摘要
本研究探讨增加通气对血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β mRNA表达水平的影响1(TGF -β1),与血气和通气水平相似的瘫痪、机械通气的动物的反应相比。
研究人员将四组完好无损的大鼠放在一个尸体箱中,每组呼吸四种气体中的一种:室内空气、12%的氧气(O2), 5%二氧化碳(CO2),或12% O2+ 5%股份有限公司2另取4组瘫痪、机械通气动物进行动脉血气和通气量匹配。
结果表明,12% O浓度时,VEGF mRNA丰度增加3倍,bFGF丰度增加1.5倍2+ 5%股份有限公司2但TGF-β1没有改变。在清醒状态下,VEGF和bFGF mRNA与分气量呈显著的线性关系(r0.98, p<0.02);瘫痪、机械通气的动物没有显示任何探针的mRNA增加。全身缺氧对横膈膜中VEGF或bFGF水平没有额外的影响。
由此可见,膈肌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子信使核糖核酸的显著升高是主动通气所致,而不是血气/pH值变化或被动肌肉缩短所致本身。
本研究由美国国家健康、心脏和肺研究所(美国)资助的研究基金资助。NIH HL17731。
众所周知,骨骼肌对反复运动(耐力训练)的主要适应是新毛细血管的形成(血管生成)。1- - - - - -3.。血管生成是一个极其复杂的过程,其中包括内皮细胞外基质的溶解、细胞迁移和内皮细胞增殖4,5。在恶性肿瘤的生长或发展过程中,已证明血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β等因子对恶性肿瘤的影响1(TGF -β1)参与新毛细血管的形成6- - - - - -8。
研究表明,正常骨骼肌单次1小时的运动可增加VEGF、bFGF和TGF-β的信使核糖核酸(mRNA)水平19(尤其是在缺氧条件下对VEGF的影响更大)。此外,电刺激会增加VEGF水平10。最近,研究表明被动诱导的高灌注不会增加肌肉VEGF mRNA,推测这可能是细胞内缺氧或收缩的机械作用本身(如纤维拉伸)可能是造成这种增加的原因11。
呼吸肌是骨骼肌,对耐力训练的反应是增加毛细血管密度,就像运动肌一样。然而,隔膜与机车骨骼肌的不同之处在于,它是连续的、有节奏的收缩,因此它要接受终身的“耐力训练”。这些发现相应地把作者的注意力集中在对收缩作出反应的呼吸肌毛细血管生长上,特别是横膈膜的毛细血管生长。众所周知,呼吸肌衰竭是一种危及生命的疾病,因此了解呼吸肌毛细血管生长的调节是很重要的。此外,重症监护病房(icu)的患者通常需要一段时间的机械通气。因此,在这些条件下缺乏主动呼吸肌的努力可能会减少呼吸肌毛细血管,这可能会导致呼吸脱机困难。
本研究的目的是探讨VEGF、bFGF和TGF-β的反应1膈膜mRNA与缺氧和/或高碳酸血症刺激的通气增加有关。将这些反应与瘫痪、机械通气的动物在相似血气和通气量水平下的反应进行比较,以确定主动收缩、被动运动或氧分压改变(PO2)主要负责mRNA的变化。
结果表明,暴露于这些刺激1小时后,VEGF和bFGF的mRNA水平升高,并且这种升高与通气时间成正比。瘫痪、机械通气的动物没有显示任何血管生成因子的mRNA变化,表明被动缩短和缺氧都没有参与。讨论了这些发现可能的临床意义。
方法
在整个研究中都使用成年雌性Wistar大鼠。实验动物48只(平均±sd年龄9.2±1.1周,体重272±13 g)。该研究得到了美国加州大学圣地亚哥分校动物实验委员会的批准。
方案一:完整动物
研究人员对四组动物进行了研究,每组6只。在短时间氟烷麻醉下,采用无菌技术将动脉线(PE-50)置于股动脉。导管被放置在皮肤下,并从动物的颈部后部排出。将导管进行肝素化处理,加盖,让动物从麻醉中恢复至少24小时。第二天,将完整的动物舒适地放置在一个体箱中(30 cm×18 cm)。为了在实验过程中提取动脉血液样本,动脉线连接在盒子的密封开口上。动物自发呼吸室内空气10-20分钟(基线条件),并测量通风机参数(潮气量(VT)及呼吸频率(f根据Bartlett和Tenney的方法制作12。每分通气量V'E是用方程计算的吗V'E=VT×fR.此外,取动脉血样本(1ml)用于测量血气(仪表实验室,型号1306)。此后,动物自发呼吸房间空气(A=对照组)或12% O2N + 88%2(B=低氧组)或5% CO2啊,+ 21%2N + 74%2(C=高碳酸组)或12% O2+ 5%股份有限公司2N + 83%2(D=低氧+高氧组)持续1 h。用质谱计(Perkin Elmer MGA 1100;Perkin Elmer, Saira Louis, MO, USA)。
的测量VT,f呼吸各种混合物30,45和60分钟后测量R和血气。暴露于指定气体1小时后,给药1 mL戊巴比妥钠使动物安乐死通过动脉线。立即取下膜片,快速冷冻于液氮中,以分离细胞总mRNA。
方案二:麻醉、瘫痪、机械通气的动物。
另外四组动物腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg·kg)麻醉,每组6只1),并因服用泮库溴铵而瘫痪注射。(2 mg·公斤1)用啮齿动物呼吸机(Harvard # 683;哈佛大学,波士顿,马萨诸塞州,美国)。连接管死腔< 1ml。此外,将动脉导管置入股动脉。呼吸机被设定为产生一分钟的换气量,相当于方案一中完整动物在安静房间呼吸时的换气量,以匹配它们的血气。15分钟基线测量后,动物呼吸室内空气(对照)或12% O2N + 88%2(低氧)或5% CO2+ 21%啊2N + 74%2(高碳酸血症),或12% O2+ 5%股份有限公司2N + 83%2(低氧+高碳酸),气体混合物。再一次,呼吸机被设置(fR和V'T),以匹配方案I中每个相应实验条件下完整动物的通气量和血气水平。机械通气1小时后,对动物实施安乐死,取下横膈膜,与完整自主呼吸的动物(方案I)一样进行处理。
核糖核酸分离及Northern blot分析
用Chomczynski和Sacchi法从每个肌肉样品中分离细胞总核糖核酸(RNA)13。用260 nm吸光度定量RNA制备,用溴化乙锭染色评价其完整性。用6.6%甲醛-1%琼脂糖凝胶电泳分离细胞总RNA 10微克。通过Northern blot将分离的RNA转移到Zeta探针膜(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。用紫外交联剂(FD-UVXL 1000型;Fisher Scientific, Hampton, NH, USA),保存在4°C。然后用低聚标记的[a-]探针印迹32磷]脱氧胞苷三磷酸互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针,其比活性≥1×109衰变·敏1·μg DNA114。人VEGF探针是一个0.93 k的cDNA片段,分离自生态pucc衍生质粒的r1位点6。人体TGF-β1cDNA探针长度为0.985 kb后3Xba I插入克隆到pBlue-script II KS+向量15。bFGF探针长度为1kbXhoI人bFGF cDNA片段5。预杂交和杂交分别在50%甲酰胺、5X SSC (20X SSC为0.3 M氯化钠和0.3 M柠檬酸钠)、10X Denhardt's溶液(100X Denhardt's溶液为2% Ficoll和2%聚乙烯吡啶酮)、50 mM磷酸钠(pH 6.5)、1% SDS和250 μg·mL中进行1在37°C或42°C下超声波处理鲑鱼精子DNA。用2X SSC和0.1% SDS在室温下清洗印迹,用0.1 x SSC和0.1% SDS在55℃下清洗VEGF mRNA,用1X SSC和0.1% SDS在60℃下清洗TGF-β1和bFGF mrna。在-70°C下,使用Cronex Lightning Plus屏幕将印迹暴露在XAR-5 x光片(Eastman Kodak, New Haven, CT, USA)上。在所有的分析中,使用放射自显像的定量密度测定法来测量所有三种生长因子的mRNA水平。随后用18S核糖体RNA特异性cDNA对每个印迹进行重新检测(在先前的复合物被剥离后),并使用该信号对mRNA信号进行标准化,以发现lane负载中的微小变化。
统计分析
在所有统计处理中,采用定量密度法测量所有三种生长因子的mRNA水平。以核糖体18S RNA为控制带,通过信号归一化控制Lane加载变异性。采用单向方差分析来确定通气增加时mRNA水平的变化。用最小二乘法检验线性关系,并使用Mann-Whitney检验来确定清醒完好(I)和瘫痪通气(P)动物之间的差异。p≤0.05为有统计学意义。
结果
通风参数(VT,fR,V'E)和血气(pH值,动脉血中的氧张力(P啊,一个2)、动脉血二氧化碳浓度(P,有限公司2表1总结了清醒、完整(I)自主呼吸和瘫痪(P)机械通气动物的情况⇓。在呼吸相同气体混合物的完整(I)和瘫痪(P)动物之间所讨论的变量的平均值没有统计学上的显著差异。虽然在低氧+高碳酸血症时,瘫痪动物的平均pH值(7.28)低于完好动物(7.38),提示轻度代谢性酸中毒,但差异不显著。因此,满足了在相似通气量、血气和酸碱条件下测试完整和瘫痪动物的实验要求。此外,表1⇓显示分钟通气量(V'E)由于自主呼吸动物的缺氧和/或高碳酸血症而显著增加。
图1⇓图中为VEGF、bFGF和TGF-β的Northern blot集合1在缺氧和/或高碳酸血症引起的通气增加1小时后,完整自主呼吸动物横膈膜mRNA水平。缺氧和/或高碳酸血症时VEGF和bFGF mRNA丰度明显升高。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/4/681/F1.medium.gif)
在清醒、自主呼吸的动物:对照组(室内空气)、低氧(12% O2),高碳酸(5% CO2低氧和高碳酸血症(12% O2+ 5%股份有限公司2)条件。
图2显示了方案II中相同血管生成因子的Northern blots,其中动物被麻醉,瘫痪和机械通气⇓。可以看出,在这些实验条件下,VEGF均未发生明显变化。
血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)的Northern印迹,归一化为RN18S。在麻醉、瘫痪和机械通气的动物中。
VEGF、bFGF、TGF-β mRNA归一化值1完整动物(方案一)和瘫痪、机械通气动物(方案二)的横膈膜的变化如图3所示⇓。在正常自主呼吸的动物中,在增加通气1小时(5% CO2加上12% O2)。同样,随着通气的增加,bFGF增加了约1.5倍,两者的增加均具有统计学意义(p<0.0017和p<0.001)。相反,TGF-β1在四种实验条件下,完整动物呼吸1 h后mRNA水平均无变化(图3)⇓)。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/4/681/F3.medium.gif)
血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)在完整、清醒、自主呼吸(I)和麻醉瘫痪(P)、机械通气动物膈肌中标准化信使核糖核糖酸(mRNA)的平均值±sem值。□:室内空气;点数:12% 02;
: 5% co2和:12% O2+ 5%股份有限公司2。*:与室内空气明显不同。
在高通气水平(与完整动物相似)、pH值和血气相似的机械通气条件下,瘫痪动物的三种生长因子mRNA水平均未发生显著变化。在缺氧的瘫痪动物中,这三种因子的mRNA水平呈上升趋势(图3)⇑,但这没有达到统计学意义。缺氧和高碳酸血症时bFGF的mRNA水平(图3)⇑(横线)实际上减少了。
图4一⇓显示了分钟通气量(V'E)和VEGF、bFGF、TGF-β平均归一化mRNA水平1在横膈膜。之间的线性关系具有统计学意义V'EVEGF差异有统计学意义(r=0.98, p<0.02)V'E与bFGF (r=0.87, p<0.03)差异无统计学意义V'E和TGF -β1。
分钟通气量(V'E)和膈肌中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1的信使核糖核酸(mRNA)水平。A)清醒、完整、自主呼吸的动物;B)瘫痪的机械通气动物。•:VEGF完整(r=0.980, p<0.002);†:bFGF完整(r=0.870, p<0.03);♦TGF-β1完好无损(无统计学意义;ns);〇VEGF瘫痪(ns);: bFGF (ns);: TGF-β1 (ns)。
在瘫痪通气动物中,VE与三种生长因子的mRNA丰度无显著关系(图4b)⇑)。
最后,mRNA水平与细胞凋亡无显著关系P啊,一个2,P,有限公司2,(图5⇓)或完整、清醒、自主呼吸或瘫痪动物的动脉pH值。
血管内皮生长因子(VEGF) mRNA水平图;•,〇),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);†,0%;♦⋄)与动脉血氧压(P啊,一个2)在控制缺氧和/或高碳酸血症条件下的完整(封闭)和瘫痪(开放符号)动物。b) VEGF、bFGF、TGF-β1 mRNA水平相似图与动脉二氧化碳浓度(P,有限公司2)在完整和瘫痪的动物中。以上关系均无统计学意义。
讨论
本研究的主要发现是主动增加通气1 h后膈膜中VEGF和bFGF mRNA水平升高,且与通气成正比,但与通气无关P啊,一个2和P,有限公司2。TGF-β1在相同的实验条件下没有变化。
本研究的设计允许对以下因素的单独作用进行评估:a)主动收缩;B)全身性低氧血症;c)机械通气时被动肌肉缩短对生长因子基因的影响。基于作者之前在运动骨骼肌方面的工作9,16- - - - - -19,显示VEGF对缺氧的mRNA反应增强,研究瘫痪、通气的动物作为对照,其血气值与积极呼吸的动物相似,提供了区分a)和b)的方法。与运动骨骼肌不同,在瘫痪实验中,全身缺氧单独不刺激横膈膜mRNA水平。因此,数据表明,对于横膈膜,主动收缩是增加基因表达和缺氧所必需的本身没有贡献。从瘫痪的对照动物身上可以得出的另一个结论是,被动过度通气和纤维缩短也可以被排除为基因反应的原因。为什么膈肌对全身缺氧没有反应,即使在同一物种的静息腓肠肌中VEGF mRNA也会增加,但没有能力测量细胞内的情况尚不清楚P啊,一个2无论哪种情况,都不可能给出一个明确的答案。目前方案的另一个弱点是没有包括四肢肌肉来阐明全身缺氧的影响。
Ameredes的发现等。20.支持目前的结果,表明膜片相对不敏感的短(24分钟)变化的O2中度缺氧时的供给(吸气氧分数)(F阿,我2) = 0.13)。他们推测,这可能反映了横膈膜收缩缩短的代谢或血流特征的差异。如果考虑到横膈膜的几何形状,它就像一个圆顶(弯曲的),与骨骼肌更线性的本质形成对比,这可以更好地可视化。膈血流量在较短的肌肉长度时增强21主动肌肉缩短可以优化毛细血管结构22。因此,动脉缺氧不能准确反映O分压2在膈肌纤维中。横膈膜对全身性低氧血症的反应不同于腓肠肌的另一种解释可能是横膈膜中的VEGF受到另一种机制的调节,即腺苷途径23。
TGF-β缺乏变化1主动通气后并不意外。布林的研究等。9VEGF和bFGF的表达高于TGF-β1运动后。此外,对罗卡的研究等。11电刺激后VEGF mRNA升高,而bFGF和TGF-β mRNA水平不升高1。虽然这些结果是在另一物种(犬)和不同的实验条件下获得的,但很明显,骨骼肌和呼吸肌的主要血管生成因子基因反应是VEGF。血管平滑肌中VEGF mRNA水平半衰期短24可以解释VEGF的急性增加是对代谢需求增加的早期反应。
基础FGF虽然是一种直接的血管生成因子,但具有更广泛的细胞类型特异性。据推测,bFGF可能代表了对肌肉刺激的长期反应8。目前的实验只持续了1小时,可能不足以验证这一假设。然而,bFGF的增加幅度小于VEGF,这与这一观点一致。
众所周知,VEGF的表达受转录调控25,转录后26- - - - - -28和转化29的水平。缺氧对VEGF的上调已被证实在体外和在活的有机体内并诱导新生血管30.。此外,有一些研究报道拉伸上调了心脏中VEGF的表达31在培养的心肌细胞中32。这种对VEGF的拉伸诱导似乎部分由TGF-β介导。然而,各种血管生成因子之间的网络相互作用尚不完全清楚,本研究结果为进一步研究血管生成生长因子基因中的调控区域提供了理论依据。特别是,需要进一步的实验来研究膈肌中这些血管生成因子的mRNA水平与蛋白质水平之间的关系。
总的来说,血管生成生长因子在调节组织的动态血管化以满足代谢、营养和氧气供应需求方面发挥着重要的生理作用。本研究的结果表明,VEGF mRNA水平的上调是通气增加导致膈膜机械张力增加的早期反应。此外,这些数据表明,横膈膜中的血管生成生长因子基因表达对膈负荷敏感,这增加了未来治疗性增强呼吸衰竭患者膈血管生长有助于其康复(脱离呼吸机)的可能性。虽然还需要进一步的工作来评估这一假设,但心肌的研究33,34以及缺血性血管疾病35是否有证据表明靶向生长因子治疗可以改善局部血液供应36- - - - - -40。
综上所述,本研究结果表明,缺氧和/或高碳酸血症导致通气的主动增加可上调膈血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子信使核糖核酸水平,且这种增加与微小通气成正比。在动脉血气和通气水平相似的瘫痪机械通气动物中,未观察到三种血管生成因子中任何一种的信使核糖核酸水平发生变化。因此,适度缺氧和被动缩短肌肉没有额外的影响。综上所述,横膈膜的血管生成基因反应依赖于横膈膜的主动收缩。
- 收到了1999年10月14日。
- 接受2000年11月7日。
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