摘要
慢性阻塞性肺疾病(COPD)以慢性和进行性呼吸困难、咳嗽和痰为特征。t淋巴细胞可能在COPD和慢性支气管炎的发病机制中起关键作用。细胞毒性t淋巴细胞抗原(CTLA4是一个潜在的候选基因,因为它调节t细胞的激活。
9个基因之间的联系CTLA4国际慢性阻塞性肺病遗传网络(ICGN)对606家系(1896个个体)的单核苷酸多态性(SNPs)和慢性支气管炎进行了评估。然后,我们在挪威卑尔根的342名COPD患者和511名无慢性支气管炎的COPD患者中复制了相关性。使用基于家庭的关联检验分析ICGN队列,使用逻辑回归模型分析卑尔根队列。
六CTLA4在ICGN队列中,SNPs与慢性支气管炎显著相关(0.0079≤p≤0.0432),卑尔根队列中有3个SNPs具有相同的相关性(0.0325≤p≤0.0408)。其中一个复制的SNPs (rs231775)编码氨基酸17位的苏氨酸到Ala的替换。单倍型分析支持单SNP分析结果。
因此,CTLA4可能是慢性阻塞性肺病患者中慢性支气管炎的遗传决定因素。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是发达国家的主要死亡原因之一,其特点是进行性和不可逆的气流限制1.吸烟是慢性阻塞性肺病的主要环境风险因素,但只有少数吸烟的人会患上这种疾病2,3..双胞胎研究和家族聚集研究表明,遗传成分可能是COPD易感性的重要决定因素4- - - - - -8.波士顿早发型COPD研究家族的全基因组连锁分析显示,染色体2q上气流限制的连锁高峰显著9- - - - - -11..还证实了与染色体2Q相同区域的联系到一般人群百分点的气流限制12..
慢性气流限制是慢性阻塞性肺病的特征,它是由小气道疾病和肺气肿混合引起的,经常伴有慢性支气管炎1.t淋巴细胞的活化和增殖可能参与了COPD和慢性支气管炎的发病过程,t细胞的数量与肺泡破坏的程度和气流阻塞的严重程度相关13.- - - - - -16..激活naïve t细胞需要抗原和抗原提呈细胞上的共刺激分子B7-B7.1 (CD80)和B7.2 (CD86)的存在。t细胞上B7的受体是CD28。活化的t细胞表达一种额外的受体,即细胞毒性t淋巴细胞抗原(CTLA) 4,它以比CD28高得多的亲和力与B7结合17.并在下调t细胞活化中发挥重要作用18..CTLA4是由t细胞受体(TCR)/CD28刺激诱导的;它能抑制被激活的t细胞,从而使它们处于无力状态。滞留的t细胞离开淋巴结进入循环19..封锁CTLA4能增强t细胞反应并加剧自身免疫性疾病吗20.;CTLA4- 由于多器官淋巴细胞浸润和组织破坏,缺少小鼠的小鼠死亡3-4周17..CTLA4,位于染色体2q33,与包括哮喘在内的多种炎症性疾病有关21.,22..因此,CTLA4是COPD和/或慢性支气管炎的候选基因,因为它对抑制T细胞活化的临界作用。
作为CTLA4位于靠近染色体2q的区域,该区域在波士顿COPD早期发病研究中显示与COPD相关表型有显著联系9- - - - - -11.,以及一般人群系谱12.这是我们的假设CTLA4单核苷酸多态性(SNPs)可能与COPD和COPD相关表型有关,包括气流限制的严重程度和慢性支气管炎的存在。
方法
研究设计
本研究分为两阶段。首先,我们探讨了是否CTLA4在国际慢性阻塞性肺病遗传网络(ICGN)人群的一个子集中,SNPs与慢性阻塞性肺病和慢性阻塞性肺病相关表型相关,这是一个大队列的慢性阻塞性肺病先证者(n = 606)和兄弟姐妹(n = 1285),其方法细节已在其他地方描述23.- - - - - -25..其次,我们试图在卑尔根(挪威)招募的独立人群中复制我们的发现,包括COPD病例(n = 953)和对照组(n = 956),他们的特征也已被报道23.,25..
人口和评估
纳入慢性支气管炎表型分析的两个队列中受试者的临床特征见表1⇓.受试者招募和临床特征已在前面描述23.- - - - - -25..简而言之,第一个人口代表了多中心ICGN研究;招募具有已知COPD的受试者作为证据,通过证据确定兄弟姐妹和可用的父母。纳入标准的证据是气流限制(1 s中的支气管扩张剂强制呼气量(FEV1) <60%预测和FEV1/肺活量(VC) <90% pred),年龄较早(45-65岁),吸烟史≥5包年,至少有一个符合条件的兄弟姐妹(吸烟史≥5包年)。兄弟姐妹的COPD由支气管扩张剂后FEV确定1<80%pred和fev1/VC <90% pred(通常与全球慢性阻塞性肺疾病倡议(GOLD) II期或以上一致)。606个家系共1896个白种人个体进行了基因分型。慢性支气管炎定义为慢性咳嗽和产痰≥3个月·年−1在过去的2年里。在分析的ICGN受试者的1,193例COPD病例中,471例(39.5%)具有慢性支气管炎。
卑尔根招募的队列包括COPD病例和对照组;所有受试者均为吸烟史≥2.5包年的吸烟者或已戒烟者。如果支气管扩张剂后FEV被诊断为COPD1是否<80% pred与FEV1/强迫肺活量(FVC) <0.7。根据FEV选择对照1>80% pred和FEV1/ FVC > 0.7。共纳入953例COPD患者和956例对照组。953例COPD患者中,有慢性支气管炎342例(35.9%),无慢性支气管炎511例(53.6%)。
SNP的选择
的连锁不平衡(LD)标记CTLA4使用r进行SNP进行2SNP选择的0.8的阈值,在Haploview计划中使用成对方法选择26..这项SNP标记选择是基于欧洲裔美国人(具有北欧和西欧血统的美国居民,即来自犹他州的CEPH (Centre d’etude du Polymorphisme Humain)样本)的HapMap数据,该数据从公共数据库中获得少量等位基因频率>5%27..因此,九个SNPCTLA4地区选择。表2总结了这些SNP位点和特征⇓.
基因分型
采用基于Illumina阵列的定制SNP基因分型平台(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)对两个队列进行基因分型。采用SAS软件8.2版(SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)的拟合度检验,评估每个SNP对Hardy-Weinberg平衡的偏差;使用PBAT 3.5版本(Golden Helix Inc, Bozeman, MT, USA)对家庭数据中每个SNP的Hardy-Weinberg平衡也进行了检验。28..所有CTLA4 SNPs (p值>0.05)在家族和对照资料中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。使用PedCheck程序在家庭数据中评估孟德尔遗传29.,并且从分析中删除了某一特定SNP的系谱不一致的个体。
统计分析
在ICGN研究中,我们使用基于家庭的关联测验(FBAT) 1.7.3版本30.分析具有COPD和慢性支气管炎(定性表型)的单SNP关联。定量特征的分析(FEV1和FEV1采用PBAT 3.5版本(Golden Helix Inc, Bozeman, MT, USA),共变量包括吸烟中心、年龄、性别、身高和包年。28..我们使用添加剂遗传模型进行分析,以减少多种统计测试。添加剂模型相当于经典传播不平衡测试。风险等位基因由FBAT Z统计数据确定。来自关联分析的P <0.05的值被认为是名义上重大。我们估计使用SNP谱分解(SNPSPD)方法的九个SNP的独立SNP的数量31, 5个snp是独立的。因此,调整后的显著p值<0.01 (即。0.05/5)经多次测试校正后。对于ICGN家族,使用FBAT软件的HBAT命令和蒙特卡罗取样来推断和评估单倍型32.使用FBAT和HBAT分析了至少10个信息家庭。使用SNP滑动窗口方法(相邻的两组和三个SNP),确定了全局和单倍型特定关联统计的结果。分析中P <0.05的值被认为是标称显着水平。考虑到在我们的研究中评估了15个滑动窗口单倍型,调整后的显着的p值为0.0033(即。0.05/15)基于Bonferroni校正后的全局p值进行多次测试。考虑到COPD与FEV之间的高相关性1, FEV1/(F)VC和慢性支气管炎表型,为了避免过度保守,我们选择不纠正表型的多次检测。对于慢性支气管炎的数据,我们使用PBAT 3.5版本28.来估算能量。在显著性水平为0.05、外显率为0.7、0.4和0.1的条件下,本研究对SNP 1-9相关性的检测能力分别为97.32%、75.20%、97.51%、92.43%、97.23%、90.52%、97.23%、97.81%和96.67%。
在卑尔根队队列中,使用逻辑回归模型来研究关系CTLA4单核苷酸多态性与慢性阻塞性肺病和慢性支气管炎。使用SAS软件8.2进行分析,并采用可加性遗传模型。利用次要等位基因作为参考估计优势比。基于单倍型的分析使用期望最大化算法和在Haplo中实现的评分测试进行。统计软件33.由于我们使用Bergen病例对照队列复制了ICGN家族相关性分析的确认结果,因此我们没有对单单核苷酸多态性和单倍型相关性分析的多重检测进行校正。在卑尔根队列中,我们从基因组控制方法估计了膨胀因子λ34使用先前使用221个未链接的SNPS基因分型,并没有检测到人口分层的重要证据;基因组对照SNP的平均通胀因子为1.02723..
LD措施的可视化CTLA4使用HAPLOVIEW计划执行区域26..用Gabriel描述的置信区间方法定义单倍型块等等。35.
结果
个体SNP关联分析
我们评估了9个snpCTLA4地区;表2总结了这些snp的位置和特征⇑.我们没有检测到任何重要的遗传协会CTLA4ICGN或卑尔根慢性阻塞性肺病病例和对照中COPD存在/不存在的snp(表E1,在线补充材料)。此外,两者之间没有显著的关联CTLA4单核苷酸多态性和FEV1或FEV1/(F) ICGN家族或卑尔根COPD病例中的VC(数据未显示)。
相比之下,我们发现与其他COPD相关表型研究的显着关联,慢性支气管炎。在ICGN家庭中,六个中的六个CTLA4snp基因型(rs926169、rs11571316、rs231775、rs231779、rs3087243和rs231725)与慢性支气管炎表型显著相关(表3)⇓;0.0079≤p≤0.0432)。snp rs231775和rs3087243的相关性(p分别为0.0081和0.0079),即使经过多次检测的校正也很显著。
我们在六个中的四个中与卑尔根队队的COPD病例中的慢性支气管表型进行了重大关联CTLA4SNPS(RS11571316,RS231775,RS3087243和RS231725;0.0325≤p≤0.0408),在ICGN研究中确定(表3⇑).评估风险等位基因后(表3)⇑),我们发现三个重复显著的snp (rs231775, rs3087243和rs231725)在两个人群中具有相同的关联方向。
在卑尔根队列(数据未显示)中,我们没有发现与慢性支气管炎有任何显著关联CTLA4与COPD患者的慢性支气管炎相关。
LD块分析
图1⇓显示成对ld r2的9个snp的-值CTLA4地区。在ICGN研究中,我们发现了两个单倍型块。其中几个显著相关的SNPs (rs926169、rs11571316、rs231775和rs231777)位于block 1,另外三个显著相关的SNPs (rs231779、rs3087243和rs231725)位于block 2。在第1区,snp rs926169和rs231775之间存在很强的两两相关(r2= 0.85), SNPs rs16840252和rs231777之间(r2 = 0.86). In the Bergen cohort, the same two haplotype blocks were identified, with SNPs significantly associated with chronic bronchitis in each block.
单体型分析协会
最后,我们在两个队列中进行了相邻的二次和三个SNP单倍型分析,用于慢性支气管炎(表4⇓).在ICGN数据中,11个相邻的SNP组合显示出具有慢性支气管炎的显着关联(0.0029≤Lobalp值≤0.0457和0.0015≤特异性p值≤0.0286)。单倍型4-5(RS16840252-RS231775)和4-5-6(RS16840252-RS231775-RS231777777777777777777777777777)在多种测试的Bonferroni校正后保持显着。在卑尔根队的COPD病例中观察到类似的结果,其中我们发现九个单倍型显示与慢性支气管炎有显着关系(0.0282≤Lobalp值≤0.0481和0.0186≤特异性p值≤0.0385)。
讨论
我们的研究中最显著的发现是多个SNPs的重复关联CTLA4基因与COPD最典型的表型之一,即慢性支气管炎。这些结果表明CTLA4是COPD病例中慢性支气管炎的新遗传决定因素。
之前的学习
迄今为止,COPD最明确的遗传风险因素是严重α1抗胰蛋白酶缺乏症。许多以前的研究已经在与慢性阻塞性肺病相关的其他基因中发现了各种各样的遗传变异,但这些结果并不经常在其他队列中被复制。据我们所知,之前没有研究对此进行过调查CTLA4与copd相关表型的关系。我们的结果表明CTLA4与COPD病例中的慢性支气管炎有关。有趣的是,这CTLA4基因位于染色体2q附近区域,与copd相关表型连锁9- - - - - -12..值得注意的是,我们并没有发现CTLA4SNPs与COPD存在或通过FEV评估气流限制的严重程度1和FEV1/ FVC。
潜在的机制
t淋巴细胞在慢性阻塞性肺病和慢性支气管炎的发病机制中起着关键作用。CTLA4是控制t细胞激活的关键基因吗20..我们推测CTLA4基因多态性可能会损害细胞的调节功能CTLA4的抑制功能减弱CTLA4可以促进T细胞增殖和分化,从而导致气道炎症和慢性咳嗽和痰产生的症状,可分解慢性支气管炎20..这将与最近提出的对COPD发病机制中的异常获得的免疫反应的假设保持一致36并将得到以下记录结果的支持。CTLA4通过阻止被激活的t细胞来控制潜在的破坏性t细胞的扩张20..但是,这是这样的CTLA -同时刺激TCR/CD28和极化细胞因子IL -12和IL-4可释放介导的无能检查点,导致CD4+ t细胞分别向t辅助细胞(Th) 1型和2型分化20..COPD和慢性支气管炎患者Th1 CD4+细胞和细胞毒性T-cell-1 CD8+细胞增多13.,15.,16..这些细胞分泌干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子-α,激活巨噬细胞。活化的巨噬细胞分泌IL-12, IL-12反过来激活转录因子stat4.37.激活的数量增加了stat4.和干扰素-γ+在COPD患者的支气管活检和支气管肺泡灌洗液中,细胞的表达增加与肺功能下降相关37.如果stat4.肺中的信号克服了抑制作用CTLA438或者后者是基因缺陷,组织炎症和损伤可能会发生,包括慢性支气管炎在内的慢性阻塞性肺病可能会发展。有趣的是,与慢性支气管炎相关的一个SNPs (rs231775)是一个非同义编码多态性,导致17位氨基酸从Thr到Ala的变化。这种多态性存在于信号肽中,而在成熟蛋白中则不存在。它可能影响除切割外的翻译后修饰的效率,可能导致内质网加工效率低下,导致表面表达减少39.有几篇报道显示了这种多态性对t细胞功能的功能影响。毛雷尔等等。40检测了健康捐赠者的t细胞应答,在核苷酸位置49(氨基酸位置17)纯合子的A或G。他们发现G等位基因影响t细胞激活的CTLA4下调。此外,使用可溶性抗CTLA4单克隆抗体阻断CTLA4连接,在来自G/G表达个体的t细胞中的增殖效果不如来自A/A表达个体的t细胞。Sun也得出了类似的结果等等。41.所有这些研究表明了一致的结果,必须指出的是,我们用慢性支气管炎鉴定的关联与G等位基因有关。因此,这种多态性可能导致表达减少CTLA4,这可能导致慢性支气管炎的发展。然而,我们注意到,该变体也可以是具有这种变体的紧密LD中的联合基因分型变体的标记CTLA4基因。
我们研究的优势和局限性
我们的研究有几个优点和缺点值得评论。其中一个事实是,我们可以排除人口分层,因为基于家庭的关联分析,正如我们在ICGN研究中所做的,对人口分层是稳健的,而在我们的病例对照队列中使用的基因组控制方法没有检测到显著的人口分层。我们实验设计的第二个优势是,两个研究群体使用相同的问卷对慢性支气管炎进行了表型分析,从而减少了可能的表型异质性。第三,我们在独立人群中复制了在ICGN队列中发现的遗传关联,这种方法被认为是证明复杂疾病候选基因相关性的金标准42,43.最后,两个snp (rs231775和rs3087243)经多重比较保守校正后仍与慢性支气管炎显著相关,从而加强了我们观察的有效性。
相反,我们的研究有一个需要讨论的限制。我们没有找到重要的协会CTLA4具有COPD存在的SNP或FEV评估的气流限制程度1和FEV1/ FVC。可能导致COPD中气流阻塞的多种机制削弱了我们发现与COPD显著关联的能力;或者,也有可能CTLA4是慢性支气管炎的遗传决定因素,而不是气流阻塞。
总之,我们进行了遗传结合研究和鉴定的变体CTLA4与COPD病例中慢性支气管炎有关的基因,尽管没有直接与COPD。虽然确切的作用CTLA4在包括慢性支气管炎在内的慢性阻塞性肺病的发病机制尚待阐明,我们的发现为慢性阻塞性肺病的研究开辟了新的途径。
感兴趣的语句
G. Zhu,P. Bakke,H.Coxson,E.K.的兴趣陈述。Silverman和S.G. Pillai可以在www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
致谢
作者感谢家庭和案例控制收集的网站协调员的帮助;M. Hall,S. Hammond,R. Taylor,S.Alalouf和S.FlaxoSmithkline的Alalouf和S. Subramanian进行数据管理支持;T. Leonard,R. Vessey,D. Hay,M.Barnette,J. Snaxper和GlaxoSmithkline的W. Anderson有用的讨论。Ciber Enfermedades Respiritorias是Instituto de Salud Carlos III的倡议(Madisterio de Ciencia eInvenación,马德里,西班牙)。
ICGN的研究人员如下:P.M.A. Calverley (University of Liverpool, UK);C.F. Donner (S. Maugeri基金会肺病司,意大利维卢诺);R.D. Levy and P.D. Paré (University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada);B.J. Make(国家犹太医学和研究中心,丹佛,美国CO .);S.I. Rennard(内布拉斯加大学,美国东北奥马哈);J. Vestbo(丹麦哥本哈根Hvidovre医院心脏病和呼吸内科);和E.F.M. Wouters(荷兰马斯特里赫特大学医院)。
脚注
这篇文章有补充材料可从www.www.qdcxjkg.com
- 已收到2008年9月15日。
- 接受2009年4月7日。
- ©ERS期刊有限公司