文摘
肌肉功能障碍特征的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。最近的研究表明,细胞因子可能是当地监管机构的肌肉功能和再生。本研究的目的是描述的表达不同的细胞因子在慢性阻塞性肺病的外部肋间肌。
肌肉活检获得来自25个稳定的慢性阻塞性肺病患者和8名健康对照组。当地的肿瘤坏死因子(TNF) -α,白介素(IL) 1β,6和-10年表达式(实时PCR和ELISA), sarcolemmal损伤(免疫组织化学)和成绩单CD18水平进行了评估。
肌肉TNF-α和il - 6成绩单在慢性阻塞性肺病患者明显高于与控制相比,和IL-1βsarcolemmal损伤表现出强烈的趋势方向相同。也观察到类似的结果蛋白质水平。CD18 panleukocyte标记类似于慢性阻塞性肺病和控制。呼吸肌肉功能障碍在COPD患者和它相关的肺功能障碍的严重程度和TNF-α肌肉表达式。
慢性阻塞性肺疾病与促炎细胞因子的upregulation肋间肌肉。这种现象可能参与呼吸肌肉功能障碍。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是尚未充分可逆气流阻塞。然而,异构综合征,除了古典肺实质和航空公司的参与,似乎与许多系统性表现有关。这些包括营养异常,减少肌肉和肌肉功能障碍。中心这是呼吸道肌肉发挥作用,因为它们代表通气泵的活性成分。在慢性阻塞性肺病、呼吸肌肉必须应付增加的工作负载,机械有关恶性通货膨胀和缺点,最近证实,一种内在的减少他们的收缩特性1,2。所有这些因素都会影响呼吸肌肉的损伤能力在这些患者中发现2。尽管普遍认为关于这个问题及其临床后果,对潜在的致病机制,导致损伤的内在呼吸肌肉的收缩特性。然而,越来越多的数据,支持细胞因子和氧化应激参与肌无力在COPD的发病机制3。肌肉的损失和降低强度一直归因于增加系统性细胞因子的水平,如肿瘤坏死因子(TNF) -α和白介素(IL) 1β和6。然而,差异的存在严重的肌肉无力稳定的慢性阻塞性肺病患者在不同的肌肉群4表明,除了系统性因素,这个过程可能是由肌肉本身的内在因素。
最近的研究表明,骨骼肌能合成多种细胞因子5,6,这些细胞因子可以作为内源性介质的肌肉功能障碍和/或适应通过自分泌/旁分泌的影响7。在所有这一切的光,它是假定的呼吸肌肉活动的增加可能诱发upregulation当地的促炎细胞因子在慢性阻塞性肺病,而后者可能导致呼吸道肌肉无力的发病机理。或者(或者配套),这些细胞因子的表达可能在自适应机制中发挥作用,与这样的肌肉功能障碍共存。在这两种情况下,局部细胞因子的表达也可能差异以前观察到的表型和功能不同的肌肉群在慢性阻塞性肺病8- - - - - -10。因此,本研究的目的是描述一个典型的胸呼吸肌肉的细胞因子表达谱(外肋间)在慢性阻塞性肺病患者。
方法
主题
总共25个临床稳定的慢性阻塞性肺病患者和8名健康受试者年龄相仿的是包含在目前的研究中。而患者连续招募从目前作者的门诊诊所,健康的对照组与跨国研究旨在描述健康老龄化对肌肉的影响表型的老年人在欧洲(PanEuropean老化肌肉网络项目)。所有慢性阻塞性肺病患者曾经抽过烟(47±13 pack-yrs;意味着时期自由吸烟的9岁),而对照组的曾经吸烟者。为了排除与性有关的影响,和慢性阻塞性肺病的基础上性别分布在西班牙,只有男性患者包括在内。慢性阻塞性肺疾病的控制全球倡议标准被用来定义慢性阻塞性肺病11稳定,而被定义为没有恶化之前3个月的研究期间条目。受试者患有慢性呼吸衰竭、代谢疾病,心血管疾病,伴随呼吸系统疾病或治疗用药物已知修改肌肉结构和功能被排除在外。这项研究的目的是根据世界医学协会指南研究人类12制度伦理委员会批准。从所有个人书面知情同意了。
功能评估
肺和呼吸道肌肉功能使用传统的技术评估。短暂,强迫与支气管扩张剂反应肺量测定法(Datospir 92;扶桑、巴塞罗那,西班牙),以及胸廓内的气体体积,气道阻力和肺的一氧化碳扩散能力(Masterlab;Jaeger、维尔茨堡、德国)在每个测量。从桡动脉获得血液样本的非惯用的手臂和血液气体压力是由传统的极谱测定技术(RapidLab 860;拜耳医疗保健,英国纽伯里)。呼吸肌肉的强度是决定通过测量最大呼吸压力迫使期间生成的嘴吸气(MIP)和呼气的努力对一个堵塞气道执行剩余容积(RV)和肺活量(TLC),分别。引用值是那些适合地中海的人口13- - - - - -16。吸气肌肉抵抗依次在两个不同的阈值吸气测试评估17。首先是增量测试,病人和志愿者呼吸对进步的负载(∼8而言不啻2O (0.78 kPa)每2分钟),直到最大吸气可持续阈值压力(Pth,马克斯)了。这被认为是一个混合的结果方面的耐力和力量组件。在第二个测试中,受试者轻快呼吸对高频的恒定负载(80%的Pth,马克斯),直到精疲力竭。运行的时期被定义为持续时间,这被认为是更具体反映肌肉抵抗。
活组织检查
外肋间肌肉样本取自前腋窝线在第六肋间隙,如前所述17。
RNA分离、逆转录和实时PCR
总RNA提取使用试剂盒从骨骼肌试剂(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA)。量化后的总RNA, 1μg反向转录使用益生元(dT)12 - 18底漆和上标II逆转录酶(英杰公司生命技术)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了在一个GeneAmp®PCR系统2400(美国珀金埃尔默,里士满,CA),和一个整除用于实时PCR扩增。这是执行ABI棱镜7900 ht序列检测器(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。开发TaqMan®分析被用来量化记录不同的细胞因子(TNF-αIL-1β6和-10年),以及整合素CD18 (Assays-on-DemandTM基因表达产品;应用生物系统公司),一个全球性的白细胞的标志。β-Actin基因作为内生控制(管家)。为研究基因探针上下文出现在表1⇓。TaqMan®MGB探针标记的5′末端与记者染料分子6-carboxy-fluorescein和3′端nonfluorescent冷却器。
总是化验样品一式三份,平均价值被(intra-assay变异系数0.3 -3.3%)。PCR混合物是孵化为AmpErase 2分钟50°CTM尿嘧啶-N-glycosylase-mediated去污,紧随其后的是10分钟在95°C激活AmpliTaq黄金TMDNA聚合酶。随后,总共50周期进行;这些包括变性步骤15 s在95°C和联合annealing-extension一步1分钟60°C。数据分析与序列检测器的软件。标准化的目标基因与一个外部引用(即。cDNA使用在每一个试验)。相对拷贝数是根据比较阈值来计算周期的方法18。
蛋白质水平
细胞因子内容ELISA测定使用商业套装包括执行人类TNF-α单克隆抗体,IL-1β,6到-10年,根据制造商的推荐标准程序的指令(Amersham淀粉微球生物科技有限公司Amersham,英国)。简而言之,200µL的样本被添加到每个1:0.35最终稀释。微型板块是在室温下培养3 h,随后洗6次400µL适当的缓冲。然后,200年µL细胞因子抗体被添加到每个在室温下和孵化2 h。洗是重复和50µL衬底的解决方案添加到每个在室温下和孵化1 h。立即增加了50µL放大器解决方案,混合物在室温下再次孵化30分钟。过程是停止使用一个特定的解决方案和吸光度的测定(Multiskan女士读者;Labsystems,万塔、芬兰)。
Sarcolemmal损害
肌肉部分与单克隆抗体染色白蛋白(研究诊断公司,弗兰德斯,新泽西,美国)和绑定的视觉使用biotin-streptoaviodin-peroxidase技术(AB600 IC019;结合位点,伯明翰,英国),开发3、3′-diaminobenzidine (D5337;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。组织是在光学显微镜下观察和图像数字化(Pixera Studio 1.2,视觉传达系统;美国CA Pixera公司,洛斯盖多斯)。纤维显示immunopositivity intrafibrillar白蛋白的识别和确定阳性细胞的百分比。在每种情况下,≥100纤维是由两个独立的评估和训练有素的观察员。这些观察人士盲目对样本识别。的边缘部分,以及文物的地区,被排除在分析之外。
统计分析
数据表示为±sd。每个变量的分布的常态是评估使用Kolmogorov-Smirnov测试,并使用未配对t差异进行了分析。不同变量之间的关系进行评估使用皮尔逊相关系数。相关分析,COPD组和(事后分析)子群与一个非常严重的疾病(在一秒用力呼气量(FEV1)< 30%)。分析潜在的肺功能之间的相互作用,呼吸肌肉功能,sarcolemmal损伤,白细胞标记和细胞因子表达式使用多元回归分析评估。意义被接受在p < 0.05。
结果
比较慢性阻塞性肺病和控制
将军和人体测量特征、肺和肌肉功能患者和对照组中的数据,如表2所示⇓。组年龄和身体质量指数的平均值是相同的COPD患者和对照组之间。而中度和重度COPD组显示阻塞性通气的缺陷,提出健康对照组肺功能正常。吸气肌肉力量和耐力在慢性阻塞性肺病显著降低对健康受试者。
TNF-α和il - 6的水平mrna发现外部肋间肌肉的慢性阻塞性肺病患者明显高于那些在健康对照组(p < 0.001, p < 0.01,分别;图1一个⇓)。il - 1 mRNA水平显示出类似的行为,尽管差异没有达到统计学意义(p = 0.09)。最后,没有观察到的差异之间的信使rna的检测不到发炎的迹象细胞因子il - 10水平慢性阻塞性肺病和控制。
蛋白质含量不同的促炎细胞因子显示出类似的行为他们的同名的信使rna。更准确地说,慢性阻塞性肺病患者显示TNF-α和IL-1β蛋白质水平显著高于控制(p < 0.001和p < 0.05),与il - 6展示一个强大的趋势方向相同(图1 b⇑)。Sarcolemmal损害依次显示出强烈的倾向在慢性阻塞性肺病患者(p = 0.06;图2⇓),而未发现显著差异的白细胞(成绩单integrin-β标志2亚基CD18)19。
之间的相关性肺和呼吸道肌肉功能
在呼吸肌肉功能障碍相关与气道阻塞(FEV的水平1与MIP (r = 0.436, p < 0.05)或Pth,马克斯(r = 0.457, p < 0.01),肺恶性通货膨胀(RV / TLC MIP;r = -0.479, p < 0.01)。
Intertranscript相关性
TNF-αmRNA的水平与IL-1βmRNA的浓度呈正相关(r = 0.567, p = 0.001)。这种关系被认为是保持不变的只有COPD患者(r = 0.565, p < 0.01)。白细胞之间没有发现显著的关联标记和细胞因子水平。
信使rna和蛋白质含量之间的相关性
这些关系振荡适度,r- - - - - -值从0.484的TNF-α(p < 0.01),至0.583的il - 6 (p < 0.001)。
转录水平和肺功能之间的相关性
细胞因子基因表达之间无显著相关性被发现的任何营养和COPD患者的肺功能参数。
信使rna水平之间的相关性和呼吸肌肉功能
TNF-α成绩单显示成反比关系Pth,马克斯(r = -0.433, p < 0.05),慢性阻塞性肺病患者。这种关系甚至更强(r = -0.666, p < 0.05),当只患有非常严重的疾病(FEV1< 30%)进行分析(事后分析);此外,多元回归分析,包括肺容积(RV / TLC)代表TNF-α记录的水平,显著提高预测的准确性Pth,马克斯在这个人口(r = 0.743, p < 0.01)。
最后,sarcolemmal损害不与细胞因子基因表达或功能变量。
讨论
本研究的主要发现是upregulation TNF-α和il - 6基因表达观察外肋间肌肉的慢性阻塞性肺病患者,连同IL-1β所示类似的趋势。蛋白质含量的模式类似。此外,反比关系被发现之间的呼吸肌肉功能和本地肌肉TNF-α在慢性阻塞性肺病患者的记录。
在慢性阻塞性肺病呼吸肌肉功能障碍通常观察到,被认为是不同的有害因素的组合的结果2- - - - - -4。一些特定于这些肌肉,如胸腔的变化发生在几何由于肺恶性通货膨胀。人一般,因此可以通过呼吸道和共享外围肌肉:系统性炎症、药物和营养异常,等等。然而,分子机制发生在不同的肌肉不太理解。虽然隔膜的主要呼吸肌肉静止,其他肌肉,如外部肋间的和胸骨旁的,也积极参与通风20.。此外,肋间肌肉逐渐发挥更重要作用时增加通风的要求21,22。
最近的报告表明,细胞能合成多种细胞因子5,作为监管者的骨骼肌功能和结构通过一个自分泌/旁分泌机制23。此外,在最近的一次和重要论文,Vassilakopouloset al。6表明增加通气负荷诱发不同细胞因子的upregulation通气肌肉的老鼠。基于这些观察,提出,当地的促炎细胞因子的表达在慢性阻塞性肺病患者的肋间肌肉调节,和这upregulation可能导致呼吸道肌肉无力的发展。尽管增强相应的基因表达式已经被目前的研究证实,显著的相关性与这些变量反映肌肉功能只发现TNF-α成绩单。TNF-α一直与肌肉分解代谢在不同的疾病有关,包括慢性阻塞性肺病24。此外,人们通常认为肌肉的减少的主要因素之一是通用在这种患者肌无力2。先前的研究表明,肌肉功能可能受到慢性海拔TNF-α传播通过氧化应激的发展25这一现象最近报道,在慢性阻塞性肺病患者的呼吸肌肉26。除了系统性TNF-α在肌肉的作用,目前的研究还表明,当地表达的细胞因子可能参与呼吸肌肉功能障碍,但可能在多因子的场景的背景下(多元回归分析所显示)。然而,目前的研究应采取谨慎,因为他们不能证明因果关系。进一步的研究应该旨在解决这一点。
在目前的研究中,慢性阻塞性肺病患者还显示il - 6基因表达的upregulation肋间肌。此外,这个upregulation气道阻塞的程度有关。最近的研究表明,il - 6表达是肌肉收缩引起的27,28。自吸气肌肉的慢性阻塞性肺病患者面临增加的工作量,现在发现可能被解释为这些高收缩要求的适应性反应。
第三个促炎细胞因子包括在这项研究中,il - 1,被认为是一个异化的实质,类似于TNF-α,已被证明能够通过氧化应激的存在引起收缩功能障碍29日。在目前的研究中,统计学意义接壤IL-1β成绩单的增加,但相应的蛋白质明显增强。此外,强烈正相关检测il - 1水平之间的信使rna和TNF-α。这些结果表明这两种细胞因子之间的协同作用的存在,这将提供一个机制来增加炎症反应在慢性阻塞性肺病患者的呼吸肌肉。
当地TNF-α和其他促炎细胞因子的表达一直在报道之前人类运动的肌肉5,30.和似乎相关部分肌肉活动的水平。然而,肺功能之间没有显著的相关性和局部细胞因子表达在慢性阻塞性肺病病人参与本研究不支持这个因素重要的监管作用,至少在肋间肌肉。
另一个因素可能促炎细胞因子的表达变化的部分原因是纤维损伤,因为这些物质发挥着重要的作用在调节肌肉再生和愈合31日。符合这一点,吸气加载被报道与呼吸道肌肉损伤有关32和随后的改造33。在目前的研究中,促炎细胞因子upregulation与明显倾向于显示更高水平的sarcolemmal损伤肌肉的慢性阻塞性肺病患者。再次,尽管其中的因果关系不能从当前数据,推断作者大胆推测,可能结果之间存在联系。然而,很明显,进一步的研究需要确定的因素会导致局部细胞因子的过度表达观察肋间肌肉在目前的研究中。
该研究的潜在限制
的可能性获得有效样本的主要呼吸肌肉,隔膜,从人类在活的有机体内是非常有限的,由于需要侵入性手术和潜在的偏见来自内在的疾病。相比之下,外肋间肌肉,其主要功能是协助灵感当隔膜的功能恶化或不足以应付目前的工作量,更加容易理解17。此外,本研究中使用的模型允许的可能性仔细选择病人和控制,避免疾病所带来的问题。
本研究的第二个限制是它被执行只有在男性患者。然而,慢性阻塞性肺病的性别分布仍明显偏向男性在当下的环境。男女混合在一个通用集团的替代与净优势男性被丢弃,自调节机制和调节肌肉表型非常容易受到性。
第三本研究的相对限制是方法论的性质,因为使用的生物技术定量而不是地形。换句话说,他们允许精确量化的细胞因子的水平,但不能确定他们的细胞来源。肌肉活检,除了细胞,可能包含炎症和上皮细胞,也可能是一种细胞因子的来源。然而,缺乏差异CD18 (panleukocyte表面标记)慢性阻塞性肺病和控制之间的记录表明,炎症细胞群在前并未增加。这是符合Gosker公布的数据et al。34,他们无法找到增加炎症细胞在慢性阻塞性肺病的骨骼肌。此外,缺乏关系mRNA TNF-α或il - 6和CD18的内容在目前的这些细胞因子的研究表明upregulation不可能占常驻巨噬细胞和白细胞渗透肋间肌肉的慢性阻塞性肺病患者。此外,以往的研究使用原位杂交和免疫组织化学技术已经证明,纤维的主要来源不同的促炎细胞因子在肌肉5。
总之,目前的研究表明不同的促炎细胞因子基因调节外肋间肌肉的慢性阻塞性肺疾病患者。此外,发现了一些证据来支持这个假设,当地表达肿瘤坏死factor-α可能发挥作用在呼吸道肌肉功能障碍。
确认
作者要感谢r·马歇尔援助与编辑,和罗伊a . n .太阳系(医院德尔,巴塞罗那,西班牙)为他们的宝贵的技术支持。
脚注
社论评论见605页。
- 收到了2005年12月26日。
- 接受2007年6月22日。
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