文摘
本研究的目的是确定是否T列车辅助2列车类型细胞因子白介素(IL)的13和4参与应承担的粘液分泌过多,慢性支气管炎(CB)的标志。
手术标本检查来自33个受试者接受局部肺切除术的外围恶性肺部病变:21吸烟者与CB的症状,10无症状吸烟者()和两个非吸烟者与正常肺功能。IL 4和13应承担的数量正(+)细胞中央航空公司的量化。为了更好地评估细胞因子,计数也由IL 5 +和干扰素(IFN)γ+细胞。
CB组相比,有一个数量的增加IL 13 + 4 +应承担的细胞在支气管黏膜下层,而IL 5 +和干扰素γ+细胞相似的所有组。数量之间没有明显的关联被发现的细胞表达IL 13或检测4和炎症细胞的数量。双标签显示,12.9%和13.2的IL 13 +细胞也应承担的CD8 +、CD4 +,而7.5和5%的IL 4 +细胞CD4 +, CD8 +,分别。
总之,T地理辅助检测2和1蛋白表达存在于中央航空公司的吸烟者和白介素4和13可能导致慢性支气管炎的粘液分泌过多。
这项工作得到了MURST(大学和科学研究、意大利;60%、40%),ARCA (Associazione / la Ricerca e戴尔'Asma la的看台,帕多瓦,意大利)和Ferrararicerche(意大利费拉拉)。
慢性排痰性咳嗽是慢性支气管炎的临床特点(CB)1。粘液分泌过多的发展机制仍不清楚,尽管介质如中性粒细胞弹性蛋白酶、花生四烯酸代谢物,platelet-activating因素,macrophage-derived黏液促分泌素68和神经肽已被证明有痰增加产量的一个潜在的作用2- - - - - -6。最近,一个角色的T辅助(Th)应承担的2细胞因子白介素(IL)检测13和4发展的粘液分泌过多和allergen-induced杯状细胞化生也被提出7- - - - - -9。过敏性炎症的发展的关键细胞因子,IL 4和13应承担的研究主要是关于哮喘的发病机制10- - - - - -13在CB, sotheir作用,慢性阻塞性肺疾病(COPD)仍不清楚,即使他们表达seemsdifferent CB与哮喘14。主要区别是明显不同的细胞浸润中观察到两种疾病15确实存在,虽然相似之处16。
穆勒et al。17通过使用半定量评分来评估地理Th 1和2细胞因子的表达在支气管活检,曾发现一个增加表达IL 4 +细胞在患者的气道黏膜下层CB,相比与一群正常健康对照组17。最近,朱et al。18,报道强烈IL 4基因表达在支气管黏膜下腺体和subepithelium CB的吸烟者18。
当前最好的作者的知识,然而,一个精确的量化IL 4量表达细胞尚未开展主题与CB和航空公司的任何数据都可以在IL 13表达式在CB和慢性阻塞性肺病。
本研究的目的是量化的IL 13 +和高4 +细胞上皮黏膜下层和腺隔间的中央航空公司的吸烟者CB症状。为了更好地评估CB的细胞因子的表达Th检测2细胞因子IL 5和Th 1应承担的细胞因子的交互一些γ干扰素(IFN)也被量化。为了这个目的,手术标本检查来自33个受试者接受局部肺肺切除的病变:21吸烟者与CB的症状,10与正常肺功能和两个非吸烟者。
方法
主题
总共33接受肺切除术的患者局部外围恶性肺部病变进行了研究(表1⇓)。研究人口是由21个吸烟者与CB的症状,10与正常肺功能和两个非吸烟者。CB被定义为咳嗽和痰生产发生在本月大部分时间至少一年3个月,在2岁前研究1。固定的气流限制被定义为在一秒用力呼气量(FEV1)/用力肺活量(FVC) < 70%19吸入后,可逆性< 12% 200µg舒喘灵。没有一个病人有急性加重,正如前面定义的16在月前研究。所有受试者都免费的急性上呼吸道感染,没有收到糖皮质激素或抗生素在月前手术,或前48小时内支气管扩张剂。他们nonatopic,即。他们消极的皮测试常见的过敏原提取物包括树花粉、动物皮屑、模具、屋尘螨和存储螨(Lopharma、米兰、意大利),和没有过去的历史哮喘和过敏性鼻炎。
这项研究是根据宣言ofHelsinki和得到一个消息灵通的书面同意foreach手术。每个病人接受的采访中,胸片、心电图、血常规检查后,皮测试常见的过敏原提取物和肺功能测试在本周之前手术。
肺功能测试
肺功能测试包括测量基线FEV1和FVC各科检查及手术前一周内进行,如前所述16。
样品处理:组织学和免疫组织化学
从病人手术肺组织获得了有限的肺部病变。切除后,环支气管(大叶性或支气管)拍摄至少2厘米的肿瘤,然后被固定在4%甲醛在磷酸缓冲盐pH值7.2。脱水后,嵌入到石蜡。面向组织标本和5µm厚免疫组织化学分析串行部分被削减。
部分应用了多克隆抗体对人类IL 13日应承担的具体地理4和5,和干扰素γ(Peprotech EC,伦敦,英国;代码500 p13 500 p24 p25 500和500第9,分别)。消极的控制主要抗体被遗漏了。免疫反应性是评估通过streptavidin-biotin-complex /碱性磷酸酶方法使用快红作为衬底。短暂,部分水分,沉浸在柠檬酸缓冲5毫米,pH值6,在微波炉大功率孵化了10分钟。幻灯片是在正常孵化猪血清1:30 tris-buffered盐水(TBS) (X0901;斯特鲁普Dako有限公司、丹麦)。一夜之间,主要抗体(TBS 1:10 0)被应用在4°C。部分是孵化与生物素化的30分钟猪antirabbit免疫球蛋白G抗体(E431;Dako有限公司),随后streptavidin-biotin复杂的共轭碱性磷酸酶(Strept AB复杂/美联社,K0391; Dako Ltd) for 30 min. Immunoreactivity was visualised with fast red (K699; Dako Ltd). Sections were counterstained with haematoxylin and mounted in Glycergel (C563; Dako Ltd).
串行部分应用了地理反CD68 + (M814;Dako有限公司),检测CD4 + (M834;Dako有限公司)和公/ CD8 + T细胞(M7103;Dako)小鼠单克隆抗体分别使用碱性phosphatase-antialkaline磷酸酶的方法,如前所述16。
确定炎症细胞的表型表达IL 13和4免疫反应性,应承担的双重使用免疫组织化学技术。短暂,内源性过氧化物酶活性被孵化的部分0.3%的H2O2在甲醇为30分钟。幻灯片在微波治疗和孵化Dako蛋白质块(X0909;Dako有限公司)为30分钟。一夜之间,部分被孵化的主要抗体(多克隆抗体抗检测IL 13或者反检测IL 4和适当的单克隆CD4 +和CD8 +细胞)。确定了细胞因子免疫反应性(如前所述),而CD4 +和CD8 +细胞免疫反应性是由孵化幻灯片与设想,结合辣根过氧化物酶(想象合K4000;Dako有限公司),并通过开发0.5 mg·毫升−1diaminobenzidine。消极的控制过程,分析重复省略一个或两个主要抗体。
量化
Light-microscopic分析进行编码与蔡司显微镜幻灯片(从蔡司,德国)的放大500×。13 + IL−的数量,或−−5 + 4 +,或干扰素−γ+细胞和CD68的数量+,CD4+确定或−CD8 + T细胞在该地区100年µm上皮基底膜下(如定义为平方目镜格)不重叠的领域包括腺体,平滑肌和扰乱地区,直到所有可用的区域覆盖。量化了盲人。结果表示为每毫米的阳性细胞数2支气管黏膜下层。
光显微镜分析支气管腺体的上皮细胞进行的奥林巴斯BX41显微镜(奥林巴斯光学有限公司,德国汉堡)连接到一个录像机与计算机图像分析系统(−Pro +形象;银泉媒体控制论,Inc .,美国)的放大400×。支气管腺体包括整个腺,腺泡组成+间质腺泡之间。所有可用的腺面积测量和结果表示为IL−13 +每毫米或−4 +细胞2腺,如前所述20.。完好无损的长度nonmetaplastic支气管上皮基底膜下测量和结果表示为IL或−−13 + 4 +细胞浸润每毫米上皮基底膜。
数据为双染色IL−13 / CD8 + IL−13 / CD4 + IL−4 / CD8 +和IL−4 / CD4 +总数的百分数表示double-stained细胞染色阳性细胞CD8 +、CD4 +,或每个细胞因子的区域躺100µm上皮基底膜下的放大600×21。
统计分析
组数据被表示为平均数±标准差或中位数(四分位范围)通常和非正态分布数据,分别。组之间的差异进行了分析使用未配对t测试临床数据和曼必经Whitney U形态数据的测试。这两个不吸烟者是不包括在统计分析。斯皮尔曼等级相关测试用于检查细胞因子和炎症细胞之间的联系。概率p < 0.05的值被认为是重要的。至少有三个复制测量进行随机选择10日由同一观察者幻灯片和intra-observer再现性与变异系数进行评估。intra-observer系数变化范围9 - 14%的细胞因子和炎症细胞检查6 - 14%。
结果
临床研究结果
表1⇑显示了学科研究的特点。吸烟者的两组类似的关于年龄和吸烟史(pack-yrs)。这两个不吸烟者也在同一年龄组。CB受试者更长的吸烟史(48±10岁)比(37±11岁)(p < 0.05)。十九吸烟者被包括在内,四组的群CB和15,而12 exsmokers包括六个科目中,六个CB。CB受试者基线FEV明显降低1%预测和FEV1/ FVC % (p < 0.05)值,如表1所示⇑。与固定气流限制,吸烟者支气管扩张剂的平均响应是4.5%。
免疫组织化学结果
IL 13 +和公/ 4 +细胞位于支气管黏膜下层,在腺腺泡上皮细胞,细胞内免疫反应性。此外,IL 13 + 4 +应承担应承担的疣状也位于一些支气管腺的腺泡,在一些支气管血管的内皮,偶尔,支气管平滑肌。IL 4应承担的免疫反应性也发现在某些基底或者支气管上皮细胞纤毛而IL 13免疫反应性是很少在上皮细胞的细胞结构。
量化的IL 13 +和公/ 4 +细胞在支气管黏膜下层满意地进行了所有的科目。量化的IL 4 +应承担的支气管上皮细胞不能进行课题2和量化的IL 13 +细胞在上皮和腺体不能执行主体28因为破坏上皮和支气管腺体的稀缺性(不到5微观领域)。
低数量的IL 13 +和公/ 4 +细胞被发现在支气管黏膜下层(14.0(7.4 - -20.7)和12.8(9.5 - -16.1),分别),腺上皮的不吸烟者(表2⇓)。
IL 13 +和公/ 4 +细胞在CB相比增加(56.8 (42.8 - -111.2)与36.9(24.5 - -48.6)和83.0 (55.3 - -123.2)与分别为46.5 (25 - 73);p < 0.05)(图。1⇓和图2⇓)。没有观察到显著差异在IL 4和13之间的上皮细胞表达吸烟者与CB(表2⇑)。支气管腺体有一个趋势增加IL 13和4表达与CB吸烟者,相比(表2⇑,图3⇓)。
双标签是用于识别和计算IL 4 / CD8 + IL高13 / CD8 + IL 4 / CD4 +和IL 13 / CD4 +细胞double-labelled应承担的礼物。大约有13%的IL 13 +细胞也应承担的CD8 +、CD4 +,而7%的IL 4 +细胞CD8 +和5%也CD4 +细胞。此外,没有地理协会之间的相关性被发现IL 13 + 4 +应承担的细胞和CD68 +, CD4 +和CD8 +的两组。之间也没有联系发现IL 13 +和4 +细胞和肺容积。
中央气道黏膜下层,量化的IL 5 +细胞是令人满意的所有受试者除了主题2,而在大多数的科目很少干扰素γ+细胞被观察到。低数量的IL 5 +和一个缺乏干扰素γ+细胞被发现在不吸烟者支气管黏膜下层(5.9(0.0 - -11.8)和0.0(0.0 - -0.0),分别)。没有观察到显著差异在IL 5和干扰素γ表达式之间的支气管黏膜下层CB和(图。1⇑)。同样,没有明显差异的数量CD68 +, CD4 +和CD8 +细胞两组(表3所示⇓)。
讨论
本研究的主要发现是地理的证据IL 13和4免疫反应性在中央航空公司的吸烟者。本文提供的实验表明,IL 13 +和应承担的数量还是4 +细胞增加支气管黏膜下层的吸烟者与CB相比。干扰素γ和IL 5应承担的免疫反应性也存在,但这些细胞因子的蛋白表达在吸烟者与CB和类似的。最好的当前作者的所知,这是第一个研究评估,定量方法,细胞的数量表达Th量2和1细胞因子在中央航空公司的吸烟者与CB的症状。此前的一项研究,表明增加IL 4 +细胞在气道黏膜下层等科目与CB与健康不吸烟者使用半定量的分数相比,支持目前的发现17。目前的结果还证实朱和扩展的结果et al。18展示了一个增加IL 4信使核糖核酸与CB表达吸烟者支气管黏膜下层的。
这项研究表明Th的潜在作用的2细胞因子在CB。平行增加这一事实的表达IL 13和4观察是一致的与这两种细胞因子的假设有许多重叠的生物活性由于共同的受体亚基,所需的IL 4 rα链,应承担的信号转导22。除了他们的角色在过敏性炎症10- - - - - -13,IL 13和4在CB似乎也有关。垫片et al。7发现,在大鼠、气管内的管理IL 13诱导粘蛋白基因表达和杯状细胞化生。此外,IL 13应承担的转换从一个吸收人类支气管上皮细胞分泌表型和增加了部分分泌细胞的主要文化人类鼻上皮细胞23,24。最近,它已经表明,CD4 + T细胞只能刺激粘液生产应承担的通过一个共同的地理IL 13高介导的通路,而IL 13行为不能通过中间炎症细胞但在肺结构细胞,可能的气道上皮细胞本身25。影响气道粘液的分泌IL 4已被证明在动物模型8。滴剂的细胞因子在小鼠呼吸道导致粘蛋白基因表达和杯状细胞化生。杯状细胞化生也发生在IL 4应承担的转基因老鼠的特点是IL 4在航空公司应承担的具体表达式9。
当前作者推测,增加蛋白表达的IL 13和4可以扮演一个角色在应承担的粘液分泌过多的吸烟者与CB的症状。一旦炎症细胞释放细胞因子,后者可以在几个方面导致粘液分泌过多。IL 13应承担可能间接地通过激活表皮生长因子受体的级联7。根据这一假说,歌手et al。26最近表明,老鼠,粒细胞减少抑制粘液积累诱导,IL 13日暗示支持这些细胞的作用在中介的影响IL 13应承担的粘液。粘液分泌过多据信结果,至少部分,从炎症。科恩et al。27表明,IL 4应承担对Th至关重要的2细胞招聘的肺和诱导的炎症,但没有直接参与生产粘液。粘液生产可以诱导,Th的2细胞缺乏地理IL 4和5的情况下,嗜酸性粒细胞,肥大细胞,但不是没有IL 4 rα信号27,28。惠塔克的数据et al。25显示,一些细胞因子,包括地理IL 4,高5 9和10,应承担的炎症细胞,包括肥大细胞和嗜酸性粒细胞,激活粘液和粘蛋白基因muc5ac表达通过增加分泌IL 13。这些影响提出了依赖于地理IL 4 rα表达结构肺细胞,可能那些气道上皮的表达IL 4 rα应承担和IL 13 rα129日。其他的研究表明,IL 4应承担直接调节离子运输在人类支气管上皮细胞30.。
当前作者预测,IL 4和13应承担可能发挥作用在吸烟者与CB粘液分泌过多,但没能找到差异在地理IL 4和13两组腺体和上皮细胞的免疫反应性。然而,这可能会发生在不增加IL 4 +和列车13 +细胞的上皮和腺体支气管炎的被观察到。免疫组织化学给航空公司产生的介质的照片,但这并不证明调解人的作用机制。此外,IL 4和13应承担可能直接或间接地在thelung结构细胞,可能在气道上皮细胞本身,theabsence增加这些细胞因子接近结构参与粘液分泌并不奇怪。支气管黏膜下层的介质的释放可能扩散和直接作用于结构参与粘液分泌不能排除在外。也有可能细胞表达IL 4和13的上皮和腺体能在生理条件下发挥监管作用,然而,在病理情况下,炎症细胞的存在,可以表达这些细胞因子ismore明显支气管黏膜下层,这可以改变环境的航空公司,间接促进粘液分泌过多。最后,各种炎症介质已被证明刺激粘液分泌和IL 4和13可能只有两个。
最丰富的来源IL 13和4应承担的CD4 + Th量2,CD8 + T细胞毒性淋巴细胞(c) 2,和IL 13肺泡巨噬细胞也表达了31日,32。在目前的研究已经证明,double-labelling技术,地理IL 13和4 co-localised与CD8 +, CD4 + T细胞表型,但double-labelled细胞的百分比低表明除了CD8 +及CD4 +细胞表型产生IL 13和4 CB。其他的候选细胞IL 13应承担包括巨噬细胞的起源32肥大细胞,还可以分泌IL 4,应承担的树突状细胞和B细胞31日,33,34。在这项研究中,作者未能发现重大地理IL 13和4蛋白表达之间的相关性和CD8 +数字的支气管黏膜下层的支气管炎。与CB吸烟者,朱et al。18发现了类似的结果,他们还证明了CD8 +细胞在支气管黏膜下层没有表达IL 4基因。与CD8 +细胞,之间没有相关性被发现IL 13和4表达和CD4 +和CD68 +细胞的数量。缺乏相关的一个可能的解释是一个混合的人口炎症细胞有助于释放他们的航空公司。另外,数量有限的科目检查可以解释缺乏关联。
总之,T列车辅助检测2(4和5)应承担的地理白细胞介素13日和T辅助检测1(干扰素γ应承担)蛋白表达存在于中央航空公司的吸烟者。吸烟与慢性支气管炎的症状有一个数量的增加白介素13和4应承担的高表达细胞在支气管黏膜下层暗示一个潜在作用的T辅助检测2细胞因子在粘液分泌过多,慢性支气管炎的临床特点。在众多机制产生粘液,地理白介素13介导途径似乎是重要的。未来的研究将有助于确定抑制白介素13块或应承担的调节在慢性支气管炎粘液生产。
确认
作者想感谢m . Padovan专家协作,g . Fulgeri打字手稿和f .麻省理工forediting手稿。
- 收到了2002年5月30日。
- 接受2003年6月6日。
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