突变体，其识别被评估为较少特异性的测定（14.），我们在这里发现他们在HA测定中没有获得α2,6-SA识别（表1B.;N186K，Q196R）。先前报道的Q226L，G228S突变体（9.）也显示没有α2,6-SA结合（表1A）。因此，由于S137A，这里，HA突变体是人类适应的，但这里的S137A，T192I可以表示该途径的步骤。
获取α2,6-SA特异性是否会增加H5N1传播性也仍然未知。最近，允许人类SA识别的1918病毒中的HA突变显示在雪貂中的传播（20.）支持该概念并提供一种评估此类H5突变体的模型。人适应H5特异性疫苗的理性设计方法促进了这种分析，以及含有流感爆发的先发型对策的发展。HA的五个主要抗原位点位于与RBD相邻的可接近的表面上（7.那21.那22.）。虽然该区域的抗体可以影响RBD特异性和中和灵敏度（7.那23.-26.），尚未显示出在RBD中的改变以改变免疫原性。这里，RBD特异性的基于结构的修饰促进了独立于主要抗原位点的mAb的产生。针对功能约束的域，它们可能更易于易于发展，并且用作可以在人类适应的菌株出现之前开发的疫苗原型。
