文摘
在目前的研究中,树突状细胞(dc)的假说,关键球员在免疫和宽容,可能参与了免疫病理的特发性肺动脉高压(IPAH)进行了测试。
通过免疫组织化学方法特征的表型和本地化DCs和肺样本中double-labelling免疫荧光法控制,人类IPAH病人和一个实验性肺动脉高压模型(monocrotaline-exposed老鼠)。
形态学分析与控制,展示了更多的树突特异性细胞间粘附molecule-grabbing nonintegrin (DC-SIGN)阳性细胞在肌肉肺动脉IPAH积极和牛- 62 DCs monocrotaline-induced肺动脉高压。在人类样本均值±扫描电镜DC-SIGN-positive细胞数量·动脉−1100 - 300年在控制μm直径为1.4±0.4与在IPAH 26.4±2.7。在老鼠、牛- 62阳性细胞的数量·动脉−150 - 150年控制μm直径为0.5±0.2,0.7±0.5,3.1±0.5,8.4±0.6在第七天,分别野百合碱接触后14和28。人类复杂的肌肉病变肺动脉显示透壁的直流渗透。表型出现了一个不成熟的DC在人类和实验性肺动脉高压。
结果支持这一概念,未成熟树突状细胞积聚在改建肺血管,因此可能参与了肺动脉高压的免疫病理反应。
在肺动脉高血压炎症机制发挥作用(多环芳烃)1。事实上,严重的多环芳烃可能复杂的系统性炎症条件下,与糖皮质激素和免疫抑制剂治疗可以改善患者的多环芳烃结缔组织疾病,如系统性红斑狼疮2,3。此外,致病性自身抗体靶向内皮细胞能诱导血管内皮细胞凋亡,可能启动PAH的发展4,5。的一个子集特发性肺动脉高压(IPAH)病人已被证明有循环自身抗体(抗核,antiendothelial和antifibroblast抗体)6,7以及循环水平升高的促炎细胞因子白介素1 (IL)和IL - 6的分泌8。病人肺组织学显示严重IPAH经常显示炎性细胞浸润的巨噬细胞和淋巴细胞的丛状的病灶与当地趋化因子的表达等咆哮(激活规范,正常t细胞表达和分泌)和fractalkine9,10。实验数据从monocrotaline-induced肺动脉高压大鼠进一步支持肺血管炎症和重塑之间的联系。
在不同通路相关的炎症过程,树突状细胞(dc)的作用已经越来越认可,不仅是简单的抗原递呈细胞负责启动炎症反应,但是,尤其是作为整个过程的一个关键调制器,从而提高它的重要性在许多人类疾病,包括过敏11、自身免疫12、肿瘤免疫学13和同种异体移植物排斥反应14。许多数据明显表明肺DCs至少参与整个光谱的高流行的发病机制呼吸条件下,对其中的一些(如哮喘),DCs已被证明在疾病的发展至关重要15。在老鼠身上,肺DCs已被证明是细胞在哮喘的发病机制的关键16从动物模型有间接证据,肺DCs可能导致吸烟者慢性阻塞性肺疾病的发展17。此外,在结节病肺DCs的数量增加18和扩散panbronchiolitis19。dc分化成其他细胞表型的能力,包括内皮细胞20.,扩大他们的潜在作用在血管疾病。在目前的研究中,人类和实验数据支持的介入DCs肺动脉高压是首次报道。
方法
主题和样品处理
人类多环芳烃肺标本得到8个病人肺移植的时候显示严重IPAH。右心衰catheterisation证明pre-capillary严重肺动脉高压在所有情况下。期间执行控制肺标本由八个肺活检手术pneumothoraces或者距离局部肺损伤。控制没有肺血管疾病的证据。多环芳烃和控制肺部被注入膨胀ornithyl氨基甲酰转移酶复合(10月;VWR国际,西切斯特,PA,美国)在PBS稀释(1:5)注入到主支气管或针保护肺形态学的实质。从肺外围收集标本进行组织学,然后snap-frozeniso戊烷在干冰和储存在-80°C,直到进一步的分析是必需的。所有患者和控制研究是法国的一部分网络在肺动脉高压,一个项目机构伦理委员会批准,并书面知情同意。
动物模型
成年雄性Wistar鼠(8 - 10周大)安乐死的过量戊巴比妥钠7、14和28天后一皮下注射生理盐水(n = 10)或60 mg·公斤−1野百合碱(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国;n = 30)。肺的控件(盐)和10月monocrotaline-exposed老鼠被注入膨胀:PBS(1:1)进入气管,然后snap-frozen。Monocrotaline-exposed老鼠显示严重肺动脉高压在28天,而温和的血液动力学的和组织学改变发生在14天。Saline-exposed老鼠和老鼠评估后7天野百合碱接触正常肺血液动力学的价值观和肺血管组织学。动物实验管理委员会批准的动物保健中心de Chirurgie Experimentale玛丽Lannelongue, Le Plessis-Robinson法国。
免疫组织化学
免疫组织化学进行7-μm部分冻结的肺部组织。常规准备和过氧化物酶抑制后,人类样本处理以下抗体:树突特异性单克隆抗体细胞间粘附molecule-grabbing nonintegrin (DC-SIGN;Pharmingen克隆DCN46;美国圣地亚哥BD Pharmingen CA), CD1a (Pharmingen克隆HI149;Pharmingen)和CD83 (Immunotech克隆HB15A;加拿大Immunotech,米西索加)在PBS稀释含1%小牛血清胎儿和5%人类AB血清。老鼠DCs沾了单克隆抗体anti-CD103 (Pharmingen克隆牛- 62;Pharmingen)在PBS稀释含2%正常大鼠血清。在4°C隔夜孵化后,人类肺部分与生物素化的标签anti-mouse免疫球蛋白和peroxidase-labelled链霉亲和素(美国Biogenex,圣拉蒙,CA)。鼠牛- 62标签与标签显示streptavidin-biotin (LSAB) 2工具包用于鼠标本(Dako A / S,斯特鲁普、丹麦)。 Staining was completed after incubation with substrate-chromogen (3-amino-9-ethylcarbazole) solution (Dako A/S). Slides were counterstained with Mayer′s hematoxylin (Réactifs RAL, Martillac, France) and mounted with aqueous medium (Glycergel; Dako A/S). Controls used for these antibodies included omission of the primary antibody and substitution of the primary antibody by isotype control. Positive control for CD1a and CD83 was obtained by staining hilar lymph nodes of explanted lungs (data not shown).
Immunofluorescent标签
双重免疫荧光,反人类的DC-SIGN (Pharmingen克隆DCN46;Pharmingen)和牛- 62 (Pharmingen)抗体被生物素化的标签anti-mouse免疫球蛋白和链霉亲和素(Biogenex或Dako A / S),和AlexaFluor 594或488共轭(分子探针,佩斯利,英国)1 h。一夜之间组织随后被孵化与异硫氰酸荧光素共轭,anti-smooth肌肉α-actin(西格玛奥德里奇克隆1 a4,西格玛奥德里奇),反人类的CD68 (Dako克隆KP1, Dako A / S), anti-rat RTIB (HMC二类Serotec克隆OX6;Serotec,牛津大学,英国),rhodamine-conjugated波形蛋白(圣克鲁斯sc - 6260,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国),或Alexa萤石488共轭anti-rat CD68 (Serotec克隆ED1;Serotec)和anti-rat CD4 (Serotec克隆W3/25;Serotec)。幻灯片与Vectashield安装安装介质(向量实验室,伯林盖姆、钙、美国)。
细胞免疫组织化学量化
细胞免疫组织化学进行了量化使用尼康80我显微镜形态学分析软件NSI的元素(尼康、东京、日本)。肺动脉DCs的平均数计算通过计算DC-SIGN (DCs)或牛- 62(鼠DCs)表达细胞三个每个样本的幻灯片。量化,肺肌动脉横断面直径100 - 300或50 - 150μm对于人类和老鼠的肺,分别考虑。
统计分析
所有的值表示为±扫描电镜。在人类样本,统计显著性评估双尾未配对t检验比较控制和多环芳烃组。使用重复测量方差分析和费舍尔预计至少显著差异(PLSD)发布测试进行鼠结果(4组:控制、7天、14和28野百合碱暴露之后)。一个假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
检测树突状细胞在肺动脉IPAH病人
在所有人类肺样本IPAH病人,DC-SIGN-expressing DCs呈现网络组织的外膜结缔组织中肺血管(图1所示⇓)。影响到PAH的肺血管显示直流渗透到外膜和内侧层。透壁的浸润DCs经常被观察到的丛状的病变。的形态学分析显示数量的大幅增加DC-SIGN-positive肌肉细胞肺动脉:DC-SIGN-positive细胞·动脉的平均数量−1100 - 300年在控制μm直径为1.4±0.4与在IPAH 26.4±2.7 (p < 0.001,双尾未配对t检验;图2⇓)。免疫组织化学显示,这些细胞被CD1a CD83-negative,对应于不成熟的DCs(数据未显示)。Immunofluorescent双标签和CD68α-actin和波形蛋白排除可能的交叉反应巨噬细胞和成纤维细胞(图1所示⇓)。控制肺动脉肺显示分散外膜直流染色。一个较小的程度上,DC-SIGN-positive细胞在支气管旁发现肺实质,小叶的隔膜和肺胸膜肺IPAH病人和控制。DC-SIGN-positive细胞中没有小静脉或毛细血管。
从实验检测树突状细胞在肺动脉肺高血压
DCs的招聘monocrotaline-induced肺动脉高压Wistar鼠(图3中进行了研究⇓)。DCs CD103克隆牛- 62检测到的,这已被证明是一个老鼠DCs的重要标志21。增加数量的DCs首次观察到的野百合碱接触后14日内。通过28天野百合碱注射后,肺动脉高血压大鼠有明显招聘牛- 62积极DCs的外膜层肌肉肺动脉,以及血管壁的肺静脉(图2所示⇓)。牛- 62阳性细胞的平均数量·动脉−150 - 150年控制μm直径为0.5±0.2,0.7±0.5,3.1±0.5,8.4±0.6在第七天,分别野百合碱接触后14和28 (p < 0.001,方差分析;图2⇓)。DC数量随着肺动脉内侧改造的程度增加,低控制船只。免疫荧光double-labelling显示一个不成熟的招募了DCs的模式:CD4-negative;牛- 62阳性;CD68-negative;主要主要组织相容性复合体类II-negative表型(图3所示⇓)。牛- 62积极分散DCs在场bronchial-associated淋巴组织,以及支气管壁的PAH老鼠和控制。
讨论
本研究报告的第一个证据,DCs可能导致人类和实验性肺动脉高压的免疫病理反应。人类和实验的结果表明,肺动脉高压,不成熟的DCs积聚在改建肺血管,因此可能参与肺血管病变的发展。目前的研究表明,动脉DCs的意思是数字增加在monocrotaline-exposed老鼠血管病变的发展。动脉直流积累先于肺动脉增厚和血液动力学的改变,不断地出现在改建船只,表明直流涌入不仅仅是增加肺动脉压力的结果。功能测试直流招聘,如在活的有机体内迁移在动物模型中,本研究尚未进行。因此,直流累积损伤的肺动脉高压的招聘的结果,也可能是当地的扩散,降低了射流从肺血管壁甚至分化转移浸润的巨噬细胞。
炎症过程的作用在多环芳烃的自然历史以来一直讨论炎性浸润周围改建船舶在人类PAH描述了几个调查人员。此外,血液和细胞因子的表达水平增加,肺实质和影响肺动脉被描述。多环芳烃在结缔组织疾病发病率的增加,在某些形式,其成功治疗免疫抑制治疗,支持炎症通路的概念发展和调制的疾病。因此,更好的理解之间的关系的炎症和肺血管重塑是主要的重要性。
炎症机制和DCs可以扮演一个角色在人类PAH发展的早期阶段,作为证明monocrotaline-induced肺动脉高压大鼠炎症模型。人类所有的多环芳烃在本研究样本来自IPAH患者解除痛苦。本研究设计被选为了避免相关炎症条件可以遇到在多环芳烃与结缔组织疾病,自身免疫性甲状腺炎或艾滋病毒感染。目标是面对夸张炎症动物模型的肺动脉高压(monocrotaline-induced肺动脉高压)“纯”IPAH和描述常见的炎症机制。事实上,这样的机制尚未在人类IPAH良好定义的。
之前的研究已经证实,人类肺DCs缺乏CD83表达式22,对应于不成熟的dc23。CD1a,特有的细胞表面分子存在于表皮和血液在肺血管周的DCs DCs一直缺席22。CD1a是偶尔出现在支气管上皮细胞(数据未显示),经Demedts等。24。这个观察到缺乏成熟dc可能解释的事实后,处理外国/自我抗原,DCs随后迁移到淋巴组织,成熟。在这里,DCs发起抗原t细胞的激活。因此,鼠肺DCs提出不成熟CD4-negative牛- 62阳性表型25。纤维细胞组成一个族群的循环单核细胞单核细胞/巨噬细胞CD68-positive血统,可以表现出纤维母细胞性质的组织损伤(α-actin和波形蛋白生产,分化成myofibroblasts)26,27,参与动脉重塑表明,发生在低氧诱导多环芳烃在动物模型26。当前作者检查,由immunofluorescent double-labelling,人类DC-SIGN——和鼠牛- 62阳性细胞不表达波形蛋白或α-actin fibrocytic标记。因此,可以得出结论,一个直流族群不同于成纤维细胞和纤维细胞谱系在人类和老鼠改建肺动脉积累。
在不同血统的炎症细胞,DCs与血管疾病。系统性动脉,vascular-associated DCs人口积聚在动脉血液动力学的主要应力下的区域通过湍流条件下28。有趣的是,肺动脉的分支点改变流条件是倾向于人类PAH丛状病变的发展29日。值得注意的是,当前作者观察到由DCs透壁的浸润在丛状病变最常观察到。与此同时,血液动力学的变化,发生氧化应激在多环芳烃可以充当DC-attracting“危险信号”。事实上,它已经表明,氧化应激的标记内皮和内侧层经常出现在多环芳烃的肺动脉30.。
DC-SIGN c型凝集素是表面高度表达了不成熟的dc31日和已被证明允许monocyte-derived DCs承认各种各样的微生物包括病毒、寄生虫和细菌32。DC-SIGN还可以绑定幼稚t细胞和内皮细胞表面粘附分子表明其参与t细胞激活和直流贩卖31日。值得注意的是最近发现突出的一个子集的参与DCs在肿瘤血管生成,通过接受endothelial-like分化体外和组装neovasculature在活的有机体内20.。
新的治疗策略可能目标肺动脉重塑和PAH的炎症组件。Schermulyet al。33有报道,血小板源生长因子受体拮抗剂STI571(甲磺酸伊马替尼)逆转肺血管重塑在两个不同的肺动脉高压的动物模型,包括monocrotaline-exposed老鼠。此外,初步报告提供证据支持伊马替尼作为一个人类IPAH antiremodelling剂严重34- - - - - -36。尽管伊马替尼的疗效在实验和人类PAH应该依赖在体外证明抗增殖、antimigratory pro-apototic对肺动脉平滑肌细胞的影响33最近的出版物突出DC-modulatory伊马替尼的影响在体外和在活的有机体内37- - - - - -40。事实上,Mohtyet al。39表明疾病应对伊马替尼在慢性髓系白血病(CML)患者伴随有恢复的血浆DCs功能在活的有机体内。这些研究结果提供的证据表明,伊马替尼能够恢复一些DC-related CML的免疫功能。此外,史密斯40州伊马替尼可以激活一个名为“产生杀手”DCs的细胞类型,认为DCs和自然杀伤细胞的特征。此外,最近的一份报告表明,伊马替尼激活产生杀手DCs在癌症的小鼠模型,解释了这种药物的治疗效果在某些胃肠道间质肿瘤耐抗增殖效果41。IPAH因此,伊马替尼效应可能与至少部分的直流调制函数。
总之,树突状细胞的免疫病理的可能贡献人类和实验性肺动脉高压的主要兴趣。不成熟的树突特异性细胞间粘附的进一步表现型molecule-grabbing nonintegrin-positive子集在人类肺动脉高血压的肺应该帮助更好地描述树突状细胞在肺动脉高血压。可能未成熟树突状细胞参与的炎症性肺动脉高压的动物模型将帮助分析特定的治疗干预措施的影响调节这些细胞的作用在活的有机体内。最后,评估相声不成熟的树突细胞和内皮细胞和平滑肌细胞之间应该评估在活的有机体内和在体外。这些数据将允许更好地理解免疫细胞之间的联系,在肺动脉高压异常血管生成和肺动脉重塑。
树突特异性细胞间粘附molecule-grabbing nonintegrin (DC-SIGN)阳性树突状细胞(dc))周围的动脉外膜正常肺动脉和b和c)坐落在一个复杂病变的肺肺动脉高血压(PAH)。d) DC-SIGN-positive细胞(红色)是不同于巨噬细胞CD68-positive人口(绿色)。e) DCs(红色)没有与α-actin colocalised阳性细胞(绿色),不包括可能与平滑肌细胞和/或myofibroblasts交叉反应。f) DCs(绿色)没有表达波形蛋白(红色),与成纤维细胞的间叶细胞标记,消除任何混乱/ fibrocytic元素可以参与纤维化PAH病变。比例尺条= 100μm,除了b),酒吧= 200μm规模。
量化的树突细胞在人类和大鼠肺动脉。)在特发性肺动脉高压(IPAH)患者,增加树突数量的特异性细胞间粘附molecule-grabbing nonintegrin (DC-SIGN)阳性细胞在肺动脉直径100 - 300μm观察。b) Monocrotaline-exposed老鼠表现出显著增加牛- 62阳性细胞的平均数量在50 - 150μm肺动脉直径、与时间相关的时尚。#双尾未配对t检验,p < 0.001;¶:p < 0.001,方差分析。
牛- 62积极老鼠发现了树突状细胞(dc)只有一个),此外肺淋巴组织的控制,而b)呈现一个网络组织影响动脉的动脉外膜monocrotaline-exposed老鼠。招募牛积极DCs - 62(红色)是不同于c)内侧平滑肌细胞(绿色),并从d)巨噬细胞的数量(绿色),e)大鼠单核细胞的/淋巴细胞细胞和直流cd4阳性子集(绿色)。牛f) - 62(红色)和主要组织相容性复合体II级(绿色)偶尔coexpressed(黄色染色),突出不同成熟阶段或不同直流的亚种。a)条= 200μm规模,b)条= 100μm规模,氟)= 25μm规模酒吧。
脚注
社论评论见435页。
目前发表的观点反映了作者(年代)和欧洲共同体绝不承担任何可能的使用信息包含在其中。
- 收到了2006年7月19日。
- 接受2006年11月13日。
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