抽象的
尽管最近报道了克隆菌株铜绿假单胞菌在囊性纤维化(CF)单位中,常规微生物监测的需要仍然有争议。
从澳大利亚布里斯班的区域小儿科和成人CF单位前瞻性地从生产患者预期收集痰。全部铜绿假单胞菌使用脉冲场凝胶电泳键入分离物。记录肺活量测定,人体测量,住院,住院和抗生素敏感性数据。
前100个痰样品(每种临床的前50名患者)有163个分离物铜绿假单胞菌.共有39名患者共享一种共同毒株(pulsotype 2), 20名患者与至少一名其他患者共享一种毒株,41名患者携带独特毒株。8名患者与之前报道的澳大利亚传播毒株(pulsotype 1)相同。与独特毒株组相比,pulsotype 2患者更年轻,肺功能更差。这两组患者的治疗要求相似,多重耐药率也相似。
总之,59%的患者患有克隆菌株,支持需要常规微生物监测。与先前描述的克隆菌株相反,显性脉冲型与相对于殖民形态和多重的群体菌株难以区分。克隆菌株的临床意义仍然不确定,需要纵向研究。
这项研究得到了皇家儿童医院基金会种子基金R912-007的支持,该基金由克雷斯布鲁克委员会赞助。
过去30年的进展显著提高了囊性纤维化(CF)患者的生存率。然而,慢性肺部感染铜绿假单胞菌在CF中仍然是发病率和死亡率的最重要原因1.铜绿假单胞菌是一种普遍存在的生物,能够适应CF肺的独特环境。它能够呈现粘液表型并产生生物膜,这提高了对吞噬作用和抗癫痫抗生素的细菌性抗性。曾经在CF肺部建立,铜绿假单胞菌几乎不可能根除。虽然年龄铜绿假单胞菌收购是预后的重要决定因素2,从一个患者到另一个患者的传输是历史上的被认为是一种罕见的发生3.,4因此,根据感染情况进行隔离也不是常规做法。
大量研究表明,CF患者通常携带自己独特的菌株铜绿假单胞菌,这可能是在童年时期的环境中获得的5,6.随后收购其他菌株和菌株的分享被认为是不寻常的,除了兄弟姐妹,这种发生的兄弟姐妹被妥善了解7- - - - - -9.最近的一些报告10.- - - - - -13.,包括来自澳大利亚的两个,描述了克隆的菌株铜绿假单胞菌在参加CF中心的患者中。除了早期的丹麦学习14.由于缺乏可靠的细菌指纹图谱,在对头孢他啶耐药的患病率逐渐增加后,第一个克隆株仅通过分子分型方法得到证实铜绿假单胞菌导致了进一步的调查12..随后,对克隆菌株可能存在的兴趣已经生长,导致CF-护理环境中的几种其他克隆菌株的发现。在每种情况下,占上风。克隆菌株通常但不具有粘液表型并与增加的抗生素抗性相关。随着早期报告未确定环境水库,传播方式可能是患者对患者的传播。12.,13..最近,有两项研究证实克隆菌株可能毒性更强,并可能预示预后更差11.,15..
可接受的最终分子打字方法P.aeruginosa为脉冲场凝胶电泳(PFGE)限制性片段长度多态性分析。并不是所有使用PFGE的组都能证明有克隆菌株的存在铜绿假单胞菌在他们的CF诊所16.,导致关于这些菌株的临床意义的辩论17.,18..目前的作者旨在确定群岛,澳大利亚区域儿科和成人CF中心的克隆菌株是否普遍存在,以及同一株是否发生在临床环境中。
方法和材料
临床数据
囊性纤维化诊所
皇家儿童医院(RCH)CF诊所管理昆士兰州的270名患者(184名痰生产者,123名(66.8%)被感染铜绿假单胞菌).132例痰液产生者可重复检测肺功能。在这组中,有78名儿童有慢性症状铜绿假单胞菌感染19..大多数经新生儿筛查确诊的CF患儿在RCH接受治疗,并在16-18岁之间转送查尔斯王子医院(PCH)。住院病人没有慢性铜绿假单胞菌在这项研究时感染是,没有从那些中隔离P.aeruginosa和常规共用房间。餐饮设施和设备也被共享。患者感染伯克不过复合物或甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在单人间护理为住院患者,并且还在门诊诊所进行隔离,并使用单独的肺功能设备。没有成人诊所共用任何设施。
PCH CF诊所管理来自昆士兰州各地的151名患者;129例有慢性铜绿假单胞菌感染19..患者因感染加重入院,通常接受10-14天的肠外抗生素治疗。在情况允许的情况下,常规做法是在单间内管理病人。MRSA和MRSA的感染控制措施B. Cepacia.否则复杂与RCH相同。
患者、样本和数据收集
标本于2001年12月至2002年7月期间采集,包括门诊复查或住院期间自发产生的痰液。隔离的铜绿假单胞菌从每个中心收集的前50例患者的痰标本中获得(总共283例患者中的100例)。
临床数据是通过医学记录审查获得的。所有测量均取自最接近痰收集日期的点。将100名患者的临床特征与各种研究群体进行比较,以确定它们是否是代表性的样本。此外,慢性患者之间进行了比较铜绿假单胞菌两个部位都有感染。慢性的定义铜绿假单胞菌感染是由李报道的etal。19..然后从100名患者的研究队列中收集进一步的临床数据。这包括CF跨膜调节蛋白基因型,住院天数和I.v.前12个月的抗生素给药,使用重组DNA酶(RHDNA酶),常规使用吸入的抗生素和前面2 YRS的所有肺功能测量。最好的强制呼气量一秒钟(FEV1)在前24个月内预测的%记录和FEV的下降率1%pred(%·Yr−1)使用线性回归进行建模。FEV的下降率1由于数据点(三个或更少)的极端速率,从分析到三名患者的分析中省略了%pred。
从RCH和PCH的伦理委员会获得了这项前瞻性研究的批准。从≥12岁的所有CF患者获得书面知情同意书铜绿假单胞菌感染和来自所有儿童的父母<18岁。
微生物学
痰液处理及抗菌药物敏感性试验
痰标本在各自的中心进行常规处理。痰液在选择性和非选择性培养基上培养,分离株鉴定为铜绿假单胞菌基于相容形态和阳性氧化酶反应,并在42°C下生长。常规使用的选择培养基有:羊血琼脂(澳大利亚bioMerieux, Baulkam Hills,澳大利亚);巧克力杆菌肽琼脂(含BBLTM值血琼脂碱输液琼脂(BD澳大利亚/新西兰,北雷迪,澳大利亚),失业的马血(Biomerieux澳大利亚)和嗜酸盐锌盐(Sigma-Aldrich,Castle Hill,Australia));与水晶紫(BioMerieux澳大利亚)的麦克尼基琼脂;B. Cepacia.复杂培养基(桅杆诊断,英国Merseyside);和BBL.TM值甘露醇盐琼脂(BD澳大利亚/新西兰)。使用API 20NE(BiomérieuxVitek,Hazelwood,Mo,USA)识别系统,识别未能在42°C下生长的可疑菌落。使用先前描述的方法用OPR1 PCR确认鉴定20.,21..将代表每种形态的单个菌落传代到羊血琼脂(Accumedia, Baltimore, MD, USA)上进行进一步研究。
通过BBL上的椎间盘扩散测试进行抗生素敏感性测试TM值Mueller Hinton II agar(BD澳大利亚/新西兰)根据国家临床实验室标准委员会22..使用含有10μg硫磷硫酸盐的圆盘进行Colistin - 易感性测试,并根据先前提出的标准解释23..为了标准化,所有抗生素敏感性测试均在PCH进行。多重耐药标准是囊性纤维化基金会共识会议提出的;也就是说,一个铜绿假单胞菌如果从CF患者中分离出的菌株对以下两类抗生素中的所有药物均耐药:β -内酰胺类、氨基糖苷类和/或喹诺酮类,则定义为多重耐药24..记录了共同病原体。
脉冲场凝胶电泳
从100名患者的储存分离株通过PFGE进行分子打字,通过盲目描述的科学家进行的科学家进行,使用先前由Spencker描述的方法进行临床状态et al。4.塞子用限制性内切酶消化Spe用夹紧均匀的电场-DRII模块(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)进行电泳,具有切换时间。计算了结果的相似性分析。使用算术平均值的未加权对组方法生成相似性矩阵的群集分析。所有测定的相关克隆的标准作为≥90%相似频段的曲线。在视觉上也比较了条带图案以及TOVER标准25.被用来描述亲缘关系。被归类为“相关”的菌株之间的频带差异最多为3个。作为一种澳大利亚克隆株,此前曾报道为pulsotype 110.,11.,目前的作者随后的菌株被标记为pulso2型。为了分析的目的,如果2型脉冲症患者存在任何其他基因型,则将患者分为2型脉冲症组。属于独特基因型组的患者没有感染其他克隆株或群集(包括1型或2型)的证据P.aeruginosa从病人到病人或从环境到病人,“克隆菌株”这个术语已经在这项研究中使用,并基于之前详细的分子定义。发生在两个或两个以上病人中的次要克隆菌株称为一簇。
统计数据
除了使用Wilcoxon等级和测试相比,使用未配对的T检验,将来自每种临床的50名患者的样品与其各自的群体进行比较。比较了两组患有独特和显性菌株的临床特征,使用协方差分析来调整年龄和临床影响。成人和儿科患者在分析中分组。Wilcoxon的等级和测试用于比较住院日的总数和I.v.抗生素日,因为这些不是通常分布的。Chi-Squared和Fisher的确切测试(如果有少于五个观察),则采用比较抗微生物抗性率的差异。结果呈现为适用于通常分布的变量的调整方法(95%置信区间)或作为医院入学人数,住院日期的中位数(四分位数范围)I.v.抗生素,除非另有说明。
结果
临床数据
儿科患者的平均值±SD年龄为12.0±3.1毫秒,雌性为48%,与整个诊所的11.3±3.5毫秒和52.3%的女性相比。此儿科样品在前12个月内更频繁地住院(1.0(0-3.0)与0.0 (0 - 1.5);P =0.0002),而在临床上能够进行肺功能测试的产痰儿童(n=132)。与患有慢性铜绿假单胞菌感染组78例,年龄、FEV无明显差异1%pred,强制生命能力(fvc)%pred,重量z评分,高度z分数和前一年的录取数(数据未显示)。
成人的平均±sd年龄为28.5±9.1岁,女性为42.0%,而整个诊所的平均±sd年龄为26.1±7.9岁,女性为41.7%。研究患者的平均FEV较低1%pred(48.2±19.6%与55.5±23.6;P = 0.0497)和更频繁的医院入院(2.0(0-3.0)与1.0(0-3.0);p = 0.04)比临床组整体(n = 151)。与慢性的成年人相比铜绿假单胞菌感染(n = 129),年龄没有显着差异,fev1前一年入院人数、体重、身高、肺活量百分比(未显示数据)。
大多数患者(82%)将其痰收集为门诊病。在18名住院患者的患者中,10名患有10名毛囊型脉冲型2,其中5名有独特的菌株,三个有三种簇。
微生物学
菌株铜绿假单胞菌
共有163个分离株P.aeruginosa从100名患者的痰中培养(每位患者1-3分离株)。PFGE曲线视觉比较的结果是一致的。将每个条带图案与所有其他条形图案进行比较。总共确定了58个独特的绷带模式。在39名患者(63个分离物)中,在痰中鉴定了优势菌株(脉冲型2)。在63个分离株中,46个是相同的,其余的证据证明了PFGE的一个和三个带差异。四个患者患有脉冲型2,以及另一种患者的脉冲型58患者,两名患者有一个独特的菌株,一名患者有两个独特的菌株。另外41名患者患有独特的菌株(65个分离物),其余20名患者共用五个簇(30个分离株),至少还有一个其他人。八名患者(五名成人,三名儿童)分享了一种菌株,该菌株是从先前报告的澳大利亚克隆菌株(脉冲型1)的代表性孤立中发现的。其中三个簇(脉冲型3,42和58)完全包含在儿科或成人诊所内,并在两到7名患者之间染色。 The final strain (pulsotype 5) was shared between one patient from each clinic.There was no close contact between any of the patients who shared the minor clusters. In the case of pulsotype 5, thepatients never had any contact, including having never attended the same hospital. Out of the 20 patients sharing minor clusters, one had co-infection with a uniqueP.aeruginosa菌株(脉冲星3型和独特菌株),其中一个携带了两个这些次要菌株(脉冲星1型和58型)。
在39例患者中,25例(64.1%)含有脉冲型2,参加了儿科诊所,与34.2%的菌株相比(χ2= 7.42, p = 0.02)。14例成人2型脉冲症患者中,有8例(57.1%)接受了RCH的儿科治疗,相比之下,有29.6%的脉冲症患者接受了RCH的儿科治疗2= 3.0, p = 0.24)。在6名未到RCH接受治疗的2型脉冲症成人患者中,有4人与已知的2型脉冲症感染患者有重叠的成人诊所。
pulsotype‐2组与那些携带独特菌株的组相比,FEV显著降低1% pred和FVC % pred的痰收集时(表1⇓).最好的FEV1% pred在前24个月的记录,两组肺功能下降率、人体测量和治疗需求相似。当携带1型脉冲症的组与唯一菌株组比较时,这些指标均无显著差异。
感染的潜在混淆效应B. Cepacia.将这些患者排除在外,重复分析临床结果变量来检查复合MRSA或MRSA。结果并没有改变,当那些窝藏B. Cepacia.复杂的是省略了;然而,当携带MRSA的患者被排除在外时,pulsotype‐2组的住院天数明显多于唯一菌株组(p=0.03)。当所有4名携带这些共病原体的患者都被忽略时,pulsotype‐2组的住院天数明显多于唯一菌株组(26.5(9.0-54.0))。与12.0(0.0-36.0);p = 0.02)。
表型和抗生素抗性
总共,所有分离株的44%是粘液表型。抗生素敏感性测试的结果显示在表中2⇓.Pulsotype量2P.aeruginosa对所有氨基糖苷类、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、美罗培南和亚胺培南的耐药性均较独特菌株强。在pulsotype‐2和独特菌株组中多重耐药率相似。pulsotype - 2菌株中的3株(来自2名儿童)对粘菌素具有耐药性。E-test最低抑菌浓度证实了这一点。这两名患者均常规接受吸入性粘菌素治疗,但从未接受过I.v.形式。考虑到脉冲型-2和独特应变基团中的粘液,其中33个(52.4%)的脉冲型2具有粘液表型,与25型相比,其中65(38.5%)的独特菌株(χ2= 2.5,p = 0.11)。
共同病原体
42例患者痰液中检出另一病原体(S.金黄色葡萄球菌(n = 29),MRSA(n = 4),aspergillus fumigatus(n = 9),B. Cepacia.复杂(n = 2)和achroMobacter Xylosoxidans.(n = 1))。涉及脉冲型2的两名成年患者有共同感染B. Cepacia.复合物和MRSA。虽然病人感染了B. Cepacia.在成人诊所,她一直被隔离,她的儿科护理在RCH,并没有被隔离之前的身份B. Cepacia.复杂的。患有MRSA的患者一直在成年诊所进行隔离,从未参加过小儿诊所。
讨论
CF诊所的经验对于患者对患者的传播潜力具有高度变化铜绿假单胞菌11.,16.,18.,导致了对克隆菌株的流行程度和重要性的广泛不同的看法。而三个小组提供了令人信服的证据的克隆菌株铜绿假单胞菌在他们的诊所11.- - - - - -13.尽管使用了相同的分子分型技术,但其他国家没有16..目前的作者已经发现了优势克隆菌株的证据铜绿假单胞菌在这项前瞻性横断面研究中,在澳大利亚昆士兰州的区域儿科和成人CF中心分享。总共有59%的患者患有克隆菌株。虽然在成人CF诊所之前已经描述了儿科克隆菌株26.为目前作者的知识,这是第一次尝试调查的研究铜绿假单胞菌通过地理位置不同的诊所进行传输。目前的调查结果提供了克隆菌株的进一步证据铜绿假单胞菌是一个重要的问题,相信这个问题将继续出现,并对许多(但不一定是所有)CF单位造成重大的临床和感染控制难题。
增加抗生素抗性(包括多觉)和不寻常的表型(不同的殖民形态)表征了克隆菌株铜绿假单胞菌迄今为止报道11.- - - - - -13..目前作者的脉冲型2具有从独特菌株无法区分的表型,但更有可能抵抗各种抗生素,尽管不是多人。粘液表型没有出现作为标志。唯一的不寻常的表型特征是来自两个儿科患者的三个分离物中的Colistin抗性存在。这两个患者都经常使用吸入凉爽,但从未收到过I.v.形式。因此,这可能代表抗生素选择诱导的抗性。准确估计肥华抗性的患病率铜绿假单胞菌孤立是有限的,尽管最近的Pitt纸张et al。27.3%的人对粘菌素有耐药性铜绿假单胞菌孤立在英国的17家医院获得。来自英国的另一科目近于英国发现较高水平的基线Colistin抵抗(25-32%)28.并进一步强调了使用常规断裂点来定义与菌条素和其他吸入抗生素相关的抗性的难度29..丹顿et al。30.报道了耐菌腐蚀的传播铜绿假单胞菌在儿科CF患者中,基因分型证实了四种分离株通过PFGE无法区分。在所有其他方面,如果未进行分子调查,可能已经被忽略了临床内的脉冲型-2菌株的存在。
6例2型脉管炎成人患者从未到儿科诊所就诊。其中4人因PCH住院,与已知感染脉冲2型的患者重叠。六名患者中有一名患有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)慢性感染,并且一直被隔离在PCH,而且从未去过儿科诊所。因此,在成人诊所出现2型脉冲症不能仅仅用感染的儿科患者的转移来解释,这表明克隆株的传播可能在两个诊所独立发生。环境获取仍然是可能的,并可以解释在MRSA感染患者中识别出脉管型2。曼彻斯特小组最近隔离了流行病铜绿假单胞菌当患者进行肺活量测定、雾化和气道清理时,从室内空气中分离,提示气溶胶传播可能是患者之间传播的最重要因素31..它可能证明,来自环境源的人员传输和获取同时发生,但这需要预期的研究。成人诊所中脉冲型2的可能传播的替代解释是在病房外的门诊诊所或病房外的其他医院区域的患者接触。
speert.等.16.最近报道了多个群集的CFpatients共享相同的菌株铜绿假单胞菌.这些聚集群包括2至21名患者,仅在一对不相关的个体中发现了支持患者间传播的流行病学证据。目前的作者还发现了几个在不相关的个体之间共享的集群。大多数患者在医院以外没有直接的社会接触。这些共同的毒株是患者间传播的结果,还是来自共同的环境来源,仍然存在争议。其中一个聚集群包括8名携带1型脉冲病毒的患者,这是澳大利亚的传染性毒株,最初在墨尔本被描述,最近在悉尼被描述。其中4名患者此前曾在悉尼生活并接受医疗护理,5名患者曾与悉尼诊所的CF儿童一起上学。最近在悉尼CF诊所就诊的患者中发现了Pulsotype 2 (B. Rose,悉尼大学传染病系,新南威尔士,澳大利亚,人际沟通)。因此,有证据表明,这些菌株并不局限于孤立的中心。这突出了当病人从一个诊所转移到另一个诊所时,适当沟通微生物状况的重要性。
克隆菌株的临床意义铜绿假单胞菌尚不清楚。似乎有相当大的地理差异,这些菌株不是一个普遍现象。研究发现,携带曼彻斯特克隆菌株的患者增加了治疗需求15.在年轻患者中,pulsotype-1菌株与更严重的疾病有关11.提供初步证据表明这些菌株中的一些可能对临床状况产生不利影响。然而,似乎有可能的单个克隆菌株的毒力程度将是菌株的特异性。目前作者的脉冲型2与较差的肺功能相关,这可能同样反映住院性偏差,以及任何潜在的有害影响,并且需要预期的研究。由于这些发现,目前作者的两个单元的感染控制政策已经修改。该单位符合澳大利亚囊性纤维化中心感染控制指南。严格的患者分离铜绿假单胞菌以及那些没有证据的铜绿假单胞菌现在在门诊诊所和住院治疗期间都有感染。克隆菌株的人际传播(包括患者之间的社会接触)仍然是可行的铜绿假单胞菌尽管这一政策可能会发生。基于的特定隔离铜绿假单胞菌目前未进行基因型,这与CF患者的已发表的感染控制建议一致32..鉴于目前的设施和正在进行的费用,采取这种措施很可能对资源产生重大影响铜绿假单胞菌基因型筛选。虽然还远不能确定所有克隆菌株都是有害的,但这些菌株的传播潜力,无论其致病性如何,至少要求将该患者组与非患者组分离铜绿假单胞菌感染,这是通过采用前面描述的感染控制建议最好的实现。
本研究为纵向分子监测提供了进一步的支持铜绿假单胞菌并持续监测到囊性纤维化诊所内的超级感染筛选。这种相似的囊性纤维化信托(英国)对这种监视进行感染组的建议33..纵向筛选计划的广泛应用将加强对克隆菌株的重要性的理解铜绿假单胞菌.
致谢
作者要感谢J. Faoagali和查尔斯王子医院和皇家布里斯班医院微生物实验室的工作人员。作者还要感谢T. Kidd进行了抗菌敏感性测试,并感谢囊性纤维化病房的物理治疗师和专科护士在标本采集方面的帮助。作者感谢J.Govan, K. Webb, A. Jones和B. Rose提供了流行菌株铜绿假单胞菌.
- 收到了2003年11月2日。
- 接受2004年2月13日。
- ©ers Journals Ltd