摘要
尽管最近报道了克隆菌株铜绿假单胞菌在囊性纤维化(CF)病房,常规微生物监测的必要性仍然存在争议。
前瞻性地收集来自澳大利亚布里斯班地区儿科和成人CF单位的生产性患者的痰液。所有铜绿假单胞菌使用脉冲场凝胶电泳对分离株进行分型。记录肺活量测定、人体测量、住院和抗生素敏感性数据。
前100份痰标本(每个诊所的前50名患者)含有163株铜绿假单胞菌.共有39名患者共享一种共同毒株(pulsotype 2), 20名患者与至少一名其他患者共享一种毒株,41名患者携带独特毒株。8名患者与之前报道的澳大利亚传播毒株(pulsotype 1)相同。与独特毒株组相比,pulsotype 2患者更年轻,肺功能更差。这两组患者的治疗要求相似,多重耐药率也相似。
总之,59%的患者携带克隆菌株,支持常规微生物监测的必要性。与前面所描述的无性系菌株相比,优势脉管型在菌落形态和多重抗性方面与非无性系菌株难以区分。克隆菌株的临床意义仍不确定,需要纵向研究。
这项研究得到了皇家儿童医院基金会种子基金R912-007的支持,该基金由克雷斯布鲁克委员会赞助。
过去30年的进展显著提高了囊性纤维化(CF)患者的生存率。然而,慢性肺部感染铜绿假单胞菌仍然是CF的发病率和死亡率的最重要的原因1.铜绿假单胞菌是一种普遍存在的生物体,能够适应CF肺的独特环境。它能够假定粘液表型,并创建一个生物膜,提高细菌对吞噬和抗假单胞抗生素的耐药性。一旦在CF肺中形成,铜绿假单胞菌几乎是不可能根除的。尽管年龄铜绿假单胞菌获得是预后的重要决定因素2在美国,从一个病人到另一个病人的传播在历史上被认为是罕见的3.,4因此,根据感染情况进行隔离也不是常规做法。
大量研究表明,CF患者通常携带自己独特的菌株铜绿假单胞菌这可能是在童年时期从环境中习得的5,6.随后获得其他毒株和共享毒株被认为是不寻常的,但有充分记录的兄弟姐妹除外7- - - - - -9.最近的一些报告10- - - - - -13,包括两个来自澳大利亚的,描述了铜绿假单胞菌在CF中心就诊的患者中。除了早期丹麦的一项研究14由于缺乏可靠的细菌指纹,在头孢他啶耐药率逐渐增加后,第一个克隆菌株仅通过分子分型方法得到确认铜绿假单胞菌导致了进一步的调查12。随后,人们对克隆菌株可能存在的兴趣增加,导致在CF护理环境中发现了其他几种克隆菌株。在每种情况下,都有一种单一的优势菌株。克隆菌株通常(但并非总是)具有粘液表型,并与抗生素耐药性增加相关。传播方式可能是病人之间的传播,因为早期的报告没有确定环境蓄水池12,13.最近,有两项研究证实克隆菌株可能毒性更强,并可能预示预后更差11,15.
公认的确定性分子分型方法P.aeruginosa为脉冲场凝胶电泳(PFGE)限制性片段长度多态性分析。并不是所有使用PFGE的组都能证明有克隆菌株的存在铜绿假单胞菌在他们的CF诊所内16,引发了关于这些菌株的临床意义的辩论17,18.目前的作者旨在确定克隆菌株是否在澳大利亚昆士兰州的区域儿科和成人CF中心普遍存在,以及在两种临床环境中是否发生了相同的菌株。
方法和材料
临床数据
囊性纤维化诊所
皇家儿童医院(RCH) CF诊所在昆士兰州管理270名患者(184名痰源,其中123名(66.8%)感染铜绿假单胞菌).132例痰液产生者可重复检测肺功能。在这组中,有78名儿童有慢性症状铜绿假单胞菌感染19.大多数经新生儿筛查确诊的CF患儿在RCH接受治疗,并在16-18岁之间转送查尔斯王子医院(PCH)。住院病人没有慢性铜绿假单胞菌在进行这项研究时,感染者并没有被隔离P.aeruginosa并且经常共用房间。用餐设施和健身器材也被共用。患者感染伯克不过复杂或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为住院病人,在单人病房进行护理,在门诊也分开,并使用单独的肺功能设备。成人诊所不共用任何设施。
PCH CF诊所管理来自昆士兰州各地的151名患者;129例有慢性铜绿假单胞菌感染19.患者因感染加重入院,通常接受10-14天的肠外抗生素治疗。在情况允许的情况下,常规做法是在单间内管理病人。MRSA和MRSA的感染控制措施洋葱伯克氏菌和RCH是一样的。
患者、样本和数据收集
标本于2001年12月至2002年7月期间采集,包括门诊复查或住院期间自发产生的痰液。隔离的铜绿假单胞菌从每个中心收集的前50例患者的痰标本中获得(总共283例患者中的100例)。
临床资料通过病历查阅获得。所有的测量都是从最接近痰液收集日期的点开始的。将这100例患者的临床特征与各自的研究人群进行比较,以确定他们是否是具有代表性的样本。此外,对慢性铜绿假单胞菌两个部位都有感染。慢性的定义铜绿假单胞菌感染是由李报告的等等。19. 然后从100名患者的研究队列中收集进一步的临床数据。这包括CF跨膜调节蛋白基因型、住院治疗天数和注射。既往12个月使用抗生素,使用重组DNAase (rhDNAase),常规使用吸入性抗生素,2年所有肺功能测量。1秒最佳用力呼气量(FEV)1) %,并记录FEV下降率1% pred(%·年−1)采用线性回归建模。FEV下降速率1% pred在3例患者的分析中被省略,原因要么是变化率极高,要么是数据点不足(3个或更少)。
这项前瞻性研究获得了RCH和PCH伦理委员会的批准。所有年龄≥12岁的CF患者均获得书面知情同意铜绿假单胞菌所有18岁以下儿童的父母感染 年。
微生物学
痰液处理及抗菌药物敏感性试验
痰标本在各自的中心进行常规处理。痰液在选择性和非选择性培养基上培养,分离株鉴定为铜绿假单胞菌基于相容形态和阳性氧化酶反应,并在42°C下生长。常规使用的选择培养基有:羊血琼脂(澳大利亚bioMerieux, Baulkam Hills,澳大利亚);巧克力杆菌肽琼脂(含BBLTM血琼脂基础灌注琼脂(BD澳大利亚/新西兰,北赖德,澳大利亚),去纤维马血(bioMerieux澳大利亚)和杆菌肽锌盐(Sigma-Aldrich,城堡山,澳大利亚);含水晶紫的麦康基琼脂(澳大利亚梅里厄);洋葱伯克氏菌复合培养基(Mast Diagnostics,默西塞德,英国);和桶TM甘露醇盐琼脂(BD澳大利亚/新西兰)。使用API 20NE (bioMérieux Vitek, Hazelwood, MO, USA)鉴定系统鉴定了在42°C下无法生长的可疑菌落。采用前面描述的方法,用oprL PCR确认了鉴定结果20.,21.将代表每种形态的单个菌落传代到羊血琼脂(Accumedia, Baltimore, MD, USA)上进行进一步研究。
采用盘扩散法对BBL进行药敏试验TMMueller Hinton II琼脂(BD澳大利亚/新西兰)符合国家临床实验室标准委员会22.使用含有10µg硫酸粘菌素的椎间盘进行粘菌素敏感性试验,并根据先前提出的标准进行解释23.为了标准化,所有抗生素敏感性测试均在PCH进行。多重耐药标准是囊性纤维化基金会共识会议提出的;也就是说,一个铜绿假单胞菌如果从CF患者分离的菌株对以下两类抗生素中的所有药物耐药:β-内酰胺类、氨基糖苷类和/或喹诺酮类,则定义为多重耐药24共记录病原菌。
Pulsed-field凝胶电泳
来自100名患者的储存分离物通过PFGE进行分子分型,由一名不了解临床状况的科学家使用Spencker之前描述的方法进行et al。4.塞子用限制性内切酶消化SpeI和电泳使用夹紧均匀电场DRII模块(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯Bio-Rad实验室)进行修改切换时间。计算结果的相似性分析。使用算术平均值,使用未加权对组方法生成相似性矩阵的聚类分析。所有分析的相关克隆标准均被视为具有≥90%的条带相似。条带模式也进行了目视比较,并符合Tenover标准25被用来描述亲缘关系。被归类为“相关”的菌株之间的频带差异最多为3个。作为一种澳大利亚克隆株,此前曾报道为pulsotype 110,11,目前的作者随后的菌株被标记为pulso2型。为了分析的目的,如果2型脉冲症患者存在任何其他基因型,则将患者分为2型脉冲症组。属于独特基因型组的患者没有感染其他克隆株或群集(包括1型或2型)的证据P.aeruginosa从病人到病人或从环境到病人,“克隆菌株”这个术语已经在这项研究中使用,并基于之前详细的分子定义。发生在两个或两个以上病人中的次要克隆菌株称为一簇。
统计数据
使用非配对t检验(显著性水平为0.05)将每个诊所抽取的50名患者的样本与其各自的人群进行比较,但使用Wilcoxon秩和检验进行比较的入院人数除外。比较两组具有独特和优势菌株的临床特征,usi对协方差进行ng分析,以调整年龄和临床的影响。在分析中,将成人和儿科患者分组。使用Wilcoxon秩和检验比较住院总天数和住院总天数注射。抗生素日数,因为这不是正态分布。采用卡方检验和Fisher精确检验(如果观察次数少于五次)来比较抗生素耐药率的差异。结果以正态分布变量的调整平均值(95%置信区间)或中位数(四分位距)表示住院人数、住院天数和住院天数注射。抗生素,除非另有说明。
结果
临床数据
儿科患者的平均±sd年龄为12.0±3.1岁 与11.3±3.5岁相比,48%为女性 该儿科样本在过去12个月内接受了更频繁的住院治疗(1.0(0-3.0))与0.0 (0 - 1.5);P =0.0002),而在临床上能够进行肺功能测试的产痰儿童(n=132)。与患有慢性铜绿假单胞菌感染组78例,年龄、FEV无明显差异1% pred,强迫肺活量(FVC) % pred,体重z-分数,身高z-分数和上一年的入院人数(数据未显示)。
成人的平均±sd年龄为28.5±9.1岁,女性为42.0%,而整个诊所的平均±sd年龄为26.1±7.9岁,女性为41.7%。研究患者的平均FEV较低1%pred(48.2±19.6%与55.5±23.6;P =0.0497),住院率更高(2.0(0-3.0))。与1.0 (0 - 3.0);P =0.04),高于临床组(n=151)。与患有慢性疾病的成年人相比铜绿假单胞菌感染组(n=129),年龄、FEV无显著性差异1前一年入院人数、体重、身高、肺活量百分比(未显示数据)。
大多数患者(82%)的痰是作为门诊患者收集的。在18名住院患者中,10名患者携带pulsotype 2,5名患者具有独特的菌株,3名患者具有小簇。
微生物学
菌株的铜绿假单胞菌
共163株P.aeruginosa从100例患者的痰液中培养(每个患者1-3株)。PFGE谱图的视觉比较结果一致。将每个带状图案与所有其他带状图案进行比较。共鉴定出58种独特的条带。39例患者(63株)的痰液中发现显性菌株(pulso2型)。63个分离株中,46个是相同的,其余的通过PFGE有1和3个波段的差异。4名患者携带2型脉管炎,同时还携带另一种毒株:1名患者携带58型脉管炎,2名患者携带独特毒株,1名患者携带两种独特毒株。另有41名患者携带独特的菌株(65个分离株),其余20名患者与至少另一人共享5个聚集群(30个分离株)。8名患者(5名成人,3名儿童)共享的菌株与之前报道的澳大利亚克隆菌株(pulsotype 1)的代表性分离株难以区分。其中3个簇(pulsotype 3, 42和58)完全包含在儿科或成人诊所内。涉及2到7名患者。 The final strain (pulsotype 5) was shared between one patient from each clinic.There was no close contact between any of the patients who shared the minor clusters. In the case of pulsotype 5, thepatients never had any contact, including having never attended the same hospital. Out of the 20 patients sharing minor clusters, one had co-infection with a uniqueP.aeruginosa菌株(脉冲星3型和独特菌株),其中一个携带了两个这些次要菌株(脉冲星1型和58型)。
39例患者中,25例(64.1%)为2型脉管综合征患者,34.2%为2型脉管综合征患者2= 7.42, p = 0.02)。14例成人2型脉冲症患者中,有8例(57.1%)接受了RCH的儿科治疗,相比之下,有29.6%的脉冲症患者接受了RCH的儿科治疗2= 3.0, p = 0.24)。在6名未到RCH接受治疗的2型脉冲症成人患者中,有4人与已知的2型脉冲症感染患者有重叠的成人诊所。
pulsotype‐2组与那些携带独特菌株的组相比,FEV显著降低1% pred和FVC % pred的痰收集时(表1⇓).最好的FEV1% pred在前24个月的记录,两组肺功能下降率、人体测量和治疗需求相似。当携带1型脉冲症的组与唯一菌株组比较时,这些指标均无显著差异。
感染的潜在混杂效应洋葱伯克氏菌将这些患者排除在外,重复分析临床结果变量来检查复合MRSA或MRSA。结果并没有改变,当那些窝藏洋葱伯克氏菌省略了复合词;然而,当排除携带MRSA的患者时,与独特菌株组相比,pulsotype-2组的住院天数显著增加(p=0.03)。当所有四名携带这些共病原体的患者都被忽略时,与独特菌株组相比,pulsotype-2组的住院天数显著增加(26.5(9.0–54.0)与12.0 (0.0 - -36.0);p = 0.02)。
表型和抗生素耐药性
所有分离株中有44%为黏液样表型。药敏试验结果见表2⇓.Pulsotype量2P.aeruginosa对所有氨基糖苷类、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、美罗培南和亚胺培南的耐药性均较独特菌株强。在pulsotype‐2和独特菌株组中多重耐药率相似。pulsotype - 2菌株中的3株(来自2名儿童)对粘菌素具有耐药性。E-test最低抑菌浓度证实了这一点。这两名患者均常规接受吸入性粘菌素治疗,但从未接受过注射。形式。考虑到pulsotype-2和独特菌株组中的粘液性,63株pulsotype-2中有33株(52.4%)具有粘液性表型,而65株独特菌株中有25株(38.5%)具有粘液性表型(χ2= 2.5, p = 0.11)。
Co-pathogens
42例患者痰液中检出另一病原体(金黄色葡萄球菌(n = 29),耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(n = 4),来自烟曲霉属真菌(n = 9),洋葱伯克氏菌复杂的(n = 2)和无色菌xylosoxidans(n = 1))。2例2型脉管炎成人患者合并感染洋葱伯克氏菌复合物和MRSA。虽然病人感染了洋葱伯克氏菌在成人诊所,她一直被隔离,她的儿科护理在RCH,并没有被隔离之前的身份洋葱伯克氏菌复杂。MRSA患者在成人诊所一直被隔离,从未去过儿科诊所。
讨论
CF诊所的经验在患者之间传播的潜力方面是高度可变的铜绿假单胞菌11,16,18,导致了对克隆菌株的流行程度和重要性的广泛不同的看法。而三个小组提供了令人信服的证据的克隆菌株铜绿假单胞菌在他们的诊所11- - - - - -13尽管使用了相同的分子分型技术,但其他国家没有16.目前的作者已经发现了优势克隆菌株的证据铜绿假单胞菌在这项前瞻性横断面研究中,在澳大利亚昆士兰州的区域儿童和成人儿童中心共享。总的来说,59%的患者携带了克隆菌株。而儿童克隆株以前曾在成人CF诊所描述过26据目前作者所知,这是第一次试图调查的程度铜绿假单胞菌跨越地理上不同诊所的传播。目前的发现提供了进一步的证据,克隆菌株铜绿假单胞菌是一个重要的问题,相信这个问题将继续出现,并对许多(但不一定是所有)CF单位造成重大的临床和感染控制难题。
增加的抗生素耐药性(包括多重耐药性)和不寻常的表型(不同的菌落形态)已使克隆菌株的特征铜绿假单胞菌迄今为止的报告11- - - - - -13.目前作者的pulsotype 2的表型与独特的菌株难以区分,但更有可能对各种抗生素产生耐药性,尽管不是多重耐药性。粘液样表型并没有作为一个标志出现。唯一不寻常的表型特征是来自两名儿科患者的三个分离株存在粘菌素耐药性。这两例患者均常规使用吸入粘菌素,但从未接受过注射。的形式。因此,这可能代表抗生素选择引起的耐药性。对粘菌素耐药性流行率的准确估计铜绿假单胞菌孤立是有限的,尽管皮特最近的一篇论文et al。273%的人对粘菌素有耐药性铜绿假单胞菌来自英国17家医院的分离菌。另一项最近发表的英国研究发现,基线大肠杆菌素耐药性水平较高(25–32%)28并进一步强调了使用传统断点来定义粘菌素和其他吸入抗生素耐药性的困难29.丹顿et al。30.报道了大肠杆菌素耐药的传播铜绿假单胞菌在儿科CF患者中,基因分型证实了PFGE无法区分四种菌株。在所有其他方面,如果没有进行分子调查,诊所中pulso2型菌株的存在可能会被忽略。
6名患有Pulsotype2的成年患者从未到过儿科诊所。其中四名患者的PCH住院治疗与已知的Pulsotype2感染患者重叠。六名患者中有一名患有MRSA慢性感染,除了从未到过儿科诊所外,还一直被隔离在PCH。因此,成人诊所中存在的pulsotype 2不能仅用感染的儿科患者的转移来解释,这表明克隆菌株的传播可能在两个诊所内独立发生。环境采集仍然是可能的,并且可以解释感染MRSA患者中pulsotype 2的鉴定。曼彻斯特集团最近隔离了这一流行病铜绿假单胞菌当患者进行肺活量测定、雾化和气道清理时,从室内空气中分离,提示气溶胶传播可能是患者之间传播的最重要因素31.这可能证明人际传播和环境源获取同时发生,但这需要前瞻性研究。另一种可能在成人诊所传播的2型脉管炎的解释是病人在门诊部或病房外的其他医院区域接触。
斯佩特等.16最近报道了多个群集的CFpatients共享相同的菌株铜绿假单胞菌.这些聚集群包括2至21名患者,仅在一对不相关的个体中发现了支持患者间传播的流行病学证据。目前的作者还发现了几个在不相关的个体之间共享的集群。大多数患者在医院以外没有直接的社会接触。这些共同的毒株是患者间传播的结果,还是来自共同的环境来源,仍然存在争议。其中一个聚集群包括8名携带1型脉冲病毒的患者,这是澳大利亚的传染性毒株,最初在墨尔本被描述,最近在悉尼被描述。其中4名患者此前曾在悉尼生活并接受医疗护理,5名患者曾与悉尼诊所的CF儿童一起上学。最近在悉尼CF诊所就诊的患者中发现了Pulsotype 2 (B. Rose,悉尼大学传染病系,新南威尔士,澳大利亚,人际沟通)。因此,有证据表明,这些菌株并不局限于孤立的中心。这突出了当病人从一个诊所转移到另一个诊所时,适当沟通微生物状况的重要性。
克隆菌株的临床意义铜绿假单胞菌尚不清楚。似乎有相当大的地理差异,这些菌株不是一个普遍现象。研究发现,携带曼彻斯特克隆菌株的患者增加了治疗需求15在年轻患者中,pulsotype-1菌株与更严重的疾病有关11提供初步证据,证明这些菌株中的一些可能对临床状态产生不利影响。然而,似乎个别克隆菌株的毒力程度可能是菌株特异性的。目前作者的pulsotype 2与肺功能较差有关,这可能同样反映了住院患者的偏倚,正如任何p潜在的有害影响,需要进行前瞻性研究。由于这些发现,目前作者所在的两个单位的感染控制政策已被修改。这些单位符合澳大利亚囊性纤维化中心感染控制指南。严格隔离铜绿假单胞菌以及那些没有证据的铜绿假单胞菌现在在门诊诊所和住院治疗期间都有感染。克隆菌株的人际传播(包括患者之间的社会接触)仍然是可行的铜绿假单胞菌尽管采取了这项政策,仍有可能发生。基于铜绿假单胞菌基因型目前尚未执行,这与已发表的CF患者感染控制建议一致32.鉴于目前的设施和正在进行的费用,采取这种措施很可能对资源产生重大影响铜绿假单胞菌基因型筛选。虽然还远不能确定所有克隆菌株是否有害,但无论致病性如何,这些菌株的传播潜力至少要求将该患者组与非患者组分开铜绿假单胞菌感染,这是通过采用前面描述的感染控制建议最好的实现。
本研究为纵向分子监测提供了进一步支持铜绿假单胞菌以及在囊性纤维化诊所内持续监测以筛查超级感染。这与囊性纤维化信托基金(英国)感染控制组对此类监测的建议相一致33.纵向筛选计划的广泛应用将加强对克隆菌株的重要性的理解铜绿假单胞菌.
致谢
作者要感谢J. Faoagali和查尔斯王子医院和皇家布里斯班医院微生物实验室的工作人员。作者还要感谢T. Kidd进行了抗菌敏感性测试,并感谢囊性纤维化病房的物理治疗师和专科护士在标本采集方面的帮助。作者感谢J.Govan, K. Webb, A. Jones和B. Rose提供了流行菌株铜绿假单胞菌.
- 收到了2003年的11月2日。
- 接受2004年2月13日。
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