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研究文章血管生物学免费获取|10.1172 / JCI24838
内科、Justus-Liebig-University吉森吉森,德国。
通信地址:拉尔夫•Schermuly Medizinische Klinik, Klinikstrasse 36岁,35392年吉森,德国。电话:49-641-994-2420;传真:49-641-994-2419;电子邮件:ralph.schermuly@innere.med.uni-giessen.de。
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2005年10月3日出版更多信息
肺动脉高压的发展增加肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移。PDGF是一个强大的有丝分裂原,参与这一过程。我们现在报告,PDGF受体拮抗剂STI571(伊马替尼)逆转先进的肺血管疾病2肺动脉高压的动物模型。与monocrotaline-induced肺动脉高压大鼠,治疗与日常管理STI571开始后28天感应的疾病。2周治疗导致100%存活,相比之下,只有50%在sham-treated老鼠。房车压力的变化,不断通过遥测和右心肥厚逆转基本正常。STI571阻止PDGF受体磷酸化,抑制激活下游信号通路。类似的结果在慢性缺氧小鼠,治疗后与STI571肺动脉高压的完整建立。此外,PDGF受体的表达在肺组织被发现显著增加肺动脉高血压患者与健康供者的肺部组织。我们得出这样的结论:STI571逆转血管重建和肺心病严重肺动脉高压实验不管启动刺激。 This regimen offers a unique novel approach for antiremodeling therapy in progressed pulmonary hypertension.
特发性肺动脉高压(IPAH)是一种危及生命的疾病,其特征是显著的和持续的肺动脉压力。这种疾病导致房车衰竭和死亡(1)。目前的治疗方法治疗慢性肺动脉高压的主要提供症状缓解,以及一些改善预后。尽管假设所有治疗,证据直接抗增殖的影响大多数方法丢失(2- - - - - -4)。此外,目前大多数应用代理的使用是受不受欢迎的副作用或不方便药品管理局路线。在高血压肺动脉病变包括内皮损伤、血管smc增殖,hypercontraction (5)。
一些生长因子已经与smc的异常增殖和迁移,包括PDGF基本FGF (bFGF)和表皮生长因子(6- - - - - -10)。体外研究证实PDGF作为强有力的有丝分裂原,smc化学引诱物(10)。活跃PDGF是建立由多肽(A和B链),形成人类——或者形成和刺激α和β细胞表面受体(11)。最近,2额外PDGF基因识别,编码PDGF-C和PDGF-D多肽(12- - - - - -14)。PDGF受体(pdgfr)属于一个家族的跨膜受体酪氨酸激酶(rtk),应该是由二价PDGF配体结合在一起。这个复杂的二聚的受体和PDGF RTK和导致的自身磷酸化激酶活性的增加。
这两种受体激活的主要信号转导通路,包括Ras / MAPK PI3K和磷脂酶Cγ(11,15,16)。最近,upregulation PDGFRα和PDGFRβ羊羔所示了慢性宫内肺动脉高压(9)。肺a或PDGF-B mRNA,然而,肺动脉高血压和控制动物之间没有什么差别。从严重肺动脉高血压患者肺活检(PAH), a链表达显著增加(17)。
STI571(伊马替尼或格列卫)旨在针对磷酸腺苷的酪氨酸激酶的激酶的抑制剂bcr - abl;干细胞因子的受体,c - kit;和PDGFR IC50值的范围0.1μM (18)。目前,这种物质被批准用于治疗慢性粒细胞白血病(CML) (19恶性胃肠间质瘤()和进展20.)。根据我们目前的假说,改变PDGF信号也可能在多环芳烃的过程中发挥重要作用。因此,我们调查了STI571对血流动力学和肺血管重建的影响在一个既定的实验性肺动脉高压模型。此外,下游对细胞和分子水平的影响进行了分析,提供机械的解释STI571-induced变化。
STI571对血流动力学和气体交换的影响。老鼠被质疑野百合碱(MCT)开发严重肺动脉高压在28天,这是持续直到42天(如果动物存活)。因此,房车收缩压(RVSP)显著增加而saline-challenged组(图1A)。STI571被日常应用ip注射从28天到42和逆转慢性肺动脉高压基本正常50毫克/公斤/ d组(图1,A和B)。遥测RVSP测量表明,严重肺动脉高压成立后28天,STI571近规范化肺动脉压力的剂量50毫克/公斤/天(图1B)。平均系统性动脉压力没有任何治疗组(图的变化1C)。与对照组相比(36.0±1.4毫升/分钟/ 100克体重),心脏指数下降的MCT组28天(28.0±2.4毫升/分钟/ 100克体重)和42(26.0±2.7毫升/分钟每体重100克;P< 0.05)。STI571-treated动物(50毫克/公斤/天)、心脏指数明显增加,而虚假的治疗(37.6±5.4毫升/分钟100克体重;P< 0.05)(图1D)。也观察到类似的结果对于动脉氧合,减少在MCT-challenged动物和显著增加在治疗剂量的STI571 10到50毫克/公斤/天(图1E)。
STI571治疗对血液动力学的影响和气体交换MCT和低氧诱导肺动脉高压。(一个)RVSP(毫米汞柱)在不同的治疗组。(B)的影响STI571在MCT-induced RVSP的肺动脉高压测量遥测。MCT(南)应用于天0为导管植入术后动物已经从手术中恢复过来。肺动脉高压逐步发展到28天。STI571被日常应用ip注射的剂量50毫克/公斤/天从28天到42。此外,系统性动脉压(SAP;在毫米汞柱)(C)、心脏指数(CI);毫升/分钟/ 100克体重)(D)和氧合指数(PaO2/ FiO2)(E不同的实验组,每组)给出。STI571应用剂量的1 10到50毫克/公斤/天。(F)RVSP(毫米汞柱)在慢性缺氧小鼠的不同治疗组。STI571应用剂量的50和100毫克/公斤/天填喂法从21到35天。*P< 0.05和控制;__P< 0.05与MCT在28天或缺氧在21天;‡P< 0.05与MCT在35天42或缺氧。
在长期缺氧小鼠,严重肺动脉高压发达的21天内,以显著增加RVSP与常氧动物(图1F)。RVSP进一步增加到35天,近规范化ST571 100毫克/公斤/ d组。
STI571对右心肥大的影响和动物的生存。MCT组,一个重要的房车肥大开发为肺动脉压力增加的结果。房车重量LV +隔重量的比值(RV / LV + S)从0.30±0.02(控制)增加到0.71±0.03 (MCT挑战后28天)和0.78±0.07 (MCT挑战后42天)(P< 0.05和控制)。STI571导致剂量依赖性降低这一比率0.71±0.03(1毫克/公斤/天),0.62±0.03(10毫克/公斤/天;P< 0.05与MCT), 0.42±0.03(50毫克/公斤/天;P< 0.05与MCT)(图2一个)。
STI571对右心肥大和生存的影响。房车比LV +隔重量(RV / LV + S) (一个)和存活率STI571-treated和sham-treated (MCT控制;满圆)动物(B)所示。治疗剂量的1、10、50毫克/公斤/天开始在MCT注射后28天;不同剂量表示。(C)RV /慢性缺氧小鼠LV + S值。STI571应用剂量的50和100毫克/公斤/天从天21-35填喂法。*P< 0.05和控制;__P< 0.05与MCT在28天或缺氧在21天;‡P< 0.05与MCT在35天42或缺氧。
未经处理的MCT组存活率在42天降低到50%(图20动物幸存下来的(10)2B)。STI571治疗提高了生存率65%(20)13 1毫克/公斤天组,83.3% 18(15)10毫克/公斤/ d组和100%(18 18)在50毫克/公斤/ d组。
RV / LV + S比缺氧小鼠从0.25±0.02(控制)增加到0.38±0.02(21天的缺氧)和0.43±0.02(35天缺氧)(两种P< 0.05和控制)(图2C)。在100毫克/公斤/天治疗组,这个比例下降到0.30±0.03 (P< 0.01和缺氧)。
Antiremodeling效力的STI571肺脉管系统。我们定量评估的程度的muscularization肺动脉直径25至50μm。在控制,大多数血管的直径通常是nonmuscularized,作为模范地在图所示3a . MCT-injected动物在28天,42天,大幅降低nonmuscularized肺动脉发生(图4),相应增加完全muscularized肺动脉(数字3B和4与STI571)。治疗50毫克/公斤/天导致显著减少完全muscularized动脉与MCT组和增加的百分比nonmuscularized肺动脉(数字3C和4),内侧壁厚的肺动脉直径25 - 50μm MCT组明显增加,在28天(28.74%±0.33%;P< 0.05和控制)和天42 (36.83%±0.54%;P< 0.05和控制),与对照组相比(18.59%±0.42%)(图3、D-F和图4B)。与MCT组相比,STI571 50毫克/公斤/天显著逆转内侧壁厚的增加到22.66%±0.23% (P< 0.05与MCT)。
STI571对muscularization程度的影响(一个- - - - - -C),内侧的小肺动脉壁厚(D- - - - - -F),PDGF-B表达式(G- - - - - -我)。一个,D,G:天0。B,E,H:42天。C,F,我:42天50毫克/公斤/ d STI571对待。(一个- - - - - -C)muscularization程度证明了血管性血友病(棕色)和α-smooth肌肉肌动蛋白(紫色)染色鉴定内皮血管smc,分别。(D- - - - - -F在肺动脉内侧壁厚的变化。(G- - - - - -我)PDGF-B染色是在内侧层小肺动脉。酒吧规模:20μm。箭头指示肺动脉。
影响STI571 muscularization的程度;内侧的肺动脉壁厚大小25 - 50μm, 51 - 100μm,大于100μm;和内部腔肺动脉面积大小25 - 50μm。(一个)非(N)的比例,部分(P),或完全(M) muscularized肺动脉,肺动脉截面总数的百分比(25 - 50μm大小)。总共有60 - 80在每个肺intraacinar船只进行了分析。(B- - - - - -D)内侧的肺动脉壁厚大小25 - 50μm (B);51 - 100μm (C);和大于100μm (D)。(E)血管的内部腔面积25至50μm。结果大鼠暴露于特定28和42天STI571-treated老鼠(治疗28天到42 50毫克/公斤/天)。(F)的非比例、部分或完全muscularized肺动脉从长期缺氧小鼠接受STI571(大小20 - 70μm)。STI571应用的剂量100毫克/公斤/天填喂法从21到35天。*P< 0.05和控制;__P< 0.05与MCT在28天或缺氧在21天;‡P< 0.05与MCT在35天42或缺氧。
内侧壁厚之间的肺动脉大小的51和100年μm和100多名μm直径分别确定。在这两个类别,STI571近规范化内侧壁厚值(图4C和D)。腔区(微米2)肺动脉直径25 - 50μm从1220年μm下降2到1075年μm2MCT 28天组和791μm2这项历时42天的MCT组(图4E)。治疗STI571 50毫克/公斤/天导致内部腔面积(1195μm正常化2;P< 0.05与MCT)。
在缺氧动物,在21到35天,nonmuscularized肺动脉发生明显降低,同时增加完全muscularized肺动脉(图4F)。治疗100毫克/公斤/天STI571导致显著减少部分muscularized动脉相比与缺氧组(21天,即。STI571治疗开始之前,和35天)和显著增加的百分比nonmuscularized肺动脉。
STI571对MMP活性的影响。MMP-2和MMP-9蛋白质的水平明显增加MCT-challenged老鼠的肺匀浆相比,控制。增加(图被STI571规范化治疗5)。Zymographic MMP的测量显示高度提升活动MCT-challenged动物,最突出的影响观察MMP-2(图5B)。MMP-2以及活动的蛋白质含量在STI571-treated规范化动物(50毫克/公斤/天)。
MMP的表达(一个)和密度测量量化(B在肺动脉。检查肺组织匀浆的MCT-challenged动物接受STI571 50毫克/公斤/天,而控制和参与其特定的动物。西方墨迹的职业和活动形式的MMP-2和MMP-9 (一个)和密度测量量化规范化GAPDH (B)所示。*P< 0.05和控制;__P< 0.05与MCT在42天。
STI571 PDGF-B和PDGFR表达和磷酸化的影响。PDGF-B MCT-treated动物,显著增加蛋白质检测(通过免疫组织化学)在肺小动脉内侧层,而控制肺部完全负面的(图3,G和H)与MCT-challenged老鼠相比,STI571-treated动物显示低PDGF-B表达式在肺血管(图3我)。PDGFRβ蛋白质及其磷酸化(激活)形式在MCT-challenged老鼠(图高度调节6(图)和老鼠7)。类似的结果ERK1/2磷酸化的老鼠(图8)。相比之下,表达和磷酸化PDGFR和ERK1/2受到强烈抑制治疗50毫克/公斤/天STI571老鼠(数字6和8)和PDGFR的磷酸化是减少缺氧小鼠接受100毫克/公斤/天STI571(图7)。
增加PDGFRβ表达式/磷酸化MCT-induced肺动脉高压。免疫印迹分析用于评估表达式PDGFRβ和PDGFRβ磷酸化(P-PDGFRβ)在大鼠肺从控制和动物对待MCT(14天),MCT(28天),MCT(42天),和MCT(42天)/ STI571。免疫印迹的代表4个人从每组肺,显示相同的结果。量化PDGFRβ和PDGFRβ磷酸化酒吧图表所示。PDGFRβGAPDH和PDGFRβ磷酸化规范化。*P< 0.05和控制;__P< 0.05与MCT在28天;‡P< 0.05与MCT在42天。
增加PDGFRβ表达式/磷酸化在低氧诱导的肺动脉高压。免疫印迹分析用于评估表达式PDGFRβPDGFRβ磷酸化的鼠标控制和动物的肺缺氧处理(35天)和缺氧(35天)/ STI571。免疫印迹的代表4个人从每组肺,显示相同的结果。量化PDGFRβ和PDGFRβ磷酸化酒吧图表所示。PDGFRβGAPDH和PDGFRβ磷酸化规范化。
增加PDGFRβ信号(ERK1/2磷酸化)MCT-induced肺动脉高压。免疫印迹分析用于评估表达ERK1/2磷酸化(P-ERK1/2)在大鼠肺从控制和动物对待MCT(14天),MCT(28天),MCT(42天),和MCT(42天)/ STI571。免疫印迹的代表4个人从每组肺,显示相同的结果。量化ERK1/2磷酸化的条形图所示。ERK1/2磷酸化ERK1规范化。
表达PDGFRβPAH患者的肺。免疫印迹分析显示显著增加PDGFRβ蛋白表达及其磷酸化(激活)形式相比,IPAH肺健康供体肺(图9)。
PDGFRβPAH的肺的表达的变化。表达PDGFRβ肺匀浆中PAH患者(n= 4)和健康的捐赠者(n= 4)和密度测量信号强度的量化。免疫印迹分析anti-PDGFRβ抗体。特定的抗体识别蛋白质的分子量∼185 kDa。量化PDGFRβ条形图所示。
STI571抑制肺SMC增殖体外。大鼠肺动脉SMC (PA-SMC)增殖,诱导了10%的边后卫/ DMEM,抑制了STI571剂量依赖性的方式(0.1、1和5μM),由(3H]胸腺嘧啶核苷掺入试验(图10A)。此外,STI571 PA-SMCs的细胞凋亡增加10%血清的存在剂量依赖性的方式(图10B)。为了确定STI571的选择性PDGF-induced SMC增殖,不同生长因子(PDGF-AA PDGF-BB, igf - 1、EGF或bFGF)被用来刺激大鼠肺SMC。STI571添加到培养基在1μM 2小时前的每个生长因子。STI571表现出显著的抑制PDGF-AA PDGF-BB-induced扩散,同时,相比之下,igf - 1增殖刺激,EGF,或者bFGF(图的影响10C)。
STI571对serum-induced扩散的影响([3H]胸腺嘧啶核苷掺入)(一个),细胞凋亡(B)和PDGF-AA、PDGF-BB, igf - 1、EGF -或bFGF-induced扩散(C老鼠smc)在肺。STI571剂量依赖性抑制肺动脉鼠smc增殖刺激的边后卫DMEM / 10%。相比之下,值控制细胞保持在0.1%的边后卫。值表示为每分钟计数/毫克蛋白或百分比/字段来自6 - 8单独隔离。*P< 0.05和控制;__P< 0.05和血清(10%)或不同的生长因子。
STI571 PA-SMC增殖和凋亡的影响。在MCT-challenged老鼠,增殖细胞核抗原(PCNA)标签显示,远端肺动脉smc增殖与控制(图11)。在平行于血管形态、正常化PCNA-positive细胞的数量大大减少在动物STI571处理。几乎没有检测到凋亡TUNEL检测控制和MCT-challenged动物的肺阻力血管。然而,细胞发生细胞凋亡的数量大幅增加在STI571肺动脉血管壁组织(图11B)。
STI571对老鼠PA-SMC扩散的影响(一个和细胞凋亡B在MCT-induced肺动脉高压)。内侧肥大的肺阻力血管增加增殖MCT-induced肺动脉高压血管细胞的数量。PCNA免疫组织化学(红细胞核PCNA-positive细胞;一个)显示增加扩散MCT-challenged动物(如与控制)。回归的内侧肥大引起STI571(50毫克/公斤/天)归因于降低SMC增殖。细胞凋亡(由原位TUNEL分析评估)没有控制动物和非常低的肺动脉MCT动物在不同的时间点。细胞凋亡(绿色TUNEL-positive细胞;B)增加动物STI571处理。酒吧规模:100μm。箭头表示PCNA和TUNEL阳性细胞一个和B,分别。
这部小说本研究的发现是PDGFR拮抗剂STI571 2是一种有效的治疗的严重肺动脉高压的实验模型。治疗效果显示剂量依赖和包括(a)逆转肺动脉高压、右心肥大和(b)减少心输出量,改善肺血管增殖(c)逆转,(d)一个令人印象深刻的生存受益MCT老鼠。此外,PDGF信号的重要性在肺动脉高压的过程中被显著抑制证明PDGF-associated STI571信号通路。
最近,提出了新的治疗方法治疗慢性肺动脉高压患者的影响。这些包括内皮素受体拮抗剂(4),nonparenteral前列腺素类(21)和磷酸二酯酶5抑制剂(22- - - - - -25)。然而,所有这些方法解决肺血管舒张的主要治疗目标;虽然假设,证明(实验或临床),这些药物有直接的抗增殖效果甚至力量扭转增生性肺循环的变化。
PDGFR signaling-related细胞增殖已经被认为是一个重要的贡献者的开发和进展肺动脉高压(9,17,26,27)。最近发表的一项研究调查了截断的影响可溶性PDGFRβhyperoxia-induced血管发展的变化,发现降低SMC增殖(28)。此外,Balasubramaniam等人阻止了肺动脉高压的发展在绵羊的胎儿雇佣一个适配子,选择性地抑制PDGF-B (9)。然而,到目前为止,没有描述可用的治疗介入的数据使用的特定PDGFR拮抗剂STI571在实验或临床肺动脉高压。在我们目前的研究中,我们发现了一个最突出的逆转STI571治疗肺动脉高压的反应。治疗并不影响系统性动脉压,证明这种方法的选择性异常肺循环和提供证据的缺乏血管扩张性效果引人注目。病人患有严重的肺动脉高压,改编自心输出量不足代表正常的体育活动的主要限制。此外,不足增加系统性动脉压条件下的运动是一个消极的预测严重的多环芳烃(患者的生存29日)。在晚期右心负荷,系统性动脉压力已经减少了在休息的时候。因此,影响全身血压的药物,如非选择性血管舒张药——尽管在一定程度上降低肺动脉压力,引发不良的全身性低血压。在本临床相关方面的观点,抗增殖剂如STI571,完全缺乏急性vasodilative潜力,代表我们相信一个完全新颖的方法治疗慢性血管疾病。
由于右心负荷,减少肌肉心脏肥大是剂量依赖性的方式恢复到接近正常水平MCT-treated老鼠和慢性缺氧小鼠。结合改进的生存,这些数据是强烈提示PDGFR抑制严重肺动脉高压的治疗潜力无论启动事件。虽然治疗功效也被证明在一定程度上对丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂(30.)、辛伐他汀(31日),fasudil (Rho-kinase抑制剂)(32)或磷酸二酯酶抑制剂(33,34),总体治疗效果(包括血液动力学、右心肥厚,血管重建,和生存,目前提出了)还没有被证明。
STI571治疗,非完全muscularized船只的比例大幅增加在MCT -和低氧诱导肺动脉高压。结构性变化观察到MCT-induced肺动脉高压强烈类似于人类的特点多环芳烃的(a)内侧壁增厚,(b)内膜的增殖,和(c)丛状病变形成,导致巨大的阻力损失船容量(35)。因此,血液动力学和重塑正确的心脏长期影响动物在疾病的晚期模仿的情况中发现患者(36,37)。此外,缺氧诱导的肺动脉高压的主要刺激伴随慢性通气的疾病如慢性阻塞性肺疾病和间质性肺病。而急性缺氧导致选择性肺小动脉的血管收缩、慢性暴露于低氧导致肺血管床(形态和功能变化24,25,38,39)。缺氧可能也是PDGF-related通路的激活,正如前面所示HT1080细胞(40)。
在当前的研究中,我们发现在细胞增殖显著增加(PCNA染色评估)在肺阻力血管MCT-challenged动物。有趣的是,相当多的细胞凋亡被发现无论是在控制动物还是在那些MCT-induced肺动脉高压。然而,STI571治疗导致附近正常血管形态、增殖率下降,而且,最有趣的是,在血管壁细胞凋亡率增加。这也符合之前发现STI571的抗增殖特性被归因于hypercholesterolemic兔子balloon-injured血管细胞凋亡率增加(41)。在这种背景下,PDGF是细胞凋亡的有效抑制剂,从而促进扩散在多个组织(42,43)主要是通过PI3K / Akt通路(44,45)。因此,抑制扩散的STI571部分可以解释为凋亡的抑制PDGF信号的属性。此外,最近的报告显示c-ABL-dependent和独立STI571通过激活诱导细胞凋亡的还存在(46,47)。
增加MMP的表达和活动已被证明与疾病的严重程度在不同的实验形式的肺动脉高压(33,34,38)。MMP-9 ERK引起的强烈活动,已知参与PDGFR激活下游信号(48)。此外,在体外研究提供的证据直接金属蛋白酶- 1和MMP-3感应a (49)和PDGF-B (50),分别。此外,降低MMP-2水平相似之处血流动力学和结构变化的有效治疗(34)。目前发现STI571强烈降低MMP-2 MMP-9表达式和活动因此符合该代理的有益作用在MCT-induced结构和血流动力学变化。
直接证据的PDGFR信号通路参与MCT-induced肺动脉高压的发展和治疗效果的STI571源自以下结果:(a) PDGFRβ表达强烈的调节在MCT-challenged鼠肺——这也符合之前的数据表明,PDGFRβmRNA在MCT-treated大鼠的肺动脉显著增加(9,27);(b)增加表达与STI571逆转治疗,并行的有利影响血流动力学,形态、和生存;(c) PDGFRβ磷酸化在MCT-challenged增加动物,但减少响应STI571治疗;和(d)诱导PDGFR的下游信号通路被激活单独(MCT)表示,抑制ERK1/2 (MCT加上STI571)。ERK磷酸化已被证明是一个关键的下游信号PDGFR刺激(51,52),其强大的压制下STI571支持这个代理的概念是通过PDGFR手术系统(图12)。众所周知,除了PDGFR STI571也阻止ABL酪氨酸激酶和c - kit相同的集成电路50100纳米的价值观。BCL-ABL转换是专门为CML描述,不良性的肺疾病中发挥作用。很少被人所知的角色c-kit-positive骨骨髓来源造血干细胞在肺疾病。如果,一个报告显示这些细胞的一些有益的潜力存在于肺损伤模型(53)。因此,与这个途径是高度不太可能参与当前描述研究。因此,STI571最有可能的PDGF-inhibitory能力主要作用方式参与有益的治疗效果在两种多环芳烃模型。进一步证明PDGFR STI571是选择性的从细胞培养实验获得不同的生长因子(PDGF-AA PDGF-BB, igf - 1、EGF和bFGF)被用来刺激肺动脉SMC增长。以前类似的结果显示增生大鼠冠状动脉smc证明一个临床试验性PDGFR拮抗剂的不适用(本金保证产品57148 b)选择性地阻止PDGF-AA -或PDGF-BB-induced扩散(54)。
示意图说明拟议的信号事件MCT -或低氧诱导的肺动脉高压和STI571的影响。疾病机理归纳提出的这个方案描述了MCT或缺氧和可能的交互的STI571涉及信号事件。诱导路径和/或细胞事件是由黑色的箭头象征(实线表明证明证据;虚线表示的假设机制)。绿色线条和箭头表示STI571的行为在这个模型。
此外,我们相信,PDGFR upregulation连续和激活的信号通路(PDGFR磷酸化/ ERK)代表一个愈演愈烈的恶性循环,而不管的主要诱导物(MCT或缺氧),通过船舶损失强度和剪切应力的增加会进一步的肺血管重建。众所周知,剪应力PDGF和PDGFR表达的强烈刺激血管细胞(27,55,56)。一旦被STI571 PDGFR的下游信号从而血管重建是逆转(见我们的实验),这种恶性循环中断,PDGFR连续下调。
我们的研究是第一个我们的知识描述的成功治疗用途PDGFR抑制剂STI571 2广为接受的肺动脉高压的动物模型。我们不仅证明STI571治疗逆转血流动力学和结构变化引发MCT但也令人印象深刻的改善MCT鼠模型大鼠的生存。此外,证据PDGFR系统在疾病发展的参与和对治疗的反应提供了在细胞和分子水平。考虑到实验研究的局限性,我们仍然相信我们的发现这本小说将刺激考虑治疗方法的病人患有危及生命的先进的肺动脉高压,PDGFRβ可能强烈调节,发现当前所显示PAH患者调查。因为STI571已经广泛用作抗癌药物和在这些迹象证明是耐受性良好,临床发展作为一种新的治疗肺动脉高压可能会因此迫在眉睫。
实验设计。成年男性Sprague-Dawley老鼠(300 - 350克体重;查尔斯河实验室)被随机分配治疗后28天内注入生理盐水或60毫克/公斤MCT (Sigma-Aldrich)诱导肺动脉高压。除了一群未经处理的大鼠,实验小组包括老鼠收到每日一次腹腔注射STI571(伊马替尼;来自美国的礼物Pascoe和大肠Buchdunger、诺华诺华Horsham研究中心、英国霍舍姆)的剂量50毫克/公斤或政府车辆(等渗盐水)。老鼠14天的治疗后检查(42天)。STI571是一种低分子量蛋白质酪氨酸激酶活性的抑制剂PDGFR亚型(57,58)。STI571被选为目标的PDGF信号MCT-induced血管疾病,和剂量计算是基于已发表的研究(59)。
缺氧性肺血管重建被暴露诱导小鼠(8-week-old C57BL / 6)慢性缺氧(10%啊2)在一个通风室,如前面描述的(39)。STI571的慢性影响评估小鼠暴露于缺氧35天。短暂,20动物被保存在缺氧条件下开发肺动脉高压。21天后,动物被随机分配接受口服STI571(50和100毫克/公斤)通过填喂法或安慰剂。
所有协议都是吉森大学动物保健委员会批准。
手术准备和组织准备。监测血流动力学,动物最初麻醉ip氯胺酮和甲苯噻嗪。左侧颈动脉插管,右心通过正确的颈静脉导管插入房车压力测量的充满液体的力传感器。心输出量的老鼠被热稀释法测量技术(Cardiotherm 500 - x;Hugo-Sachs电子-哈佛装置GmbH)如前所述33,34)。放血后,左肺组织学10%中性缓冲福尔马林固定,和肺snap-frozen在液态氮。
遥测房车压力的测量。房车压力测定了大鼠植入radiotelemetry系统(迪讯A.R.T. 2.1;数据科学Inc .)。发射机(模型TA11PA)连接到一个充满液体的传感导管和传输到远程的信号接收器(模型RPC-1)和数据交换矩阵连接到一台电脑。在麻醉下,传感导管插入颈静脉和转发到房车。波形显示在计算机,用于确保导管的正确定位。动物被允许恢复,单独被安置在标准老鼠的笼子里。房车压力每隔1小时记录时间的植入。
评估右心室肥大。RV墙是LV墙和心室中隔分开。房车的湿重,自由LV墙,心室中隔。房车肥大表达RV的重量比墙和自由LV墙和心室中隔(LV + S)。
病人特点和测量。人类肺组织获得4捐赠者和PAH患者(2 IPAH, 1与结缔组织疾病有关的多环芳烃,1与先天性心脏病)接受肺移植。移植后肺组织直接snap-frozen信使rna和蛋白质提取。组织捐赠的研究方案是Ethk-Kommission批准我Fachbereich Humanmedizin der Justus-Liebig-Universitaet吉森大学医院吉森(德国吉森)依照国家法律和良好的临床实践/国际会议协调指导方针。书面知情同意从每个病人或病人的近亲。
石蜡包埋和显微镜。肺部固定是由浸在3%多聚甲醛溶液。石蜡包埋,整个肺解剖组织块叶。切片在3μm进行石蜡包埋块。他走时和弹力染色根据常见的组织病理学手术进行。分析是失明的方式完成的。评估肌肉肺动脉重构的类型,使用电脑化的显微图像分析系统(QWin;徕卡)。在每一个老鼠,60到80 intraacinar动脉被归类为肌肉(即。,与一个完整的内侧的肌肉),部分肌肉(即。,只有一个新月的肌肉),或者nonmuscular(即。没有明显的肌肉),之前报道(34)。腔区域被定义为该地区板内弹力interna,数和平均血管直径的范围内从800年代表从25到50μm。内侧区之间的区域板弹力interna和板弹力答辩。动脉是另外分类根据其外部直径。类别我包括动脉与外部直径在20到50之间μm;第二类包括动脉与外部直径51至100μm;和三级包括动脉与外部直径大于101μm。在老鼠的部分中,60 - 80 intraacinar船只大小20至70μm伴随肺泡管或肺泡治疗分析的盲法在每一个鼠标。如上所述,每个容器都归于nonmuscularized,部分muscularized,或完全muscularized。
明胶zymography。肺组织均质在4°C缓冲区包含1% Triton x - 100, 150毫米氯化钠,焦磷酸钠2.5毫米,1毫米β-glycerophosphate, 10μM e - 64和20毫米Tris-HCl, pH值7.5,20毫克毫升1比例的组织由缓冲体积重量。基质金属蛋白酶的活性进行了分析通过sds - page zymography,酶的水解明胶底物在凝胶,形成一个清晰的乐队。凝胶是用一个Biodoc分析仪(Biometra) MMP-2活动和MMP-9显示为一个清晰的白色带在蓝色的背景下,如前所述(34)。
西方墨点法。肺组织样本中均质包含50 mM Tris-HCl裂解缓冲,pH值7.4,50 mM氯化钠,5毫米EDTA,特里同x - 100 1%, 0.05% SDS,氟化钠50毫米,10毫米β-glycerophosphate,焦磷酸钠100μM Na3签证官4鸡尾酒,蛋白酶抑制剂(罗氏诊断公司)。溶菌产物是规范化和7.5%或10%聚丙烯酰胺凝胶上分离和转移到PVDF膜。阻塞后,探讨了膜1以下抗体:anti-PDGFRβ(sc432) anti-phospho (Tyr1021) -PDGFRβ(sc12909-R) anti-ERK1/2 (sc93)和anti-phospho (Thr202 / Tyr204 / Thr185 /酪氨酸187)-ERK1/2 (sc16982-R)抗体从圣克鲁斯生物技术有限公司(所有),anti-MMP2, anti-MMP9,或anti-GAPDH加载控制从Abcam有限公司(所有),后跟一个1小时孵化与合进行二次抗体结合。结合抗体检测与发射极耦合逻辑的使用化学发光检测系统由微(Amersham生物科学)和量化。
评价原位PA-SMC死亡和扩散。评估PA-SMC扩散与MCT单独或与STI571在小白鼠身上,PCNA是评估。组织部分deparaffinized在二甲苯,然后处理一系列分级的酒精冲洗,患者在PBS (pH值7.5),孵化与抗原检索解决方案(酶实验室Inc .)在90°C水浴20分钟。幻灯片在PBS然后洗,protein-blocking解决方案1小时孵化,孵化一夜之间与anti-PCNA兔多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司)。抗体被冲洗掉,潜伏在Alexa 555 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白抗体(表达载体corp .)。孵化后,所有部分都是复染色与Dako荧光核DAPI染色和安装安装媒体(所有从DakoCytomation)。
评估PA-SMC凋亡,部分使用终端原位可视化的帮助下(TdT-mediated) TUNEL方法原位细胞死亡检测设备(罗氏诊断公司)指定的制造商。的过程中,幻灯片后,荧光显微镜观察DAPI染色(DakoCytomation)。
扩散试验。主要鼠smc是孤立的,如前所述(60),和文化是维持在37°C湿润有限公司5%2/ 95%啊2的气氛。评估的扩散、肺鼠smc从通道2被播种在12-well板块4×10的密度4细胞在10%的边后卫/ DMEM /好。细胞呈现静止在无血清DMEM培养了2小时,其次是血清剥夺(包含0.1%的边后卫DMEM) 72小时。随后,他们与10%的边后卫/ DMEM刺激诱导细胞周期再入。治疗后0、0.1、1和5μM STI571过去12小时,在刺激期间,这些细胞被脉冲与1.5μCi [3H]胸苷(Amersham淀粉微球生物科技有限公司)在过去的12小时的刺激。(3H]胸苷含量的细胞溶解产物是由闪烁计数和规范化的蛋白质浓度,由洛瑞方法(测量61年)。探讨特异性STI571 PDGF-related扩散,静止细胞被刺激与重组PDGF-AA或PDGF-BB在无血清培养基(60 ng / ml), igf - 1 (100 ng / ml), EGF (50 ng / ml), bFGF (50 ng / ml)。生长因子都是购自北部。
细胞凋亡检测。孤立PA-SMCs生长在室的幻灯片,视为表示(0.1、1和5μM STI571)。24小时后,立即细胞被固定在4%多聚甲醛(卷/期)1小时,permeabilized使用Triton x - 100 (Sigma-Aldrich),然后在37°C孵化为60分钟TdT-mediated TUNEL反应混合物(原位细胞死亡检测装备,荧光素;罗氏诊断公司)。积极控制,细胞DNase对待我(罗氏诊断公司)指定的制造商。
数据分析。所有数据给出均值±SEM。组之间的差异的方差分析和评估Student-Newman-Keuls因果测试多个比较,用P值< 0.05被认为是重要的。
我们感谢里约热内卢Dumitrascu,安科·沃伊特Marcel Zoremba,和挚友梅林的优秀的技术援助与组织学和生理学用于这项研究。我们还要感谢沃尔特·Klepetko心胸外科学系,维也纳大学,请提供人类的肺部组织。这项工作是由德意志Forschungsgemeinschaft SFB547,项目C6, C11、B6和B7。
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使用非标准缩写:bFGF、基本FGF;IPAH特发性肺动脉高血压;未经中华人民共和国交通部,野百合碱;多环芳烃、肺动脉高血压;PA-SMC肺动脉SMC;PCNA增殖细胞核抗原;PDGFR PDGF受体;RVSP,房车收缩压。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突的存在。